参附注射液对大鼠脑缺血再灌注后海马CA1 区Caspase-3 表达的影响.pdf

参附注射液对大鼠脑缺血再灌注后海马悦粤员区悦葬泽责葬泽藻?猿表达的影响于腊梅员摇李乃选圆摇王桂华员摇刁汇玲员摇张摇慧员员滨州医学院生理学教研室摇烟台市摇圆远源园园猿；圆滨州医学院附属医院介入医学科【摘要】摇目的摇研究参附注射液对大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马悦粤员区半胱氨酸蛋白酶?猿（悦葬泽责葬泽藻?猿）表达的影响。方法摇成年雄性杂阅大鼠猿园只，随机分为假手术组、模型组、参附注射液治疗组。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（皂蚤凿凿造藻糟藻则藻遭则葬造葬则贼藻则赠燥糟糟造怎泽蚤燥灶，酝悦粤韵）再灌注模型，应用匀耘染色检测海马悦粤员区组织病理学改变，免疫组织化学法检测海马悦粤员区神经细胞悦葬泽责葬泽藻?猿的表达。结果摇缺血组大鼠海马悦粤员区神经细胞悦葬泽责葬泽藻?猿的表达较假手术组显著增强（孕约园郾园员），给予参附注射液处理后，悦葬泽责葬泽藻?猿的表达较缺血组减弱（孕约园郾园员），差异均有统计学意义。结论摇参附注射液可降低大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马悦粤员区悦葬泽责葬泽藻?猿的表达，可能与其脑保护作用有关。【关键词】摇参附注射液；脑缺血再灌注；半胱氨酸蛋白酶?猿；凋亡【中图分类号】摇砸苑源猿援猿摇【文献标志码】摇粤摇【文章编号】摇员园园员鄄怨缘员园（圆园员员）园猿鄄园员苑怨鄄园猿耘枣枣藻糟贼燥枣杂澡藻灶枣怎蚤灶躁藻糟贼蚤燥灶燥灶贼澡藻藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣悦葬泽责葬泽藻?猿蚤灶贼澡藻悦粤员葬则藻葬燥枣贼澡藻澡蚤责责燥糟葬皂责怎泽扎燥灶藻燥枣则葬贼泽葬枣贼藻则糟藻则藻遭则葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬?则藻责藻则枣怎泽蚤燥灶再哉蕴葬皂藻蚤员摇蕴陨晕葬蚤曾怎葬灶圆摇宰粤晕郧郧怎蚤澡怎葬员摇阅陨粤韵匀怎蚤造蚤灶早员摇在匀粤晕郧匀怎蚤员员阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣孕澡赠泽蚤燥造燥早赠，月蚤灶扎澡燥怎酝藻凿蚤糟葬造哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠，再葬灶贼葬蚤圆远源园园猿；圆阅藻责葬则贼皂藻灶贼燥枣陨灶贼藻则增藻灶贼蚤燥灶葬造酝藻凿蚤糟蚤灶藻，粤枣枣蚤造蚤葬贼藻凿匀燥泽责蚤贼葬造燥枣月蚤灶扎澡燥怎酝藻凿蚤糟葬造哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠【粤遭泽贼则葬糟贼】摇韵遭躁藻糟贼蚤增藻摇栽燥泽贼怎凿赠贼澡藻藻枣枣藻糟贼燥枣杂澡藻灶枣怎蚤灶躁藻糟贼蚤燥灶燥灶贼澡藻藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣贼澡藻悦葬泽责葬泽藻?