丹参注射液对糖尿病模型大鼠脊髓背角神经元凋亡及cyclinD1 表达的影响.pdf

表1摇超临界CO2萃取缬草油GC鄄MS成分分析结果(续表1)摇序号化合物名称分子式相对分子质量相对含量/%48Cyclohexane,1,1,2鄄trimethyl鄄3,5鄄bis(1鄄methylethenyl)鄄,(2琢,3茁,摇5茁)鄄C15H262060.1749十六烷酸C16H32O22560.46501鄄乙炔基鄄3,5鄄二甲基金刚烷C14H201884.9451异环化枸橼醛C10H16O1524.54萜和倍半萜为主。主要成分为缬草烯酸、缬草酮和阔叶缬草甘醇等3,笔者在本实验中鉴定了51个化合物,其中乙酸龙脑酯含量高达27.82%,其次为1鄄丙基鄄3丙烯基金刚烷,含量为14.02%,与文献报道有较大差别。DOI摇10.3870/yydb.2009.11.006参考文献1摇李摇颖,薛存宽,何学斌,等.99mTc鄄ECD示踪评价缬草提取物对小鼠脑血流灌注的影响J.放射学实践,2003,19(2):133-135.2摇袁珊琴.缬草属植物化学和药理学研究进展J.国外医学药学分册,1992,19(6):346-351.3摇石晋丽,刘摇勇,肖培根.缬草属植物化学成分与药理作用J.国外医药植物药分册,2003,18(6):231-239.丹参注射液对糖尿病模型大鼠脊髓背角神经元凋亡及cyclinD1表达的影响*杨颖聪,周青山,王摇龙(武汉大学人民医院麻醉科,430060)摘摇要摇目的摇研究丹参注射液对糖尿病大鼠脊髓背角神经元凋亡及cyclinD1表达的影响及其机制。方法摇成年雄性Wistar大鼠30只,随机分为糖尿病模型组(A组)、丹参治疗组(B组)和正常对照组(C组)各10只。A组和B组腹腔注射链脲佐菌素(STZ)60mgkg鄄1建立糖尿病模型,分别于注射STZ前及注射后1,2,3,4,5周测定大鼠右后爪缩足反应阈值。B组机械性痛阈8g开始腹腔注射丹参注射液3mLkg鄄1,qd,连续4周。于注射STZ后5周处死大鼠,取L46脊髓,采用尼氏染色法光镜下观察脊髓背角组织病理学变化,TUNEL原位末端标记法检测脊髓背角神经元凋亡,免疫组化法测定脊髓背角神经元cyclinD1表达。结果摇与C组比较,A组与B组机械性痛阈降低,脊髓背角组织病理学损伤明显,神经元凋亡指数及cyclinD1表达均升高(均P0.05)；与A组比较,B组经丹参注射液治疗4周后机械性痛阈升高,脊髓背角组织病理学损伤减轻,神经元凋亡指数及cyclinD1表达均低于A组(均P0.05)。结论摇丹参注射液对糖尿病神经病变有一定保护作用,能够减轻神经病理性疼痛,其机制可能与下调脊髓背角神经元cyclinD1表达、抑制神经元凋亡有关。关键词摇丹参注射液；糖尿病；神经病变；脊髓；细胞凋亡中图分类号摇R745；R965摇摇摇文献标识码摇A摇摇摇文章编号摇1004鄄0781(2009)11鄄1410鄄04EffectofRadixSalviaeMiltiorrhizaeonApoptosisandCyclinD1ExpressionofSpinalDorsalHornNeuronsinDiabeticRatsYANGYing鄄cong,ZHOUQing鄄shan,WANGLong(DepartmentofAnesthesiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)ABSTRACT摇Objective摇ToinvestigatetheeffectofRadixsalviaemiltiorrhizaeonapoptosisandcyclinD1expressionofspinaldorsalhornneuronsindiabeticrats.