白色念珠菌细胞壁β-葡聚糖升白细胞药效学作用的研究.doc白色念珠菌细胞壁β-葡聚糖升白细胞药效学作用的研究.doc

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白色念珠菌细胞壁Β葡聚糖升白细胞药效学作用的研究【摘要】目的研究白色念珠菌(CANDIDAALBICANS)细胞壁不同溶解性的Β葡聚糖(ΒGLUCAN)对环磷酰胺(CYCLOPHOSPHAMIDE,ENDOXAN,CYTOXAN,CTX)所致小鼠外周血白细胞减少的回升作用。方法采用CTX所致的小鼠外周血白细胞减少模型,研究白色念珠菌细胞壁Β葡聚糖对小鼠外周血白细胞数的影响。结果三种溶解性的白色念珠菌细胞壁Β葡聚糖均能升高小鼠外周血白细胞、中性粒细胞和单核细胞数。各组小鼠脾脏指数增加,脾脏、骨髓巨核细胞系增生。不溶性的Β葡聚糖作用更明显。结论白色念珠菌Β葡聚糖尤其是不溶性Β葡聚糖对CTX所致的白细胞减少有回升作用,是一种很有前途的免疫调节剂。【关键词】白色念珠菌;Β葡聚糖;生物学活性;提取分析;免疫药理作用【ABSTRACT】OBJECTIVETOSTUDYTHEPHARMACOLOGICALEFFECTOFTHEBASICΒGLUCAN,ACIDICΒGLUCANANDINSOLUBLEΒGLUCANEXTRACTSOFCANDIDAALBICANSONTHELEUKOCYTOPOIESISPROMOTINGINTHELEUKOPENIAMICEMETHODSMICEOFEACHGROUPEXCEPTTHEUNTREATEDCONTROLGROUPWEREADMINISTEREDCYCLOPHOSPHAMIDEINTRAPERITONEALLY[100MG/KGDFORTHREEDAYS]TODEVELOPLEUCOPENIATHEEXPERIMENTALGROUPWEREADMINISTEREDTHREEKINDSOFCANDIDAALBICANSΒGLUCANINTRAVENOUSLYFORSIXDAYSSEPARATELYTHEPERIPHERIALLEUKOCYTESOFALLMICEWERECOUNTEDBEFORETREATEDCTX,AND1,3,5,7DAYSAFTERTREATEDCTXRESULTSTHREEKINDSOFCANDIDAALBICANSΒGLUCANCANINCREASETHENUMBERSOFLEUKOCYTES,NEUTROPHILICGRANULOCYTESANDMONOCYTESINTHEPERIPHERALBLOODTHESPLEENINDEXINEACHGROUPANIMALAREINCREASED,ANDMEGAKARYOCYTESAREINCREASEDINSPLEENANDMARROWCONCLUSIONCANDIDAALBICANSΒGLUCANSPECIALLYINSOLUBLEΒGLUCANSISAKINDOFIMMUNOMODULATORWHICHCANINCREASETHENUMBERSOFLEUKOCYTESINTHEPERIPHERALBLOOD【KEYWORDS】ΒGLUCAN;CANDIDAALBICANS;LEUKOCYTE;IMMUNOMODULATORΒ葡聚糖(ΒGLUCAN)是白色念珠菌细胞壁中含量最高的多糖。作为一类条件致病真菌多糖,白色念珠菌Β葡聚糖有着多种生物学活性和免疫药理学作用,在抗炎、抗肿瘤、刺激造血等方面都有很高的药效学作用[1],但有关不同性质的白色念珠菌Β葡聚糖升白细胞作用的研究甚少。本研究制备三种溶解性的Β葡聚糖,观察其对环磷酰胺(CYCLOPHOSPHAMIDE,ENDOXAN,CYTOXAN,CTX)所致的小鼠外周血白细胞减少的回升作用,为进一步确证白色念珠菌Β葡聚糖刺激造血系统使白细胞升高的作用机制,和进一步研究白色念珠菌Β葡聚糖有效成分或有效因子,为确立药物质量控制标准和量-效关系提供理论依据。1材料与方法11动物与试剂昆明种小白鼠,4~6周龄,体重202G,昆明医学院动物科(云南省实验质量合格证0000481号)。沙氏液体培养基(SABOURAUD’SDEXTROSEAGAR)蛋白胨10G、葡萄糖40G、溶于1000ML蒸馏水,高压灭菌后备用;Α淀粉酶分子量~9600,酶活力50Μ/MG(上海伯奥生物科技有限公司);白色念珠菌碱溶性Β葡聚糖(CANDIDAALBICANSBASICΒGLUCAN,CABBG)、酸溶性Β葡聚糖(CANDIDAALBICANSACIDICΒGLUCAN,CAABG和不溶性Β葡聚糖(CANDIDAALBICANSINSOLUBLEΒGLUCAN,CAIBG)均按文献方法制备[2]。12仪器LRH250Z型震荡培养箱(广东医疗器械厂);812型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)。