白色念珠菌细胞壁β-葡聚糖升白细胞药效学作用的研究.doc

白色念珠菌细胞壁-葡聚糖升白细胞药效学作用的研究【摘要】目的研究白色念珠菌（CandidaAlbicans）细胞壁不同溶解性的-葡聚糖（-glucan）对环磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致小鼠外周血白细胞减少的回升作用。方法采用CTX所致的小鼠外周血白细胞减少模型，研究白色念珠菌细胞壁-葡聚糖对小鼠外周血白细胞数的影响。结果三种溶解性的白色念珠菌细胞壁-葡聚糖均能升高小鼠外周血白细胞、中性粒细胞和单核细胞数。各组小鼠脾脏指数增加，脾脏、骨髓巨核细胞系增生。不溶性的-葡聚糖作用更明显。结论白色念珠菌-葡聚糖尤其是不溶性-葡聚糖对CTX所致的白细胞减少有回升作用，是一种很有前途的免疫调节剂。【关键词】白色念珠菌；-葡聚糖；生物学活性；提取分析；免疫药理作用【Abstract】ObjectiveTostudythepharmacologicaleffectofthebasic-glucan，acidic-glucanandinsoluble-glucanextractsofCandidaalbicansontheleukocytopoiesis-promotingintheleukopeniamice.MethodsMiceofeachgroupexcepttheuntreatedcontrolgroupwereadministeredcyclophosphamideintraperitoneally100mg/(kgd)forthreedaystodevelopleucopenia.TheexperimentalgroupwereadministeredthreekindsofCandidaalbicans-glucanintravenouslyforsixdaysseparately.TheperipherialleukocytesofallmicewerecountedbeforetreatedCTX，and1，3，5，7daysaftertreatedCTX.ResultsThreekindsofCandidaalbicans-glucancanincreasethenumbersofleukocytes，neutrophilicgranulocytesandmonocytesintheperipheralblood.Thespleenindexineachgroupanimalareincreased，andmegakaryocytesareincreasedinspleenandmarrow.ConclusionCandidaalbicans-glucanspeciallyinsoluble-glucansisakindofimmunomodulatorwhichcanincreasethenumbersofleukocytesintheperipheralblood.【Keywords】-glucan；Candidaalbicans；leukocyte；immunomodulator-葡聚糖（-glucan）是白色念珠菌细胞壁中含量最高的多糖。作为一类条件致病真菌多糖，白色念珠菌-葡聚糖有着多种生物学活性和免疫药理学作用，在抗炎、抗肿瘤、刺激造血等方面都有很高的药效学作用1，但有关不同性质的白色念珠菌-葡聚糖升白细胞作用的研究甚少。本研究制备三种溶解性的-葡聚糖，观察其对环磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致的小鼠外周血白细胞减少的回升作用，为进一步确证白色念珠菌-葡聚糖刺激造血系统使白细胞升高的作用机制，和进一步研究白色念珠菌-葡聚糖有效成分或有效因子，为确立药物质量控制标准和量效关系提供理论依据。1材料与方法1.1动物与试剂昆明种小白鼠，46周龄，体重202g，昆明医学院动物科（云南省实验质量合格证0000481号）。沙氏液体培养基（Sabouraudsdextroseagar）：蛋白胨10g、葡萄糖40g、溶于1000ml蒸馏水，高压灭菌后备用；淀粉酶：分子量9600，酶活力：50/mg（上海伯奥生物科技有限公司）；白色念珠菌碱溶性-葡聚糖（Candidaalbicansbasic-glucan，CABBG）、酸溶性-葡聚糖（Candidaalbicansacidic-glucan，CAABG)和不溶性-葡聚糖（Candidaalbicansinsoluble-glucan，CAIBG）：均按文献方法制备2。1.2仪器LRH-250Z型震荡培养箱（广东医疗器械厂）；81-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）。1.3白念珠菌的培养和三种白色念珠菌-葡聚糖的制备取少量保存于密封无菌容器中的纯白色念珠菌菌落，接种于沙氏液体培养基，接种后37恒温摇床160次/min震荡培养67天，3000rpm离心30min，收集菌体，冷冻保存。提取葡聚糖的流程，见图1。1.4小鼠白细胞减少模型的建立除空白对照组外，各组小鼠腹腔注射CTX100mg/(kgd)，连续3天，建立小鼠外周血白细胞减少模型。1.5确定三组-葡聚糖的给药剂量参照急性毒性实验摸索LD50值，各组给药剂量最后如表1。1.6统计学处理急性毒性学实验结果采用Bliss法计算LD50值。药效学实验采用SPSS11.5统计软件进行数据处理分析，所有指标均以均数标准差（xs）表示，组间比较采用方差分析，以P0.05为差异有显著性。图1从白色念珠菌提取CABBG、CAABG、CAIBG的流程示意图Table1Dosedesignofexperiment2结果2.1急性毒性学实验通过急性毒性实验得到LD50值分别为：CABBG36.8937mg/kg，CAABG89.23549mg/kg，CAIBG767.7753mg/kg；95%可信区间分别为CABBG组32.005242.5289mg/kg，CAABG组76.7182103.8025mg/kg，CAIBG组663.748888.106mg/kg。