摇Methods摇ThirtymaleWistarratsweighing180220gwererandomlydividedinto3groups(n=10each):groupA(diabetesmellitus),groupB(diabetesmellitus+radixsalviaemiltiorrhizae)andgroupC(normalcontrol).Diabetesmellituswasinducedbyintraperitonealinjectionwithstreptozotocin(STZ)60mgkg鄄1inrats.3mLkg鄄1Radixsalviaemiltiorrhizaewasgivenintraperitoneally1weekafterSTZinjection,q.d.for4weeksingroupB.Pawwithdrawthreshold(PWT)wascalculatedbyvonFreyfilamentsbeforeand1,2,3,4and5wafterSTZinjection.Allratswerekilled5weeksafterSTZinjectionandlumbarsegmentofspinalcordwasremovedfordetectionofapoptosisinspinaldorsalhornneurons(TUNEL)anddeterminationofcyclinD1expressionbyimmunohistochemistry.摇Results摇ComparedwithgroupC,0141HeraldofMedicineVol郾28No郾11November2009PWTwaslower,thehistopathologicaldamageinspinaldorsalhornwasvisible,apoptoticindexandcyclinD1expressionwereincreasedsignificantlyingroupAandB(P0.05).WhilecomparedwithgroupA,PWTwasincreased,thehistopathologicaldamagewasattenuated,apoptoticindexandlevelofcyclinD1weredecreasedsignificantlyingroupB(P0.05).摇Conclusion摇Radixsalviaemiltiorrhizaecanattenuatethespinaldorsalhornneuronalapoptosisthroughdown鄄regulationofcyclinD1expressionindiabeticrats.KEYWORDS摇Radixsalviaemiltiorrhizae；Diabetes；Neuropathy；Spinaldorsalhorn；Apoptosis摇摇糖尿病痛性神经病变是糖尿病患者最常见的慢性并发症之一,主要表现为肢体自发性疼痛、痛觉过敏和痛觉超敏。围绕糖尿病痛性神经病变发病机制的研究主要集中在外周神经系统,中枢神经系统在其发病中的作用却少有研究。笔者最近的研究发现,脊髓在糖尿病痛性神经病变发病过程中起着重要作用,脊髓背角汇集了大部分初级伤害性感受传入神经元,脊髓背角神经元凋亡可能参与了糖尿病痛性神经病变的病理生理过程1。但是引起脊髓背角神经元凋亡的具体机制尚未完全清楚。笔者在本实验中将从神经元细胞周期再进入的角度探讨丹参注射液对糖尿病痛性神经病变大鼠脊髓背角神经元的保护作用。1摇材料与方法摇1.1摇试药摇链脲佐菌素(STZ,购自美国Sigma公司),复方丹参注射液(正大青春宝药业有限公司生产,批号:Z33020177),CyclinD1免疫组化试剂盒及TUNEL凋亡检测试剂盒(购自北京中杉生物技术公司),Vonfery纤维(加拿大NorthCoastMedical公司生产)。1.2摇动物摇健康雄性Wistar大鼠30只(SPF级),体质量190220g,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,动物合格证号:SCXK(鄂)2003鄄0005。实验动物在武汉大学人民医院实验动物中心饲养,饲养环境符合SPF级要求。1.3摇实验方法摇1.3.1摇动物模型的建立摇20只成年雄性Wistar大鼠,一次性腹腔注射STZ60mgkg鄄1,72h后经尾静脉采血测随机血糖,血糖逸16.7mmolL鄄1大鼠设为建模成功纳入实验。1.3.2摇实验分组摇糖尿病模型建立成功后,随机分为糖尿病模型组(A组)和丹参处理组(B组)各10只,另设10只同月龄Wistar大鼠为正常对照组(C组)。B组机械性痛阈8g开始腹腔注射丹参注射液,3mLkg鄄1,qd,连续4周。所有大鼠饲养期间自由摄收稿日期摇2008鄄12鄄25基金项目摇*湖北省自然科学基金资助项目(基金编号:2007ABA219)作者简介摇杨颖聪(1981-),女,湖北武汉人,住院医师,硕士,从事麻醉科临床工作。