13白念珠菌的培养和三种白色念珠菌Β葡聚糖的制备取少量保存于密封无菌容器中的纯白色念珠菌菌落,接种于沙氏液体培养基,接种后37℃恒温摇床160次/MIN震荡培养6~7天,3000RPM离心30MIN,收集菌体,冷冻保存。提取Β葡聚糖的流程,见图1。14小鼠白细胞减少模型的建立除空白对照组外,各组小鼠腹腔注射CTX100MG/KGD,连续3天,建立小鼠外周血白细胞减少模型。15确定三组Β葡聚糖的给药剂量参照急性毒性实验摸索LD50值,各组给药剂量最后如表1。16统计学处理急性毒性学实验结果采用BLISS法计算LD50值。药效学实验采用SPSS115统计软件进行数据处理分析,所有指标均以均数标准差(XS)表示,组间比较采用方差分析,以P<005为差异有显著性。图1从白色念珠菌提取CABBG、CAABG、CAIBG的流程示意图TABLE1DOSEDESIGNOFEXPERIMENT2结果21急性毒性学实验通过急性毒性实验得到LD50值分别为CABBG368937MG/KG,CAABG8923549MG/KG,CAIBG7677753MG/KG;95可信区间分别为CABBG组320052~425289MG/KG,CAABG组767182~1038025MG/KG,CAIBG组663748~888106MG/KG。各实验组小鼠肉眼观察,除肝脏增大外未见明显变化,病理HE切片显示肝细胞有不同程度的肿胀和空泡变。22外周血白细胞变化实验第5、7、9天CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠外周血白细胞数、中性粒细胞数、单核细胞数均显著增高,其中第7天、第9天,CAIBG组白细胞数、单核细胞数较阳性对照组RHGCSF升高,差异有显著性。TABLE2NUMBERSOFLEUKOCYTEOFPERIPHERALBLOODINEACHGROUPANIMALXS注NOTEP<005,COMPAREDWITHTHENORMALCONTROL;P<005,COMPAREDWITHTHEPOSITIVECONTROLTABLE3NUMBERSOFNEUTROPHILICGRANULOCYTEOFPERIPHERALBLOODINEACHGROUPANIMALXS注NOTEP<005,COMPAREDWITHTHENORMALCONTROL;P<005,COMPAREDWITHTHEPOSITIVECONTROLTABLE4NUMBERSOFMONOCYTEOFPERIPHERALBLOODINEACHGROUPANIMALXS注NOTEP<005,COMPAREDWITHTHEPOSITIVECONTROL23脾脏、胸腺指数变化实验第5、7、9天,各组小鼠胸腺指数比较,差异无显著性P>005。各组小鼠给药后,脾脏指数均增加。TABLE5THEEFFECTOFΒGLUCANONTHESPLEENINDEXINEACHGROUPANIMALXS注NOTEP<005,COMPAREDWITHTHEPOSITIVECONTROL24药效学实验病理组织学改变脾脏白髓、红髓分界不甚清楚,红髓内细胞数增多,与空白对照组比较,CABBG、CAABG、CAIBG组脾窦出现较多的巨核细胞;骨髓实验组小鼠骨髓细胞增生活跃,与空白对照组比较,CABBG、CAABG、CAIBG组的巨核细胞数增多,提示巨核细胞系增生活跃。3讨论多能造血干细胞具有多向分化的潜能,成年小鼠体内的多能造血干细胞主要分布在脾脏和骨髓[3]。本研究显示,实验第7天时,各实验组白细胞总数、中性粒细胞数都较RHGCSF高P<005;实验第7天、第9天,CAIBG升高外周血白细胞、单核细胞数明显高于CABBG、CAABG和RHGCSFP<005,说明Β葡聚糖,尤其是CAIBG可刺激血液系统白细胞、中性粒细胞、单核细胞数不同程度的升高。实验第7天,CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠脾脏指数均与RHGCSF差异有显著性P<005;第9天,CAIBG脾脏指数较RHGCSF、CABBG、CAABG组高,统计学表明差异均具有显著性P<005。与成年小鼠体内造血干细胞的分布一致,实验发现CABBG、CAABG、CAIBG组小鼠的组织病理学改变主要体现在骨髓和脾脏。与空白对照组比较,三组小鼠脾脏、骨髓巨核细胞数增多,CAIBG组要更明显。因此,综合外周血细胞数、脾脏指数、组织改变,我们推测Β葡聚糖在刺激小鼠外周血白细胞总数升高的过程中可能与刺激CFUS增殖,向粒系、巨核系组细胞分化,进而生成粒细胞、单核细胞。造血器官中基质细胞是造血微环境中重要的成分,与造血有关的基质细胞涉及到巨噬细胞、成纤维细胞、网状细胞、淋巴细胞、内皮细胞和载脂肪细胞。