RT┐PCR分析肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素mRNA的表达.doc

RTPCR分析肉芽组织生长过程中VEGF及3整合素mRNA的表达作者：张聚良王岭晋援朝黄庆生金卫林【关键词】逆转录-PCR关键词:逆转录-PCR；新生血管化，病理性；内皮生长因子；结合素类摘要:目的观察血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）及3整合素mRNA在肉芽组织血管生成中表达的动态变化.方法采用RT-PCR法定量分析人正常皮下组织、增殖期肉芽组织（伤后712d）及成熟期肉芽组织（伤后3035d）VEGF及3整合素mRNA的水平.结果在正常皮下组织中，VEGF及3整合素mRNA呈低表达，而在增殖期肉芽组织中表达升高，待肉芽组织完全成熟后二者的表达又有所降低.结论VEGF及3整合素mRNA的水平与肉芽组织的血管生长过程呈动态相关，提示两种蛋白质可能在肉芽组织血管生成中发挥调节作用.Keywords:reversetranscriptionPCR；neovascularization，pathologic；endothelialgrowthfactors；integrinsAbstract:AIMToobservethedynamicchangesintheex-pressionofvascularendothelialgrowthfactor（VEGF）andintegrin3mRNAduringtheangiogeneticprocessofgranula-tiontissue.METHODSVEGFandintegrin3mRNAinhumannormalsubcutaneoustissue，proliferativegranulationtissue（712dayspost-injured）andmaturegranulationtis-sue（3035dayspost-injured）werequantitativelyanalyzedwithRT-PCR.RESULTSInnormalsubcutaneoustissue，VEGFandintegrin3mRNAwereexpressedlowwhileinproliferativegranulationtissuetheywereup-regulated.Whengranulationtissuewasmaturecompletely，theexpres-sionofVEGFandintegrin3declinedagain.CONCLUSIONThelevelsofVEGFandintegrin3mRNAarerelatedtothegrowthofvesselsingranulationtissue，whichsuggeststhatthesetwoproteinsmayplayanimportantroleinregulat-ingtheangiogeneticprocessofgranulationtissue.0引言血管生成指在已有血管床基础上长出新的毛细血管的过程，包括血管内皮细胞的激活，细胞外基质的降解，内皮细胞的增殖、移行，管腔结构形成及血管外膜的形成，然而迄今为止确切的机制尚不清楚.已有研究表明，许多病理过程如肿瘤的生长及转移、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎等，都与血管生成密切相关1.生理状态下，血管生成仅存在于胚胎发育、创伤愈合及女性生殖周期中，与病理性血管生成不同，这些过程中血管的生长受到严格调控，包括了增殖、成熟、退化三个阶段，反映了血管生成的全过程.然而，对这些过程中血管生成的研究却很少.生长因子和粘附分子作为血管生成的重要调节分子，越来越受到人们的重视，其中血管内皮生长因子（vas-cularendothelialgrowthfactor，VEGF）和3整合素是近年研究的热点.本实验旨在观察肉芽组织生长过程中VEGF及3整合素mRNA的表达，揭示它们与生理性血管生成的关系.1材料和方法1.1材料肉芽组织标本均取自我院门诊换药室患者，4例为皮肤撕脱伤，1例为狗咬伤，患者年龄2030岁，排除糖尿病等影响伤口愈合的疾患，分别于伤后712d和3035d取创面组织.正常皮下组织取自我院手术患者.1.2试剂及仪器异硫氰酸胍、Sarcosyl，AMV逆转录酶、Taq酶、dNTP，RNAsin分别购自原平生物公司和Promga公司；DNATHERMALCYCLER480，美国PE公司；GDS凝胶成像系统，美国UVP公司.1.3RTPCR1.3.1引物设计按文献报道2，3，VEGF上游引物序列:5-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3，下游引物序列:5-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3，PCR产物为567bp，495bp和363bp，3整合素上游引物序列:5-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3，下游引物序列:5-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT-3，PCR产物为285bp.1.3.2总RNA提取及定量所取组织用Chom-czynski改良一步法提取总RNA，通过测定A260值计算RNA浓度，A260/A280判定纯度.1.3.3RT-PCR反应各组织总RNA均取1g（10L），加25mol・；L-1逆转录引物（下游引物）1L，7010min后立刻冰浴，加入下列成分:DW5L，5xRT缓冲液5L，10mmol・；L-1dNTP各1L，RNasin0.5L（25U），AMV1L（5U），42逆转录1h，945min，冰浴5min.