Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定.doc

Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定【摘要】目的：构建Cdh1小干扰RNA载体，并将其转染至Hela细胞进行鉴定.方法：根据pENTRTM/H1/TO中间载体要求，设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列，合成相应的DNA单链，退火后连接到pENTRTM/H1/TO线性载体，形成完整载体，进行测序鉴定.分别将测序鉴定成功的Cdh1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染Hela细胞，转染后48h提取细胞总RNA及细胞总蛋白，采用实时定量PCR和WesternBlot检测Cdh1的表达.结果：经测序鉴定成功构建Cdh1小干扰RNA载体和对照载体，分别命名为pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol.与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比，转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达降低（P<；0.05）.结论：成功构建Cdh1小干扰RNA载体，并能下调Hela细胞Cdh1的表达.【关键词】细胞周期细胞分裂RNA小干扰Hela细胞0引言Cdh1是细胞周期后期分裂促进复合物（anaphasepromotingcomplex，APC）的一个调节亚基，在细胞周期调控中发挥着重要作用.近年来研究发现，Cdh1APC在哺乳动物神经元中有大量表达，具有调节轴突生长和突触形成的功能，其在中枢神经系统疾病的发生发展中起重要作用1.为了进一步探讨Cdh1的功能，我们拟构建Cdh1小干扰RNA载体，并将其转染至Hela细胞进行鉴定.1材料和方法1.1材料pENTRTM/H1/TO载体试剂盒、TOP10感受态细菌和脂质体Lipofectamine2000均购自Invitrogen公司（美国）；DMEM/F12培养基、小牛血清购自Gibco公司（美国）；实时定量PCR试剂盒购自Takara公司（日本）；LightCycler实时荧光定量PCR仪为Roche公司（美国）.1.2方法1.2.1载体的构建根据pENTRTM/H1/TO载体要求和参考文献2设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列，合成相应的DNA单链，具体设计如下:干扰序列topstrand5CACCAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGCGAACTGACTGGGAGACTTCTCA3,bottomstrand5AAAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGTTCGCTGACTGGGAGACTTCTCATT3；对照序列topstrand5CACCAAGAATGTCATCTACCACGGGCGAACCCGTGGTAGATGACATTC3,bottomstrand5AAAAGAATGTCATCTACCACGGGTTCGCCCGTGGTAGATGACATTCTT3.将干扰序列和对照序列根据退火条件95退火4min，室温自然冷却510min得到退火产物，用T4DNA连接酶连接到pENTRTM/H1/TO线性载体上，16连接2h，连接产物转化TOP10感受态细菌，平铺入含卡那霉素（50mg/L）抗性平板中过夜培养，挑取单菌落扩增培养.提取质粒后，由英骏生物技术有限公司进行DNA测序鉴定.质粒分别命名为pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol.1.2.2细胞转染采用脂质体转染法将pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol质粒分别转染Hela细胞，转染前1d将Hela细胞传代至六孔板，密度为90左右，在2个Eppendorf管中均加入250LOPTIMEM培养基，然后分别加入10L脂质体和4g质粒混匀，室温下孵育5min.轻柔混合两管液体，37孵育20min，加入Hela细胞中，将细胞置于37,50mL/LCO2培养箱中转染4h后换成含有100mL/L小牛血清的DMEM/F12培养基.转染后48h，提取细胞总mRNA，逆转录成cDNA.1.2.3实时定量PCR检测Cdh1的表达以逆转录产物为模板进行实时定量PCR反应，以actin基因为内参照，94变性5s，60退火及延伸20s，共反应40个循环，分析融解曲线.Cdh1基因上游引物为5GCCAACTGGAGCGTGAACTT3，下游引物为5TTCAGCAGTGCGGAGTAGGC3.actin基因上游引物为5TGACAGGATGCAGAAGGAGA3，下游引物为5TAGAGCCACCAATCCACACA3.以Ct表示Cdh1的表达，Ct=Ct（Cdh1）-Ct（actin），Ct值越高，Cdh1的表达越低WesternBlot检测Cdh1的表达分别提取转pENTR/shcdh1,pENTR/shcontrol及未转染的Hela细胞总蛋白，以actin为内参照，取等量的蛋白质经聚丙稀酰胺凝胶电泳后，转至硝酸纤维素膜上,用50g/L脱脂奶粉封闭1h，加10mg/L抗Cdh1mAb或抗actinmAb，室温孵育1h，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，漂洗后二氨基联苯胺显色23min，水洗后照相.统计学处理:采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以xs表示，采用方差分析，P<；0.05为差异有统计学意义.2结果2.1载体的构建经测序公司鉴定后构建的质粒pENTR/shcdh1和pENTR/shcontrol，序列完全正确，无碱基突变.2.2实时定量PCR检测Hela细胞Cdh1的表达融解曲线分析表明设计的引物均得到了特异性的产物，与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比，转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达明显降低（P<；0.05,表1）.表1实时定量PCR检测Hela细胞中Cdh1的表达（略）2.3WesternBlot检测Cdh1蛋白的表达与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比，转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1蛋白表达水平明显降低(图1).3讨论细胞周期分裂后期促进复合物及其调节亚基Cdh1不仅在增殖细胞中起重要作用，研究发现其在哺乳动物大脑皮质、海马、小脑等部位的终分化神经元核内有大量的表达，且具有泛素化周期蛋白B的活性，泛素化其他的底物，发挥其潜在作用4.研究表明在不同类型的神经元，Cdh1APC的表达降低引起的结果可能也不一样.在胚胎鼠皮质神经元，降低Cdh1APC的表达，周期蛋白B表达升高，使细胞异常地重新进入细胞周期，引起神经元的凋亡5；而在新生鼠小脑颗粒神经元，抑制Cdh1APC的表达及活性，发现神经元仍可存活，且轴突增长1.RNA干扰技术是指生物体内导入短的双链RNA(dsRNA)后使体内同源基因特异性的沉默.siRNA的来源有多种，如化学合成、体外转录合成及利用质粒或病毒载体表达siRNA.2002年，Brummelkamp等6首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA（smallhairpinRNA，shRNA）表达载体pSUPER，并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达.在体内表达的shRNA与dsRNA很接近，它包含了两个由一个小环序列分离的短反向重复序列，是由Pol启动子控制的.此方法可以长期抑制目的基因表达，因此,本课题选择载体构建的方法来实现基因下调.实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，该技术已被广泛应用于检测细胞mRNA表达量的变化、比较不同组织的mRNA表达差异等.本研究我们通过脂质体法将构建成功的载体转染至Hela细胞中，结果显示转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达明显降低，说明该载体具有基因下调作用.【参考文献】1KonishiY,StegmullerJ,MatsudaT,etal.Cdh1APCcontrolsaxonalgrowthandpatterninginthemammalianbrainJ.Science,2004,303（5660）:1026-1030.2BashirT,DorrelloNV,AmadorV,etal.ControloftheSCF(Skp2Cks1)ubiquitinligasebytheAPC/C(Cdh1)ubiquitinligaseJ.Nature,2004,428（6979）:190-193.3LivakKJ,SchmittgenTD.AnalysisofrelativegeneexpressiondatausingrealtimequantitativePCRandthe2(DeltaDeltaC(T)methodJ.Methods,2001,25(4):402-408.4GieffersC,PetersBH,KramerER,etal.ExpressionoftheCDH1associatedformoftheanaphasepromotingcomplexinpostmitoticneuronsJ.ProcNatlAcadSciUSA,1999,96（20）:11317-11322.5AlmeidaA,BolanosJ.P,MorenoS,etal.Cdh1/Hct1APCisessential