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Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定.docCdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定.doc

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Cdh1小干扰RNA载体的构建及鉴定【摘要】目的:构建Cdh1小干扰RNA载体,并将其转染至Hela细胞进行鉴定.方法:根据pENTRTM/H1/TO中间载体要求,设计Cdh1小干扰RNA载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列,合成相应的DNA单链,退火后连接到pENTRTM/H1/TO线性载体,形成完整载体,进行测序鉴定.分别将测序鉴定成功的Cdh1小干扰RNA载体及对照载体采用脂质体法转染Hela细胞,转染后48h提取细胞总RNA及细胞总蛋白,采用实时定量PCR和WesternBlot检测Cdh1的表达.结果:经测序鉴定成功构建Cdh1小干扰RNA载体和对照载体,分别命名为pENTR/shCdh1和pENTR/shcontrol.与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比,转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1表达降低(Plt;0.05,表1).表1实时定量PCR检测Hela细胞中Cdh1的表达(略)2.3WesternBlot检测Cdh1蛋白的表达与未转染及转染pENTR/shcontrol的Hela细胞相比,转染pENTR/shCdh1的Hela细胞Cdh1蛋白表达水平明显降低(图1).3讨论细胞周期分裂后期促进复合物及其调节亚基Cdh1不仅在增殖细胞中起重要作用,研究发现其在哺乳动物大脑皮质、海马、小脑等部位的终分化神经元核内有大量的表达,且具有泛素化周期蛋白B的活性,泛素化其他的底物,发挥其潜在作用[4].研究表明在不同类型的神经元,Cdh1APC的表达降低引起的结果可能也不一样.在胚胎鼠皮质神经元,降低Cdh1APC的表达,周期蛋白B表达升高,使细胞异常地重新进入细胞周期,引起神经元的凋亡[5];而在新生鼠小脑颗粒神经元,抑制Cdh1APC的表达及活性,发现神经元仍可存活,且轴突增长[1].RNA干扰技术是指生物体内导入短的双链RNA(dsRNA)后使体内同源基因特异性的沉默.siRNA的来源有多种,如化学合成、体外转录合成及利用质粒或病毒载体表达siRNA.2002年,Brummelkamp等[6]首次使用小鼠H1启动子构建了小发卡RNA(smallhairpinRNA,shRNA)表达载体pSUPER,并证实转染该载体可有效、特异性地剔除哺乳动物细胞内目的基因的表达.在体内表达的shRNA与dsRNA很接近,它包含了两
编号:201312182203144045    类型:共享资源    大小:29.00KB    格式:DOC    上传时间:2013-12-18
  
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