其中,巨噬细胞被证明是在造血发生过程中有重要作用的一个微环境因素。巨噬细胞可通过细胞相互作用和分泌CSF、EPO、BPA、PGE和IL1因子,调节所有四系血细胞的生长和分化[4]。以往研究证实念珠菌多糖可刺激巨噬细胞释放细胞因子(CK)如IL6、IL8、IL1、TNF等[5,6]。这些细胞因子可调控造血细胞的增殖活动IL1、TNF可刺激内皮细胞产生粒细胞集落刺激因子(GCSF)及粒巨噬系集落刺激因子(GMCSF),GCSF和GMCSF是使粒细胞和单核细胞的母细胞增殖分化的特异性诱导剂,并能刺激骨髓向外周血液释放成熟的中性粒细胞,缩短中性粒细胞的成熟期[7]。同时,CSF可作用于粒单系祖细胞(CFUGM),诱导其增殖分化。IL1还能激活干细胞从G0期进入增殖周期,扩大干细胞池;可为早期干细胞对CSF起反应做准备,并诱导辅助细胞产生CSF及其他CK,从而间接调节造血。Β葡聚糖是念珠菌重要的抗原决定簇[8],单核细胞、巨噬细胞上都存在Β葡聚糖的特异性受体[9]。白色念珠菌的三种溶解性的Β葡聚糖,在结构上都是符合单核细胞、巨噬细胞上Β葡聚糖受体对于配体的要求,即能被特异识别Β(1→3)和Β(1→6)糖苷键[10]。巨噬细胞作为一类抗原递呈细胞(APC)摄取Β葡聚糖抗原,随后诱导性的表达高水平MHC,MHC与TH细胞上的TCR和CD4相互作用。使TH细胞功能增强,IL2分泌增多,IL2又能保持T细胞的存活与增殖TH细胞被激活后刺激B细胞分化、增殖[11]。实验中,小鼠脾脏指数的明显增加、脾脏、骨髓细胞增生,说明了Β葡聚糖在升高外周血白细胞的同时,也对激活机体的整个免疫系统活性产生影响。因此,CAABG、CABBG、CAIBG升高小鼠外周血白细胞总数、中性粒细胞和单核细胞的作用可能与各组Β葡聚糖能不同程度的被单核、巨噬细胞识别从而产生一系列细胞因子,刺激造血系统和促进中性粒细胞增殖有关。免疫调节剂作为一种免疫治疗的药物已经广泛应用于临床。多糖作为一类免疫调节剂,不仅毒副作用小,资源丰富,而且具有明显的调节机体免疫系统的作用。本研究说明白色念珠菌Β葡聚糖尤其是不溶性的Β葡聚糖能显著增加小鼠脾重,并能对抗由CTX所致的小鼠脾脏萎缩及白细胞水平降低,是一种较好的免疫增强物质。【参考文献】1KOUKIISHITANIANTITUMORACTIVITYOFPOLYGALACTOSAMINEISOLATEDFROMPAECILOMYCESSPI1STRAINJPHARMACOBIODYN,1988,11582GOPALPK,SULLIVANPA,SHEPHERDMGANALYSISOFWALLGLUCANSFROMYEAST,HYPHALANDGERMTUBEFORMINGCELLSOFCANDIDAALBICANSJGENMICROBIOL,1984,13032953103祝彼得造血干细胞研究进展重庆医学院学报,1985,102954徐丰彦,张镜如人体生理学北京人民卫生出版社,1989,9529705LIMIN,CHENYUN,SHAOFENG,ETALISOLATIONANDPURIFICATIONOFTHEALKALISOLUBLEΒ–GLUCANFROMCELLWALLOFCANDIDAALBICANSCHINJDERMATOL,2000,3353113136MANNERSDJ,MASSONAJ,PATTERSONJC,ETALTHESTRUCTUREOFBETA1→3DGLUCANFROMYEASTCELLWALLSBIOCHEMICALJOURNAL,2000,13531367杨藻宏临床用药的药理学基础北京北京科学技术文献出版社,1997,1338CASSONEA,BISTONIF,CENCIE,ETALIMMUNOPOTENTIATIONOFANTICANCERCHEMOTHERAPYBYCANDIDAALBICANS,OTHERYEASTSANDINSOLUBLEGLUCANINANEXPERIMENTALLYMPHOMAMODELSABOURAUDIA,1982,2021151259马学清中药多糖的免疫增强作用中国实验临床免疫学杂志,1996,824010LIMIN,CHENQING,SUNJUNJIANG,ETALTHEEFFECTOFΒ–GLUCANOFCELLWALLFROMCANDIDAALBICANSONINTERLEUKIN6ANDINTERLEUKIN8PRODUCTIONBYHUMANPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLSINVITROJCLINDERMATOL,2002,31634935011周光炎免疫学,第6版北京人民卫生出版社,2002,87100;105115;148160
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