大鼠心脏中神经肽Y的Y1 受体样免疫反应物质的定位.doc

大鼠心脏中神经肽Y的Y1受体样免疫反应物质的定位作者：鲍岚张平程希平张旭【关键词】心脏关键词:心脏；大鼠；Y1受体；神经肽Y摘要:目的为在细胞水平精确地确定神经肽Y（NPY）的Y1受体样免疫反应物质（-LI）在大鼠心脏中的分布.方法用免疫组织化学方法对Y1受体-LI细胞进行了检测.结果一些心肌细胞含有Y1受体-LI，可见清晰的Y1受体免疫反应性（-Ir）条纹，此类细胞在心脏呈斑点状分布，接近外膜侧和室间隔的内膜侧分布较多，Y1受体-LI主要分布于心肌细胞膜、横小管膜和小泡上；心脏内有Y1受体-LI的心内神经元，此类细胞有较长的突起，呈离散分布，与Y1受体-LI心肌细胞或血管相邻，Y1受体-LI神经元的外膜和胞质内有较强的Y1受体-LI，尤以其突起明显.结论NPY对心脏作用的复杂性可能与Y1受体在心脏中多种细胞的广泛分布有关.Keywords:heart；rats；Y1receptor；neuropeptideYAbstract:AIMToaccuratelylocalizeneuropeptideY（NPY）Y1receptor（-R）-likeimmunoreactivity（-LI）inrathearts.METHODSY1-Rimmunoreactive（-Ir）cellswereexaminedwithimmunohistochemistry.RESULTSY1-R-LIwasobservedinsomecardiomyocytesofratheartswithastripe-likepatterninthecells.Thesecellswerescatteredintheheart，especiallyneartheoutermembraneoftheheartandtheinnermembraneofinterventricularseptum.Y1-R-LIwasmainlydistributedovertheplasmalemmaofthecellandTtube，andsmallvesicles.Ontheotherhand，thereweredispersedY1-R-Irintrinsicneuronswithlongprocessesintheheart，sometimesclosetomyocardialcellsorbloodvessels.HighlevelofY1-R-LIwasobservedneartheplasmalemmaandthecytoplasmofneurons，especiallyintheirprocesses.CONCLUSIONThecomplicatedeffectsofNPYontheheartmayberelatedtotheextensivedistributionofY1recep-torinvariedcellsoftheheart.0引言含神经肽Y（NPY）的神经纤维分布于整个心脏1.通常情况下，NPY与去甲肾上腺素（NA）共存于交感神经元，但大鼠心脏中约有半数的NPY神经纤维不与NA共存，而存在于心内神经元中2.根据药理学实验研究，NPY对心脏的作用至少通过两种以上的受体介导，即Y1，Y2和Y3等受体3.通过受体放射自显影方法观察到心脏有Y1受体的结合点4，用分子原位杂交方法也观察到人类心脏中有表达Y1受体的mRNA5.但由于已往的检测方法对组织定位的精确性不够，无法在细胞水平精确地确定受体的位置.本研究用针对Y1受体C末端肽片段的一种纯化的抗血清6，7，用免疫组织化学方法研究大鼠心肌细胞和心内神经元Y1受体的分布.1材料和方法1.1免疫光镜组织化学方法SD大鼠（体质量200250g）10只（本校实验动物中心提供），戊巴比妥钠（50mg・；kg-1，ip）麻醉，经心脏灌注37生理盐水50mL和含40g・；L-1多聚甲醛的0.1mol・；L-1磷酸缓冲液（PB）50mL，再灌注4同样固定液250mL，取心脏，放入4同样固定液后固定1.5h，200g・；L-1蔗糖浸泡24h以上，用冰冻切片机（Leica，德国）切20m的心脏矢状和冠状切片.根据免疫组织化学方法，将切片放入针对Y1受体C末端肽片段的一种纯化的兔抗血清（18000）6-8中，用生物素标记的羊抗兔血清（1200）和VectorABC盒（Vector实验室，美国）孵育，用葡萄糖氧化酶、二甲基联苯胺（DAB）和硫酸镍胺加强法显色，标记物质呈深蓝色，经干燥、透明和DPX封片.