各取RT产物10L，进行PCR扩增，反应条件同于常规PCR，循环温度为:941min，551min，722min，循环数分别采用15，20，25和30，根据结果选择合适循环数，避免PCR反应平台期，最终确定为25个循环，0.2g・；L-1琼脂糖凝胶观察结果.1.3.4荧光分析琼脂糖凝胶电泳结束后，在UVP凝胶成像系统上摄像，并用相应软件通过对条带大小及深浅的差别分别对不同组织RT-PCR扩增产物进行定量分析，结果采用完全随机化设计资料均数的t检验进行统计分析.2结果VEGF有多种不同的mRNA拼接产物，本实验选用引物可扩增出VEGF121（363bp），VEGF165（495bp）和VEGF189（567bp）3种形式.电泳结果表明，VEGF可见3条扩增带，大小同预期设计一致（Fig1）3整合素PCR产物为265bp，电泳显示300bp附近可见明显扩增带，与预期一致（Fig2）由电泳结果可以看出，正常皮下组织中VEGF及3整合素mR-NA水平极低，在增殖期肉芽组织中表达明显升高，在成熟期肉芽组织中表达又降低，而且，在VEGF的3种不同拼接产物中，VEGF165表达最高.图像分析定量的结果表明，在增殖期肉芽组织中，VEGF及3整合素mRNA水平高于成熟期肉芽组织（P<；0.05）及正常皮下组织（P<；0.01，Tab1）.图1图2略3讨论VEGF是近年发现的可以特异性作用于血管内皮细胞（EC）的生长因子.体外实验证明VEGF可以直接促进EC的增殖，还可以通过提高已有血管的通透性，使血浆蛋白渗入基质，利于EC的移行，间接促进血管生成4.3整合素属粘附分子家族成员，可与IIb或V亚基结合，其中V3分子在血管生成中的作用备受关注，表达于细胞膜表面，识别细胞外基质的RGD序列，对于EC的移行有重要意义5.本实验表明，正常皮下组织中没有血管生成的存在，VEGF及3整合素mRNA的表达很低；在肉芽组织增殖期，HE切片证明EC在局部聚集成团，胞质增多，增殖明显，增殖的EC借助与细胞外基质的结合移行形成大量新生血管芽，此时VEGF及3整合素水平明显增高，待肉芽组织完全成熟后，新生血管逐渐成熟退化，二者的表达也随之下降，表明VEGF及3整合素可能是血管生成重要的始动分子，对于维持血管生成也有重要作用；同时也提示它们可以作为临床血管生成治疗的“靶分子”.VEGF及3整合素受控表达的机制尚不清楚，缺氧及某些炎症因子可能参与其中的调节6，7.表1不同组织中VEGF及3整合素mRNA表达水平的定量分析结果略RT-PCR适于用Northernblot检测不到的低丰度RNA.实验证明，同一循环体系下，模板量在一定浓度范围内时，PCR产物条带强度与模板量成比例关系；当循环次数处于PCR扩增的对数增长期时，PCR产物的荧光强度同模板量亦成比例关系8，因此用RT-PCR定量分析mRNA的关键是严格优化实验条件，如模板量及循环次数的控制等，本实验重复几次结果一致.参考文献:1FolkmanJ.Angiogenesisincancer，vascular，rheumatoidandotherdiseaseJ.NatureMed，1995；1（1）:27-37.2TischerE，MitchellR，HartmanT，SilvaM，GospodarowiczD，FiddesJC，AbrahamJA.Thehumangeneforvascularendothe-lialgrowthfactor.MultipleproteinformsareencodedthroughalternativeexonsplicingJ.JBiolChem，1991；266（18）:11947-11954.3FigzgeraldLA，SleinerB，RallSC，LoSS，PhillipsDR.ProteinsequenceofendothelialglycoproteinderivedfromacDNAclone:Identifywithplateletglycoproteinandsimilarityto“inte-grin”J.JBiolChem，1987；262（9）:3936-3939.4AuerbachR，AuerbachW，PolakowskiI.Assaysforangiogene-sis:AreviewreviewJ.PharmacolTher，1991；51（1）:1-11.5AugustinHG，BraunK，TelemenakisI，ModlichU，KuhnW.Ovarianangiogenesis:Phenotypiccharacterizationofendothelialcellsinaphysiologicalmodelofbloodvesselgrowthandregres-sionJ.AmJPathol，1995；147（2）:339-351.6DvorakHF，BrownLF，DetmarM，DvorakAM.Vascularper-meabilityfactor/vascularendothelialgrowthfactor，microvas-cularhyperpermeability，andangiognesisrevie