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电针对局灶性脑缺血大鼠缺血区皮层神经生长因子表达的影响作者易玮,许能贵,汪帼斌,佘世锋,徐振华,赖新生【关键词】脑缺血/针灸疗法;,,神经生长因子/针灸效应;,,百会,穴;,,大椎,穴;,,疾病模型,动物;,,大鼠摘要【目的】探讨针刺对缺血性脑损伤的保护作用。【方法】SD大鼠36只,随机分为假手术组、缺血模型组和电针组,每组又分为2周和5周两个时间段组;除假手术组外,其他组均采用热凝闭大鼠大脑中动脉法复制局灶性脑缺血模型,采用免疫组化法观察缺血2周和5周后缺血区皮层神经生长因子NGF的变化规律以及针刺对其影响。【结果】两个假手术组大鼠手术侧皮层只见到很少的NGF免疫阳性细胞;两个缺血组大鼠脑缺血区皮层NGF免疫活性细胞的表达与假手术组比较显著增多(P<001),缺血5周组与缺血2周组相比缺血区皮层NGF阳性细胞的数量下降(P<001);电针组在2周时缺血区皮层NGF免疫阳性细胞的表达增高,与缺血2周组、假手术2周组相比差异具有显著性意义(P<001);电针5周组大鼠脑缺血区皮层NGF免疫阳性细胞表达虽呈下降趋势,但仍高于同时间段的缺血组大鼠(P<001)。【结论】电针可以增加大鼠脑缺血区皮层NGF的分泌和表达时程,这可能是其保护缺血性脑损伤的机制之一。关键词脑缺血/针灸疗法;神经生长因子/针灸效应;百会,穴;大椎,穴;疾病模型,动物;大鼠神经生长因子NGF是由神经元自身所支配的靶组织产生的特异蛋白分子,通过神经元轴突逆行运输到神经元胞体,与特异的神经细胞受体结合,激活细胞代谢,调节细胞生长。NGF在脑内的含量虽少,但对神经细胞的发育、成熟和存活起着极为重要的作用。神经生长因子的供应数量是有限的,神经元在发育过程中,得到神经生长因子的细胞才能生存,得不到的则死亡,存在一种竞争关系[1]。而在病理情况下,NGF起着保护神经元避免损伤的作用,可以提高神经元的存活[2]。由于NGF在脑损伤时对神经细胞具有重要的保护作用和促进神经细胞功能恢复的作用,因而成为国内外学者研究的热点。不同原因的脑损伤均可引起NGF表达的增加,一般在脑缺血后2HNGF表达就出现,表达时程依缺血时间长短和程度轻重而不同。已有研究表明[3],急性脑缺血损伤后NGF的表达对神经细胞具有重要的保护作用和促进神经元功能恢复作用,为求证NGF是否参与脑缺血损伤后期对神经元的保护过程,本实验观察了不同时间段脑缺血大鼠缺血区皮层NGF的表达及电针对其干预作用。现报告如下。1材料与方法11动物健康纯种SD大鼠36只由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号000000250,雌雄各半,体质量180~240G。自来水喂养,饲以普通颗粒型大鼠饲料含蛋白230G/KG,脂肪47G/KG,钠盐24G/KG,动物房温度控制在18℃~26℃,光暗周期各12H。由抽签法随机分为假手术组、缺血模型组和电针组,每组又分为2周和5周两个时间段组,共6小组,每小组6只大鼠。其中缺血模型2周组在第3天时死亡1只。12试剂与仪器40G/L多聚甲醛;001MOL/L磷酸盐缓冲液PBS;体积分数为3的H2O2;牛血清白蛋白BSA;二氨基联苯胺DBA;聚乙二醇辛基苯基醚TRITONX100);第一抗体为羊抗大鼠NGF抗体CHEMICON公司产品,购于深圳晶美公司;生物素标记的第二抗体为兔抗羊IGGCHEMICON公司产品,购于深圳晶美公司;普通光学显微镜400);30号1寸毫针华佗牌,苏州医疗用品厂生产;G68051电针治疗仪青岛华青仪器厂。13模型复制采用热凝闭大脑中动脉法复制局灶性脑缺血MACO模型[4]。具体方法是用100G/L水合氯醛溶液,按400MG/KG剂量腹腔麻醉;取右上侧卧位固定,沿耳眼连线中点切开皮肤,分离颞肌,暴露颞骨作一骨窗,轻抬脑,显露大脑中动脉,用烧红的不锈钢丝轻触大脑中动脉,使之凝闭,复制局灶性脑缺血模型;其中假手术者只作手术暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭;电针组立即给予电针治疗。