猿蚤灶悦粤员澡蚤责责燥糟葬皂责怎泽扎燥灶藻燥枣则葬贼泽葬枣贼藻则糟藻则藻遭则葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬?则藻责藻则枣怎泽蚤燥灶援酝藻贼澡燥凿泽摇栽澡藻猿园皂葬造藻杂责则葬早怎藻?阅葬憎造藻赠则葬贼泽憎藻则藻凿蚤增蚤凿藻凿蚤灶贼燥猿早则燥怎责泽：泽澡葬皂燥责藻则葬贼蚤燥灶早则燥怎责，糟藻则鄄藻遭则葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬早则燥怎责葬灶凿杂澡藻灶枣怎蚤灶躁藻糟贼蚤燥灶蚤灶贼藻则增藻灶贼藻凿早则燥怎责援栽澡藻枣燥糟葬造糟藻则藻遭则葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬皂燥凿藻造泽燥枣则葬贼泽憎藻则藻藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿遭赠贼澡藻皂蚤凿凿造藻糟藻则藻遭则葬造葬则贼藻则赠燥糟糟造怎泽蚤燥灶（酝悦粤韵）憎蚤贼澡蕴燥灶早葬鸳泽皂藻贼澡燥凿泽援匀耘泽贼葬蚤灶蚤灶早憎葬泽怎泽藻凿贼燥凿藻贼藻糟贼澡蚤泽贼燥责葬贼澡燥造燥早蚤糟葬造糟澡葬灶早藻泽蚤灶悦粤员葬则藻葬燥枣澡蚤责责燥鄄糟葬皂责怎泽援栽澡藻藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣悦葬泽责葬泽藻?猿憎葬泽燥遭泽藻则增藻凿遭赠蚤皂皂怎灶燥澡蚤泽贼燥?糟澡藻皂蚤泽贼则赠援砸藻泽怎造贼泽摇悦燥皂责葬则藻凿憎蚤贼澡贼澡藻泽澡葬皂燥责藻则葬贼蚤燥灶早则燥怎责，贼澡藻藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣悦葬泽责葬泽藻?猿蚤灶糟则藻葬泽藻凿燥遭增蚤燥怎泽造赠蚤灶糟藻则藻遭则葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬早则燥怎责（孕约园郾园员）援粤枣贼藻则早蚤增蚤灶早杂澡藻灶枣怎蚤灶躁藻糟贼蚤燥灶，贼澡蚤泽糟澡葬灶早藻泽憎藻则藻憎藻葬噪藻灶（孕约园郾园员）援悦燥灶糟造怎泽蚤燥灶摇杂澡藻灶枣怎蚤灶躁藻糟贼蚤燥灶糟葬灶蚤灶澡蚤遭蚤贼葬责燥责贼燥泽蚤泽贼澡则燥怎早澡凿藻泽糟藻灶凿蚤灶早贼澡藻藻曾责则藻泽泽蚤燥灶燥枣悦葬泽责葬泽藻?猿蚤灶悦粤员澡蚤责鄄责燥糟葬皂责怎泽扎燥灶藻燥枣则葬贼泽葬枣贼藻则糟藻则藻遭则葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬?则藻责藻则枣怎泽蚤燥灶援【运藻赠憎燥则凿泽】摇杂澡藻灶枣怎蚤灶躁藻糟贼蚤燥灶，糟藻则藻遭则葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬?则藻责藻则枣怎泽蚤燥灶，悦葬泽责葬泽藻?猿，葬责燥责贼燥泽蚤泽摇摇在脑缺血再灌注后，缺血中心区的神经元死亡以坏死形式为主，而缺血周围区的神经元死亡与凋亡有关。细胞凋亡的过程受到许多凋亡基因的调控，半胱氨酸蛋白酶?猿（糟赠泽贼藻蚤灶赠造葬泽责蚤则葬贼藻?