电话81026,E鄄mail:。食、饮水。1.3.3摇机械性痛阈的测定摇于注射STZ前及注射后1,2,3,4,5周采用Vonfery纤维按up鄄and鄄down法测定大鼠右后爪缩足反应阈值(pawwithdrawthreshold,PWT)2。1.3.4摇标本的制作及处理摇于注射STZ后5周经腹腔注射水合氯醛350mgkg鄄1麻醉大鼠,剖胸后经心脏升主动脉插管,以200mL肝素0.9%氯化钠溶液冲洗后,再以4%多聚甲醛液200mL灌注固定。取L46段脊髓置于4%多聚甲醛液中固定12h,常规石蜡包埋,制成厚3滋m石蜡切片。1.3.5摇指标测定摇采用尼氏染色法(缓冲亚甲蓝染色法),光镜下观察脊髓组织病理学变化；采用TUNEL原位末端标记法检测脊髓背角神经元凋亡情况,光镜下(伊40)每张切片选取5个视野计数阳性细胞,计算凋亡指数(凋亡细胞数/细胞总数伊100%)；采用免疫组化SP法测定脊髓背角神经元中CyclinD1表达,光镜下(伊40)每张切片选取5个视野计数阳性细胞,以(CyclinD1阳性细胞数/细胞总数伊100%)表示CyclinD1表达水平。1.4摇统计学方法摇采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数依标准差(x依s)表示,采用单因素方差分析,组间比较采用成组t检验,P0.05表示差异有显著性。2摇结果摇2.1摇机械性痛阈摇与C组比较,A组与B组在注射STZ后15周PWT降低(均P0.05),且A组PWT呈持续性降低；与A组比较,B组经丹参注射液治疗3周后PWT开始升高(P0.05),但仍较C组低(P0.05),见表1。2.2摇脊髓病理学改变摇C组脊髓背角神经元结构未见明显异常,尼氏体清晰可见,见图1；A组脊髓背角神经元数量减少,部分细胞核仁消失,尼氏体溶解或聚集成块,见图2；B组脊髓背角部分神经元胞核模糊,尼氏体变形或凝固,见图3；与A组比较,B组脊髓背角神经元病变较轻,神经元数量增加,尼氏体形态完整(箭头所指为尼氏体)。2.3摇免疫组化与TUNEL染色结果摇C组大鼠脊髓背1141医药导报2009年11月第28卷第11期角有少量CyclinD1阳性细胞(3.0依0.8)%,A组糖摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇表1摇3组注射STZ前后PWT测定结果摇g,x依s组别大鼠/只注射前注射后1周2周3周4周5周A组1014.4依1.67.2依1.4*14.6依1.9*13.1依1.7*12.6依1.6*12.2依1.4*1B组1014.4依1.67.2依1.4*15.6依1.6*14.8依1.7*15.6依1.6*1,26.0依1.6*1,2C组1014.2依1.514.2依1.514.6依1.314.0依1.314.2依1.513.8依1.5摇摇与C组比较,*1P0.05,与A组比较,*2P0.05摇摇图1摇光镜下C组脊髓背角形态学摇摇摇摇图2摇光镜下A组脊髓背角形态学摇摇摇摇图3摇光镜下B组脊髓背角形态学摇摇摇摇(缓冲亚甲蓝染色,伊200)摇摇摇摇摇摇(缓冲亚甲蓝染色,伊200)摇摇摇摇摇摇摇摇(缓冲亚甲蓝染色,伊200)尿病大鼠脊髓背角CyclinD1阳性细胞表达(27.3依3.5)%显著增加,B组经丹参注射液治疗4周后,脊髓背角CyclinD1阳性细胞数目(15.2依2.5)%较A组明显减少(P0.05)。C组脊髓背角几乎未见凋亡细胞凋亡指数(2.5依0.8)%,A组大鼠脊髓背角可见较多凋亡小体,凋亡指数(8.9依1.5)%明显上升,B组经丹参注射液治疗4周后,脊髓背角凋亡小体密度减少,凋亡指数(5.9依1.0)%较A组减少(P16.7mmolL鄄1,注射后7d出现机械性痛阈降低,表明成功制备了糖尿病痛性神经病变模型。本研究中大鼠注射STZ后1周开始出现痛觉超敏,A组机械性痛阈持续降低,脊髓病理学观察显示脊髓背角萎缩,神经元数量明显减少,部分细胞核仁消失,尼氏体溶解或聚集成块,凋亡小体增多,凋亡指数升高。表明在糖尿病大鼠痛觉超敏的形成过程中,脊髓背角神经元凋亡起着重要作用。脊髓背角汇集了大部分初级伤害性感受传入纤维,脊髓背角神经元凋亡,神经元数量减少可能通过某种途径使痛觉传递发生改变,痛阈降低,从而导致糖尿病痛性神经病变。