各实验组小鼠肉眼观察，除肝脏增大外未见明显变化，病理HE切片显示肝细胞有不同程度的肿胀和空泡变。2.2外周血白细胞变化实验第5、7、9天CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠外周血白细胞数、中性粒细胞数、单核细胞数均显著增高，其中第7天、第9天，CAIBG组白细胞数、单核细胞数较阳性对照组rhG-CSF升高，差异有显著性。Table2Numbersofleukocyteofperipheralbloodineachgroupanimal(xs)注：Note：*P0.05，comparedwiththenormalcontrol；*P0.05，comparedwiththepositivecontrolTable3Numbersofneutrophilicgranulocyteofperipheralbloodineachgroupanimal(xs)注：Note：*P0.05，comparedwiththenormalcontrol；*P0.05，comparedwiththepositivecontrolTable4Numbersofmonocyteofperipheralbloodineachgroupanimal(xs)注：Note：*P0.05，comparedwiththepositivecontrol2.3脾脏、胸腺指数变化实验第5、7、9天，各组小鼠胸腺指数比较，差异无显著性(P0.05)。各组小鼠给药后，脾脏指数均增加。Table5Theeffectof-glucanonthespleenindexineachgroupanimal(xs)注：Note：*P0.05，comparedwiththepositivecontrol2.4药效学实验病理组织学改变脾脏：白髓、红髓分界不甚清楚，红髓内细胞数增多，与空白对照组比较，CABBG、CAABG、CAIBG组脾窦出现较多的巨核细胞；骨髓：实验组小鼠骨髓细胞增生活跃，与空白对照组比较，CABBG、CAABG、CAIBG组的巨核细胞数增多，提示巨核细胞系增生活跃。3讨论多能造血干细胞具有多向分化的潜能，成年小鼠体内的多能造血干细胞主要分布在脾脏和骨髓3。本研究显示，实验第7天时，各实验组白细胞总数、中性粒细胞数都较rhG-CSF高(P0.05)；实验第7天、第9天，CAIBG升高外周血白细胞、单核细胞数明显高于CABBG、CAABG和rhG-CSF(P0.05)，说明-葡聚糖，尤其是CAIBG可刺激血液系统白细胞、中性粒细胞、单核细胞数不同程度的升高。实验第7天，CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠脾脏指数均与rhG-CSF差异有显著性(P0.05)；第9天，CAIBG脾脏指数较rhG-CSF、CABBG、CAABG组高，统计学表明差异均具有显著性(P0.05)。与成年小鼠体内造血干细胞的分布一致，实验发现CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠的组织病理学改变主要体现在骨髓和脾脏。与空白对照组比较，三组小鼠脾脏、骨髓巨核细胞数增多，CAIBG组要更明显。因此，综合外周血细胞数、脾脏指数、组织改变，我们推测-葡聚糖在刺激小鼠外周血白细胞总数升高的过程中可能与刺激CFU-S增殖，向粒系、巨核系组细胞分化，进而生成粒细胞、单核细胞。造血器官中基质细胞是造血微环境中重要的成分，与造血有关的基质细胞涉及到巨噬细胞、成纤维细胞、网状细胞、淋巴细胞、内皮细胞和载脂肪细胞。其中，巨噬细胞被证明是在造血发生过程中有重要作用的一个微环境因素。巨噬细胞可通过细胞相互作用和分泌CSF、Epo、BPA、PGE和IL-1因子，调节所有四系血细胞的生长和分化4。以往研究证实念珠菌多糖可刺激巨噬细胞释放细胞因子（CK）如IL-6、IL-8、IL-1、TNF等5，6。这些细胞因子可调控造血细胞的增殖活动：IL-1、TNF可刺激内皮细胞产生粒细胞集落刺激因子（G-CSF）及粒-巨噬系集落刺激因子（GM-CSF），G-CSF和GM-CSF是使粒细胞和单核细胞的母细胞增殖分化的特异性诱导剂，并能刺激骨髓向外周血液释放成熟的中性粒细胞，缩短中性粒细胞的成熟期7。同时，CSF可作用于粒-单系祖细胞（CFU-GM），诱导其增殖分化。IL-1还能激活干细胞从G0期进入增殖周期，扩大干细胞池；可为早期干细胞对CSF起反应做准备，并诱导辅助细胞产生CSF及其他CK，从而间接调节造血。-葡聚糖是念珠菌重要的抗原决定簇8，单核细胞、巨噬细胞上都存在-葡聚糖的特异性受体9。白色念珠菌的三种溶解性的-葡聚糖，在结构上都是符合单核细胞、巨噬细胞上-葡聚糖受体对于配体的要求，即能被特异识别-（13）和-（16）糖苷键10。巨噬细胞作为一类抗原递呈细胞（APC）摄取-葡聚糖抗原，随后诱导性的表达高水平MHC，MHC与Th细胞上的TCR和CD4相互作用。使Th细胞功能增强，IL-2分泌增多，IL-2又能保持T细胞的存活与增殖Th细胞被激活后刺激B细胞分化、增殖11。实验中，小鼠脾脏指数的明显增加、脾脏、骨髓细胞增生，说明了-葡聚糖在升高外周血白细胞的同时，也对激活机体的整个免疫系统活性产生影响。因此，CAABG、CABBG、CAIBG升高小鼠外周血白细胞总数、中性粒细胞和单核细胞的作用可能与各组-葡聚糖能不同程度的被单核、巨噬细胞识别从而产生一系列细胞因子，刺激造血系统和促进中性粒细胞增殖有关。免疫调节剂作为一种免疫治疗的药物已经广泛应用于临床。多糖作为一类免疫调节剂，不仅毒副作用小，资源丰富，而且具有明显的调节机体免疫系统的作用。本研究说明白色念珠菌-葡聚糖尤其是不溶性的-葡聚糖能显著增加小鼠脾重，并能对抗由CTX所致的小鼠脾脏萎缩及白细胞水平降低，是一种较好的免疫增强物质。【参考文献】1KoukiIshitani.AntitumoractivityofpolygalactosamineisolatedfromPaecilomycessp.I-1strain.J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