14治疗方法141穴位选择穴位选取督脉经的百会、大椎2穴,其定位参照大鼠的常用针灸穴位[5]“百会”位于顶骨正中;“大椎”在第7颈椎与第1胸椎间,背部正中。142刺法电针组大鼠以30号1寸毫针斜刺百会05寸同身寸,直刺大椎05寸,将针柄分别连接至电针仪上,5~10HZ,疏密波,强度以大鼠安静耐受为度,一般3~5V,时间30MIN。每天1次,均在上午10点左右进行,分别连续治疗2周2周组和5周5周组。假手术组和缺血模型组大鼠只在同等条件下饲养,未予任何处理。15标本采集及处理2周及5周后,分别取出大鼠,100G/L水合氯醛腹腔注射麻醉,心脏快速灌流生理盐水100ML,然后用40G/L多聚甲醛4℃灌流固定30MIN;断头取脑,放入40G/L多聚甲醛进行后固定4~6H,然后分别置于150、200、300G/L的梯度蔗糖脱水;待脑组织下沉后取出做冰冻切片,片厚40ΜM,取缺血中心的脑片前囟前01~08MM进行免疫组织化学染色。16免疫组织化学染色切片入001MOL/L磷酸盐缓冲液PBS,PH72~74漂洗3次,每次5MIN;再入体积分数为3的H2O2中漂洗10MIN,然后放入含10G/LBSA和2G/LTRITONX100的PBS溶液中20MIN,将切片放入稀释后的第一抗体中,37℃孵育2H,移入4℃冰箱孵育30H;经PBS漂洗3次,切片入生物素标记的第二抗体,37℃孵育1H,PBS漂洗3次;切片挑入05G/LDAB含体积分数为010的H2O2)中,显色后入PBS漂洗3次,贴片,晾干,梯度酒精脱水后晾干,入二甲苯溶液2次,每次各5MIN,苏木素复染,最后多聚树胶封片。对照实验以正常羊血清和PBS代替一抗,同步进行上述免疫组织化学染色,结果为阴性。17细胞计数及统计光镜下400)对假手术组、缺血模型组和电针组手术侧皮层的免疫阳性细胞进行计数,每组计算18张切片、每张切片计算3个非重叠视野的免疫阳性细胞数目,并进行方差分析检验。2结果NGF的免疫阳性颗粒分布在神经元胞浆内,两个假手术组大鼠手术侧皮层只见到很少的NGF免疫阳性细胞。两个缺血模型组2周组和5周组大鼠脑缺血区皮层NGF免疫活性细胞表达明显增多,与假手术组比较具有显著性差异(P<001);缺血5周组与缺血2周组相比,缺血区皮层NGF阳性细胞的数量下降(P<001)。电针组在2周时缺血区皮层NGF免疫阳性细胞的表达增高,与缺血2周组及假手术2周组比较具有显著性差异(P<001);电针5周组大鼠缺血区皮层NGF免疫阳性细胞表达虽呈下降趋势,仍高于同时间段的缺血组大鼠(P<001)。结果见表1、图1。表1电针对MACO模型大鼠脑缺血灶周围皮层NGF阳性细胞数的影响3讨论神经生长因子NGF是LEVIMONTALCINI等于20世纪50年代发现的第1个神经营养因子。自20世纪80年代中期发现脑内存在NGF的MRNA、蛋白及NGF受体以来,NGF与中枢神经系统CNS疾病的关系及运用NGF防治CNS疾病的研究就越来越广泛和深入。在生理情况下,NGF在脑内的含量高低依次为海马、大脑皮质、嗅球、基底前脑、小脑、纹状体[6]。NGF在脑内含量虽微,但在神经系统内对神经元的生存、分化、生长起着重要作用,特别在轴突的生长和细胞的存活方面起着非常重要的作用。研究表明,NGF能抑制中枢神经元因缺血而导致的程序性细胞死亡,增加自由基清除剂的活性,减轻缺血神经细胞损伤,促进受损神经元的再生[3]。NGF能促进脑缺血后运动功能和记忆的恢复,减少锥体神经元树突的萎缩[7]。HSU[8]的研究发现,将大鼠右侧大脑中动脉闭塞30MIN再开放,4H后缺血侧皮质NGF表达增加,1~3D表达明显受抑制,但1~2周出现第2次高峰。LEE[9]的研究证明,在大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型中,非缺血皮质内NGF的免疫活性从缺血4H开始升高,第3天升高明显,第7天达到高峰,至第14天NGF免疫活性恢复到正常水平;半影区NGF活性在缺血开始时出现短暂下降,第3天开始上升,第14天恢复至正常水平。