在NikonMicrophot-FX显微镜下观察标本，Leica图像处理系统（Leica-Q570C，德国）取像，出照片.1.2免疫电镜组织化学方法SD大鼠4只，麻醉、灌注和后固定同上，固定液为含50mL・；L-1戊二醛和40g・；L-1多聚甲醛的PB.取心脏，切50100m振动切片.免疫组织化学方法处理同上，进行常规DAB反应，标记物质呈棕色.在10g・；L-1锇酸中处理30min，经梯度乙醇和环氧丙烷脱水后，在Epon812中浸润，做平板包埋，聚合后在光镜下定位，取材，在LKB超薄切片机上切片，不做铅铀染色，在JEOL-1200电子显微镜下观察，拍照，出照片.用制备抗体用的合成的Y1受体C末端多肽片段以1mol・；L-1与Y1受体抗体预吸收24h（4）后，做以上免疫组织化学反应，以此检验抗血清免疫标记的特异性.2结果2.1心肌细胞大鼠心脏内一些心肌细胞可见中等强度的蓝黑色着色，为Y1受体-LI（Fig1），可见清晰的Y1受体-Ir标记条纹，为心肌细胞内横小管结构，有的与心脏内Y受体-LI血管相邻（Fig2）.左右心房、左右心室、房间隔、室间隔和房室瓣膜上均有Y1标记-Ir心肌细胞，此类细胞在心脏呈散在的不均匀分布，近心外膜侧分布较多（Fig3），尤以左心室最明显，室间隔近心内膜的两侧分布也较多.在电镜下可以观察到一些心肌细胞的外膜上有精细和间断的Y1受体-LI标记，近胞质处有颗粒样的Y1受体-LI标记物，也可见正在内吞的有Y1受体-LI标记的小泡（Fig4）.在横小管两侧膜上有Y1受体-LI标记（Fig5），常在相邻的数个横小管中同时出现，也可间隔出现.2.2神经元大鼠心脏内有较强标记的Y1受体-Ir神经元（Fig6，7），这些神经元体积小，并有多个突起，有的突起较长，此类细胞在心脏内呈离散分布，单个存在，常与Y1受体-Ir心肌细胞相邻（Fig6）.左右心房、左右心室、房间隔和室间隔上均有此类Y1受体-Ir神经元，但在窦房结和房室结周围未见大量的Y1受体-Ir神经元.心内神经元胞体的外膜有较深的点状Y1受体-LI标记，其突起的外膜处也有断续的Y1受体-LI标记，较胞体外膜多（Fig8）.胞体的胞质内有一些与Y1受体-LI标记的外膜相临的Y1受体-Ir小泡，也有一些颗粒状和块状的Y1受体-LI，神经元的胞核在胞体中占较大部分，有时在胞膜和胞核间的狭小空间内充满了Y1受体-Ir结构.突起的胞质内有较强的Y1受体-Ir结构，有时充满了一小段突起，有许多Y1受体-Ir小泡，另有一些颗粒状结构.这些含Y1受体-LI的心内神经元可以与周围的心肌细胞相临，在心肌细胞与之相临面可见外膜有Y1受体-LI（Fig8）；Y1受体-LI的心内神经元也可与心内血管相临，有时与血管腔只有一层内皮细胞之隔（Fig9）.用经预吸收后的抗血清孵育组织切片，并做免疫组织化学反应后未见有以上描述的阳性结构.3讨论NPY受体与心脏的变时和变力作用有关9.我们提供了Y1受体存在于心肌细胞和心内神经元的直接形态学证据.在通常情况下，Y1受体-LI心肌细胞和心内神经元呈散在的不均匀分布，靠心肌外膜侧较多，左右心房、左右心室、房间隔、室间隔和房室瓣膜上均有分布.Y1受体在心脏的多种细胞和广泛分布为NPY对大鼠心脏变时和变力作用的多样性9提供了一定的依据.许多以往的研究显示心脏组织有大量的NPY免疫反应阳性神经纤维，心房多于心室10.同时有研究表明心脏具有多种NPY受体，如受体放射自显影配基结合试验结果显示心室膜有NPY的结合位点，用选择性的Y2受体激动剂NPY（13-36）结合指示此为Y2受体；又如在心室肌，其NPY受体对PYY和NPY的亲合性存在差别，而到目前为止Y1和Y2受体对PYY和NPY几乎具有同样的亲合性，因此认为在心室肌的结合位点为Y3受体11.药理学实验也进一步证实心脏内有多种NPY受体，大鼠心肌细胞至少存在两种接后（postjunctional）NPY受体，Y1可能介导NPY对心肌细胞的负性收缩反应12.本研究证实大鼠心肌细胞有Y1受体，但呈散在分布，未见心房内有许多Y1受体-Ir的心肌细胞，似与心脏内NPY神经纤维的密集和区域密集分布不匹配，有可能这些心肌细胞表达其他类型的NPY受体.此外，Y1受体-Ir心肌细胞散在分布于较多的Y1受体阴性心肌细胞中，NPY是如何通过具有Y1受体的心肌细胞对整体心肌产生作用尚待进一步研究.图1图9略在电镜下可清晰地观察到大鼠一些心肌细胞的外膜和横小管膜上及胞质中有Y1受体-LI，且存在于小泡中.Y1受体为G蛋白偶联超家族受体，NPY作用于接后Y1受体时，通过抑制性的G蛋白，可能对心肌产生负性肌力作用9，在这一过程中，均可引起细胞内钙离子变化.