泽责藻糟蚤枣蚤糟责则燥鄄贼藻蚤灶葬泽藻?猿，悦葬泽责葬泽藻?猿）就是一种非常重要的凋亡基因，在凋亡过程中发挥着重要作用。参附注射液（杂澡藻灶枣怎蚤灶躁藻糟贼蚤燥灶，杂云）是由中医治疗厥脱证（休克）著名古方参附汤加工提炼而成，为红参和黑附片的提取物，主要成分为人参皂苷和乌头类生物碱员。近年来，已有文献报道参附注射液对脑缺血再灌注损伤后神经元的凋亡具有保护作用，其具体作用机制尚不是很清楚，可能与基因遭葬曾、遭糟造?圆等有关圆，但其对悦葬泽责葬泽藻?猿表达的影响至今未见报导。为此，作者观察了参附注射液对脑缺血再灌注损伤后海马悦粤员区神经细胞悦葬泽责葬泽藻?猿表达的变化，以阐述其脑保护作用的具体机制。员摇材料和方法员援员摇实验动物及所用试剂摇健康成年雄性杂阅大鼠猿园只，杂孕云级，体质量圆园园耀圆缘园早，购于山东绿叶制药有限公司，实验动物许可证号：杂悦载运（鲁）怨苑员滨州医学院学报圆园员员年远月第猿源卷第猿期摇月酝哉允燥怎则灶葬造，允怎灶援圆园员员，灾燥造援猿源，晕燥援猿基金资助项目：滨州医学院科技计划（月再圆园园怨运允圆怨）万方数据圆园园怨园园园怨。参附注射液为雅安三九药业有限公司生产，批号：园怨员圆园缘。悦葬泽责葬泽藻?猿免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。员援圆摇动物分组及模型制备摇将动物随机分为假手术组、模型组、杂云治疗组，每组员园只。参照蕴燥灶早葬猿栓线法复制大鼠左侧大脑中动脉闭塞（皂蚤凿凿造藻糟藻则藻遭则葬造葬则贼藻则赠燥糟糟造怎泽蚤燥灶，酝悦粤韵）模型。大鼠以员园豫水合氯醛（猿缘园皂早辕噪早）腹腔内注射麻醉，仰卧固定，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉及颈内、外动脉，结扎颈总动脉及颈外动脉根部，由颈总动脉近分叉处剪一小口插入尼龙线，插入长度约员愿耀圆园皂皂时感到有轻微阻力时停止，扎紧并固定插线，缝合皮肤，阻断血流圆澡后，拔线实现再灌注圆源澡。假手术组仅分离左侧颈总动脉。杂云治疗组于术前员周至术后每日（共员源凿）经腹腔注射参附注射液，剂量为员园皂造辕噪早。员援猿摇行为学评分摇观察各组大鼠神经系统症状的变化。按蕴燥灶早葬猿缘分法标准进行评分，园分：无神经损伤；员分：不能完全伸展右侧前肢；圆分：向右侧转圈；猿分：向右侧倾倒；源分：不能自发行走，意识水平下降。员耀源分为造模成功并继续后续试验；死亡者和少于员分者弃去并重新补入成功模型制备动物，继续后续试验。员援源摇匀耘染色及免疫组化摇各组大鼠在深麻醉状态下打开胸腔，心脏快速相继灌注温生理盐水和源豫多聚甲醛各圆缘园皂造。灌注完毕后快速断头取海马组织，常规固定、石蜡包埋，在切片机上连续切片，片厚源皂，将切片随机分为圆组，一组进行匀耘染色，另一组应用免疫组化法检测海马悦粤员区悦葬泽责葬泽藻?猿的表达。匀耘染色：切片常规脱蜡至水，苏木精染色员园皂蚤灶，盐酸酒精分色猿园泽，伊红复染缘皂蚤灶，脱水、透明、常规封片，镜下观察。用杂孕法进行免疫组化染色，检测悦葬泽责葬泽藻?猿。严格按照试剂盒说明书操作，滴加一抗悦葬泽责葬泽藻?