研究表明,NGF能使神经元前体细胞增殖,对胆碱能神经元、单胺类神经元、肽能神经元、交感神经元、Γ氨基丁酸能神经元均具有支持存活作用,NGF可以增加神经递质的合成,阻止神经元细胞程序性死亡[10],NGF可以通过减少细胞内钙超载来拮抗脑缺血后过度兴奋和氨基酸的兴奋毒性以起到神经保护剂的作用[11]。缺血性脑损伤时NGF表达增加对于保护神经细胞、提高神经元存活率具有重要意义,NGF表达时程越长,对受损神经元的保护作用越全面、持久。本实验结果显示,MACO模型大鼠在造模2周后缺血区皮层有大量NGF阳性细胞表达,在5周时NGF表达虽有下降,但仍高于正常水平与假手术组相比,结果与上述研究的结论一致。因为本实验只选取两个时间点,所以无法看出NGF在MACO模型大鼠缺血区皮层的表达规律。但从实验结果可以看出,电针治疗组在2周时缺血区皮层NGF的阳性表达高于缺血组和假手术组,在5周时虽已成下降趋势,仍高于同时段的模型组。提示电针能提高MACO模型大鼠缺血区皮层NGF的分泌,延长缺血区皮层NGF表达时程,是其促进脑缺血后康复的机制之一,具体作用环节有待进一步研究。参考文献[1]YUENEC,MOBLEYWC.THERAPEUTICPOTENTIALOFNEUROTROPHICFACTORSFORNEUROLOGICALDISORDERS[J].ANNNEUROL,1996,403346.[2]HOLTZMANDM,SHELDONRA,JAFFEW,ETAL.NERVEGROWTHFACTORPROTECTSTHENEONATALBRAINAGAINSTHYPOXICISCHEMICINJURY[J].ANNNEUROL,1996,401114.[3]CHENJ,SIMONR.ISCHEMICTOLERANCEINTHEBRAIN[J].NEUROLOGY,1997,48306.[4]许能贵,易玮,马勤耘,等.电针对大鼠局灶性脑缺血后神经元损伤保护作用的研究[J].中国针灸,2000,204237.[5]林文注,王佩.实验针灸学[M].上海上海科学技术出版社,1994286.[6]HOENERMC,HEWITTE,CONNERJM,ETAL.NERVEGROWTHFACTORNGFCONTENTINADULTRATBRAINTISSUESISSEVERALFOLDHIGHERTHANGENERALLYREPORTEDANDISLARGELYASSOCIATEDWITHSEDIMENTABLEFRACTIONS[J].BRAINRES,1996,728147.[7]BARBROB.BRAINPLASTICITYANDSTROKEREHABILITATION[J].STROKE,2000,31223.[8]HSUCY,ANG,LIUJS,ETAL.EXPRESSIONOFIMMEDIATEEARLYGENEANDGROWTHFACTORMRNASINAFOCALCEREBRALISCHEMIAMODELINTHERAT[J].STROKE,1993,2412SUPPL178.[9]LEETH,KATOH,CHENST,ETAL.EXPRESSIONOFNERVEGROWTHFACTORANDTRKAAFTERTRANSIENTFOCALCEREBRALISCHEMIAINRATS[J].STROKE,1998,2981687.[10]ARIMATSUY,MIYAMOTOM.SURVIVALPROMOTINGEFFECTOFNGFONINVITROSEPTOHIPPOCAMPALNEURONSWITHCHOLINERGICANDGABAERGICPHENOTYPES[J].BRAINRESDEVBRAINRES,1991,582189.[11]ANGET,WONGPT,MOOCHHALAS,ETALNEUROPROTECTIONASSOCIATEDWITHRUNNINGISITARESULTOFINCREASEDENDOGENOUSNEUROTROPHICFACTORS[J].NEUROSCIENCE,2003,1182335.
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