CyclinD1是调节G1/S期的细胞周期蛋白,是决定细胞周期能否开始的启动因子。细胞在增殖分裂信号的刺激下,CyclinD1表达增加,与其伴侣分子CDK4或CDK6结合形成CyclinD1鄄CDK4/CDK6激酶复合物,在CAK协同下使下游的Rb磷酸化,磷酸化的Rb构象发生改变,释放其结合的核转录因子E2F,游离的E2F可促使许多与DNA复制有关的基因表达,使细胞顺利通过G1/S调控点,进入自主分裂程序3。成熟神经元是失去分裂增殖能力的高度分化细胞,进入周期后向细胞发出错误的增殖信号,通过某种机制诱导自身的凋亡4。将转染了DN(domainnegative)CDK4的小脑颗粒细胞置于缺氧环境下,结果发现表达DNCDK4的神经元存活率远高于未转录组；CyclinD1表达缺失的小鼠小脑颗粒细胞对缺氧也具有很强的耐受力5。在脑缺血患者中观察到CyclinD1鄄CDK4表达增加,并可诱导神经元凋亡,且其凋亡可被抗凋亡因子Bcl鄄2阻断6。这些研究提示CyclinD1鄄CDK4参与了缺血缺氧引起的神经元凋亡过程。本研究中A组大鼠机械性痛阈明显降低,脊髓背角CyclinD1表达增加,神经元凋亡指数上升,表明高血糖可能是通过上调脊髓背角CyclinD1表达而导致脊髓神经元凋亡。高血糖通过激活多元醇、PKC和MAPK通路,以及增加糖基化终产物,促进氧化应激7；糖尿病微血管病变导致神经内膜毛细血管壁增厚,血小板及红细胞聚集,一氧化氮及前列腺素合成减少,内皮素合成增加,降低了血管扩张2141HeraldofMedicineVol郾28No郾11November2009能力,使血流降低,神经内膜血供减少8。双方面共同作用的结果可能导致糖尿病大鼠脊髓背角神经元CyclinD1表达增加并促进神经元凋亡,其分子机制有待进一步探索。丹参注射液是常用活血化瘀中药,具有抗氧化和改善微循环的作用,在低氧缺血性脑病大鼠模型中发现在低氧缺血前给予大鼠丹参注射液预处理和低氧缺血后继续治疗,丹参注射液能减轻脑损伤,有部分神经保护效应9。笔者在本研究中发现丹参注射液可以部分恢复糖尿病大鼠机械性痛阈,减轻神经行为学功能障碍和脊髓病理学损伤,降低脊髓背角CyclinD1表达,抑制神经元凋亡,对糖尿病神经病变有一定的神经保护作用。丹参可能是通过抗氧化应激和扩张微血管的作用,改善了机体缺血缺氧环境,使脊髓背角CyclinD1的表达下调,抑制神经元凋亡,从而保护神经功能。具体机制有待进一步探讨。综上所述,丹参注射液对糖尿病神经病变有一定保护作用,能够减轻神经病理性疼痛,其机制可能与改善机体缺血缺氧环境,下调脊髓CyclinD1表达,抑制神经元凋亡有关。DOI摇10.3870/yydb.2009.11.007参考文献1摇潘雪莲,周青山,杜大萍.丹参酮IIA对糖尿病大鼠神经病理性疼痛的影响J.中华麻醉学杂志,2006,26(8):692-695.2摇王汉兵,王焱林,欧伟明,等.糖尿病周围神经病变大鼠疼痛模型的建立J.中国疼痛医学杂志,2007,13(1):43-45.3摇JOHNSONDG,WALKERCL.Cyclinsandcellcyclechec鄄kpointsJ.AnnuRevPharmaeolToxicol,1999,39:295-312.4摇LOVES.Neuronalexpressionofcel1cycle鄄relatedproteinsafterbrainischaemiainmanJ.NeurosciLett,2003,353:29-32.5摇RASHIDIANJ,IYIRHIAROG,ALEYASINH,etal.Mul鄄tiplecyclin鄄denpendentkinasessignalsarecriticalmediatorsofischemia/hypoxicneuronaldeathinvitroandinvivoJ.PNAS,2005,102(39):14080-14085.6摇BECKEREB,BONNIA.Beyondproliferatiorr鄄cellcyclecontro1ofneuronalsurvivalanddiferentiationinthedevelopingmammalianbrainJ.SeminCellDevBiol,2005,16:439-448.7摇VINCENTAM,RUSSELLJW.Oxidativestressinthepathogenesisofdiabeticneuropat