猿缘园造（员颐员园园稀释），滴加生物素化二抗缘园造，阅粤月显色，显微镜下控制反应时间，常规封片，镜下观察。员援缘摇统计学处理摇所有数据均以珋曾依泽表示，用杂孕杂杂员猿援园统计软件包进行统计学处理，采用单因素方差分析（粤晕韵灾粤）和择检验，孕约园援园缘为差异有统计学意义。圆摇结果圆援员摇神经行为症状评分结果摇模型组大鼠术后出现明显的神经功能缺陷症状，大多数表现为右侧前肢屈曲，行走时向右侧偏移，神经行为症状评分与假手术组比较有统计学意义（孕约园郾园员）；杂云治疗组大鼠与脑缺血模型组比较有统计学意义（孕约园郾园缘），结果见表员。圆援圆摇各组大鼠匀耘染色结果摇匀耘染色结果显示，假手术组大鼠海马悦粤员区神经细胞形态结构正常，有数层锥体细胞，排列紧密；模型组大鼠海马悦粤员区锥体细胞层次减少，排列稀疏，神经细胞肿胀；杂云治疗组大鼠海马悦粤员区锥体细胞数量较模型组增多，细胞水肿略减轻，但排列较紊乱（见图员）。圆援猿摇海马悦粤员区神经细胞悦葬泽责葬泽藻?猿的表达摇悦葬泽责葬泽藻?猿阳性神经细胞染色主要位于胞浆，胞浆呈棕黄色。假手术组见少量悦葬泽责葬泽藻?猿阳性细胞表达。模型组海马悦粤员区神经细胞悦葬泽责葬泽藻?猿阳性细胞数增加，尤以梗死周边区更为明显。悦葬泽责葬泽藻?猿染色阳性细胞数与假手术组比较有显著差异（孕约园郾园员）。杂云治疗组悦葬泽责葬泽藻?猿染色阳性细胞数与模型组比较显著减少（孕约园郾园员）。结果见表员及图圆。表员摇各组神经功能缺损评分和悦葬泽责葬泽藻?猿表达的比较（珋曾依泽）组摇别神经功能缺损评分悦葬泽责葬泽藻?猿阳性细胞数假手术组园员援远园依园援缘缘模型组猿援猿园依园援远愿猿猿援圆园依苑援园员杂云治疗组圆援源园依园援愿源圆园援圆园依源援怨苑摇摇注：模型组与假手术组比较孕约园援园员；杂云治疗组与模型组比较孕约园援园缘，孕约园援园员。图1海马CA1区HE染色结果(100)假手术组模型组SF治疗组园愿员滨州医学院学报圆园员员年远月第猿源卷第猿期摇月酝哉允燥怎则灶葬造，允怎灶援圆园员员，灾燥造援猿源，晕燥援猿万方数据假手术组模型组SF治疗组图2海马CA1区神经细胞Caspase3的表达（免疫组化染色，100）猿摇讨论摇摇脑缺血再灌注可诱发细胞凋亡，脑缺血再灌注后脑组织中凋亡的细胞大多为神经细胞源。有实验表明大鼠全脑缺血再灌注后海马区延迟性神经元死亡是不同于坏死的一个过程缘，凋亡是其神经元丢失的重要原因。如果迅速恢复脑缺血周围区的血供，可以抑制缺血神经元凋亡，改善神经元的生存环境，对缺血性脑损伤有积极的保护作用。摇摇细胞凋亡是受基因调控的级联反应过程。近年来研究发现，悦葬泽责葬泽藻?猿蛋白参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程，在脑缺血再灌注损伤中起重要的作用远。悦葬泽责葬泽藻?猿是脑缺血后介导神经细胞凋亡的关键蛋白酶苑，是参与凋亡的悦葬泽责葬泽藻级联反应的最终效应子，它主要通过消化、破坏细胞内多种蛋白酶复合体，激活核内核酸酶，造成阅晕粤裂解，破坏细胞钙泵功能等机制来进一步切割不同底物，执行最终的细胞凋亡愿耀员园。在凋亡的执行阶段，悦葬泽责葬泽藻?猿能有效水解细胞的结构蛋白和功能蛋白，从而杀死细胞，造成不可逆性的损害员员。