通常情况下，心肌细胞经横小管将兴奋传向终池，使肌浆网膜上的钙泵活动，肌浆内的钙离子浓度发生改变，从而引起心肌一系列变化13.NPY可能通过作用于心肌外膜和横小管膜上的Y1受体，对心肌收缩力产生影响.我们的研究表明，大鼠心脏有较强的Y1受体-Ir神经元，并具有较长的突起，可能为心内神经元，心内神经元主要为迷走神经的节后神经元，可单个存在.有研究报道心内神经元中有NPY反应阳性神经元14，因此来自心内神经元自分泌或旁分泌的NPY对其自身有调节作用，也可对其周围的心肌细胞产生作用，这也为Y1受体可以是接前（prejunctional）受体提供了新的证据.已有的研究发现大鼠心脏有一种小强荧光细胞位于心肌细胞之间，有的在有孔毛细血管周围，可释放儿茶酚胺或其他物质到组织间隙或血管内，以内分泌和旁分泌的方式起局部调节作用15.我们的研究发现Y1受体-LI的心内神经元可与心内血管相临，特别是有时与血管腔只有一层内皮细胞之隔，因此Y1受体-LI的心内神经元也可能是此小强荧光细胞，NPY通过对接前Y1受体的作用，除对乙酰胆碱的释放起调节作用外，对儿茶酚胺或其他物质的释放也起调节作用.参考文献:1WhartonJ，GulbenkianS.Peptidesinthemammaliancardiovas-cularsystemJ.ExperentiaSuppl，1989；56:292-316.2CorrLA，AberdeenJA，MilnerP，LincolnJ，BurnstockG.SympatheticandnonsympatheticneuropeptideY-containingnervesintheratmyocardiumandcoronaryarteriesJ.CircRes，1990；66（6）:1602-1609.3GrundemarL，HakansonR.MultipleneuropeptideYreceptorsareinvolvedincardiovascularregulation.PeripheralandcentralmechanismsJ.GenPharm，1993；24（4）:785-796.4WahlestedtC，RegunathanS，ReisDJ.IdentificationofculturedselectivelyexpressingY1-，Y2-orY3-typereceptorsforneu-ropeptideY/peptideYYJ.LifeSci，1992；50（4）:PL7-PL12.5WhartonJ，GordonL，ByrneJ，HerzogH，SelbieLA，MooreK，SullivanMH，ElderMG，MoscosoG，TaylorKM.Expres-sionofthehumanneuropeptidetyrosineY1receptorJ.ProcNaltAcadSciUSA，1993；90（2）:687-691.6ZhangX，BaoL，XuZQ，KoppJ，ArvidssonU，EldeR，Hok-feltT.LocalizationofneuropeptideYY1receptorsintheratnervoussystemwithspecialreferencetosomaticreceptorsonsmalldorsalrootganglionneuronsJ.ProcNatlAcadSciUSA，1994；91（24）:11738-11742.7BaoL，KoppJ，ZhangX，XuZQ，ZhangLF，WongH，WalshJ，HokfeltT.LocalizationofneuropeptideYY1receptorsincerebralbloodvesselsJ.ProcNatlAcadSciUSA，1997；94（23）:12661-12666.8BaoL，LinYH，ZhangX.DistributionofneuropeptideYY1re-ceptor-likeimmunoreactivityinratcoronarybloodvesselsJ.Di-siJunyiDaxueXuebao（JFourthMilMedUniv），2000；20（1）:1-5.9McDermottBJ，MillarBC，PiperHM.Cardiovasculareffectsofneur