有研究发现，使用悦葬泽责葬泽藻的抑制剂可阻止局灶性脑缺血鼠发生迟发性神经元死亡，有效地抑制凋亡，缩小脑梗死体积，改善预后员圆。本实验结果显示大鼠脑缺血再灌注后悦葬泽责葬泽藻?猿表达增加，与假手术组比较差异有统计学意义，证实了细胞悦葬泽责葬泽藻?猿阳性表达与细胞凋亡的一致。摇摇参附注射液主要成分为人参皂苷和乌头碱，分别为红参和黑附片的提取物。参附注射液对脑、心、肝、肾缺血再灌注损伤、休克等具有一定的保护作用员猿。而参附注射液对神经细胞凋亡的影响目前国内报道较少，对神经细胞悦葬泽责葬泽藻?猿表达的影响更是未见报道。本研究发现参附注射液治疗组大鼠海马悦粤员区神经细胞悦葬泽责葬泽藻?猿的表达与模型组比较降低，并且差异有统计学意义，提示参附注射液对脑缺血再灌注后悦粤员区神经细胞的保护作用可能是通过影响凋亡基因悦葬泽责葬泽藻?猿的表达，从而在一定程度上抑制了神经细胞凋亡，发挥其保护脑组织的作用。参摇考摇文摇献员吴红金，余少平，谢芳援参附注射液的临床应用与机制研究允援中国自然医学杂志，圆园园源，远（圆）：员圆园?员圆猿援圆王庆九援参附注射液对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的干预作用允援中国妇幼保健，圆园园怨，圆源（圆猿）：猿猿园源?猿猿园远援猿蕴燥灶早葬耘在，宰藻蚤灶泽贼藻蚤灶孕砸，悦葬则造泽燥灶杂，藻贼葬造援砸藻增藻则泽蚤遭造藻皂蚤凿凿造藻糟藻则藻鄄遭则葬造葬则贼藻则赠燥糟糟造怎泽蚤燥灶憎蚤贼澡燥怎贼糟则葬灶蚤藻糟贼燥皂赠蚤灶则葬贼泽允援杂贼则燥噪藻，员怨愿怨，圆园（员）：愿源?怨员援源孕藻灶早允，酝葬燥载韵，杂贼藻增藻灶泽燥灶云云，藻贼葬造援栽澡藻澡藻则遭蚤糟蚤凿藻责葬则葬择怎葬贼蚤灶凿怎糟藻泽凿燥责葬皂蚤灶藻则早蚤糟灶蚤早则葬造葬责燥责贼燥泽蚤泽贼澡则燥怎早澡泽怎泽贼葬蚤灶藻凿葬糟贼蚤增葬贼蚤燥灶燥枣贼澡藻允晕运责葬贼澡憎葬赠允援允月蚤燥造悦澡藻皂，圆园园源，圆苑怨（猿员）：猿圆远圆缘?猿圆远猿圆援缘运怎贼怎噪韵，孕燥造蚤郧，月葬泽葬早葬匀援砸藻泽增藻则葬贼则燥造责则燥贼藻糟贼泽葬早葬蚤灶泽贼澡赠凿则燥曾赠灶燥灶藻鄄灶葬蚤灶凿怎糟藻凿葬责燥责贼燥泽蚤泽遭赠遭造燥糟噪蚤灶早允晕运葬灶凿糟?允哉晕孕粤孕圆员泽蚤早灶葬造蚤灶早允援栽燥曾蚤糟燥造杂糟蚤，圆园园远，怨园（员）：员圆园?员猿圆援远杂燥造葬则燥早怎陨，栽泽怎遭燥噪葬憎葬栽，悦葬澡蚤造造允，藻贼葬造援粤灶贼蚤?葬责燥责贼燥贼蚤糟藻枣枣藻糟贼燥枣早则葬灶鄄怎造燥糟赠贼藻糟燥造燥灶赠泽贼蚤皂怎造葬贼蚤灶早枣葬糟贼燥则葬枣贼藻则枣燥糟葬造糟藻则藻遭则葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬蚤灶贼澡藻则葬贼允援晕藻怎则燥泽糟蚤藻灶糟藻，圆园园远，员源猿（源）：怨远缘?怨苑源援苑杂澡蚤皂蚤扎怎匀，韵澡早燥澡酝，陨噪藻凿葬酝，藻贼葬造援悦葬泽责葬泽藻?猿?造蚤噪藻责则燥贼藻葬泽藻葬糟贼蚤增蚤贼赠?蚤灶凿藻责藻灶凿藻灶贼葬责燥责贼燥泽蚤泽葬贼贼澡藻燥灶泽藻贼燥枣灶藻怎则燥灶葬造糟藻造造凿藻葬贼澡蚤灶贼澡藻早藻则鄄遭蚤造澡蚤责责燥糟葬皂责怎泽葬枣贼藻则早造燥遭葬造蚤泽糟澡藻皂蚤葬允援月