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CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究 -- 260 元

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硕士学位论文论文题目CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究研究生姓名郭豆豆指导教师姓名赵文理专业名称儿科学研究方向小儿血液与肿瘤论文提交日期2013年3月CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究中文摘要ICD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究中文摘要目的探究CD1332在儿童B系急性淋巴细胞白血病(BALL)发病中的表达规律、CD1332白血病细胞的生物学特性和调控该群细胞的信号通路相关分子,为鉴定CD1332是否为儿童BALL白血病干细胞(LSC)的一项标志和阐明其调控的分子机制奠定实验基础。方法1、流式细胞术检测42例初诊和复发的BALL患儿及10例对照组儿童的骨髓(BM)单个核细胞(MNCs)的CD1331、CD1332表达,并观察其与临床预后指标的相关性。2、选取6例CD1332阳性表达表达比例≥20的BALL患儿的新鲜骨髓标本,用磁珠分选(MACS)分离纯化出CD1332CD19、CD1332CD19、CD1332CD19、CD1332CD19四组亚群细胞,进行体外含血清悬浮培养,观察其增殖能力,RTPCR检测融合基因的表达。对其中3例磁珠分选的四组亚群细胞行甲基纤维素半固体培养,观察其集落形成能力。3、采用实时定量PCR技术对3例BALL患儿的CD1332CD19、CD1332CD19、CD1332CD19、CD1332CD19细胞亚群分别进行干细胞相关信号通路的基因表达筛查,并重点分析CD1332CD19细胞群的相关信号通路分子。结果1、流式细胞术结果显示CD1331、CD1332在BALL中的表达水平明显高于正常对照骨髓中的表达水平,差异具有显著统计学意义(P0.01)在BALL中,CD1332的阳性表达率和表达水平均较CD1331高,差异具有统计学意义(P<0.05)儿童BALL中CD1332的表达与患儿发病时的性别、年龄、初诊白细胞数、危险等级、融合基因、细胞遗传学改变及完全缓解率等临床预后指标均无相关性。中文摘要D1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究II2、体外悬浮培养结果显示CD1332CD19细胞群在培养中呈倍数增长趋势,在第6周时扩增了(117.9±72.51)倍(有10倍到226倍的扩增),而其他三组细胞未出现明显的增殖,差异具有显著统计学意义(P0.01)。一例初诊时E2A/PBX1融合基因阳性的患儿,其分选后的细胞亚群经悬浮培养4周后,RTPCR检测到E2A/PBX1基因阳性仍存在于CD1332CD19细胞群。3、体外半固体集落培养结果显示CD1332CD19细胞群在培养后第7天时混合集落(细胞数≥40)增长到(55±5.57)个,培养到第14天时达到(215±18.68)个CD1332CD19细胞在培养第7天时混合集落为(11±2.65)个,之后未再增多。而其他两组细胞培养2周均未出现集落。各群细胞差异具有明显的统计学意义(P<0.01)。4、实时定量PCR检测结果显示CD1332CD19细胞群为实验组与CD1332CD19、CD1332CD19、CD1332CD19三组对照组细胞相比,基因表达差异主要分布于Wnt、TGFβ、FGF、Hedgehog(Hh)及Notch信号通路,主要涉及TGFβ、Wnt和FGF信号通路中的BMPR1B、SMAD6、SMAD9、RGMA、TCF7L2、FZD8及FGFR2等分子。结论1、儿童BALL中CD1332异常高表达,它与患儿初诊时的性别、年龄、初诊白细胞数、危险等级、融合基因、细胞遗传学改变及完全缓解率等临床预后指标均无相关性。2、儿童BALL中CD1332CD19细胞群体外培养显示,其具有长期增殖和多向分化能力,具备LSC生物学特性,可能是儿童BALL的LSC表型标志。3、儿童BALL的CD1332CD19细胞群的调控可能与Wnt、TGFβ、FGF、Hedgehog(Hh)及Notch信号通路的异常密切相关,主要涉及TGFβ、Wnt和FGF信号通路中的BMPR1B、SMAD6、SMAD9、RGMA、TCF7L2、FZD8及FGFR2等分子。关键词CD1332儿童B系急性淋巴细胞白血病预后白血病干细胞信号通路作者郭豆豆指导教师赵文理CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究英文摘要IIIEffectofCD1332onthePathogenesisofChildhoodBlineageAcuteLymphoblasticLeukemiaanditsMechanismAbstractObjectiveExpressionofCD1332,thebiologicalcharacteristicsandsignaltransductionpathwaysofCD1332positiveleukemiacellsinchildhoodBlineageacutelymphoblasticleukemiaBALLwereexploedsothatCD1332wasprovedtobeamarkerofleukemiastemcellLSCanditsmolecularpathogenesiswasclarified.Methods1.ExpressionsofCD1331andCD1332weredetectedbyflowcytometryfrom42casesofnewlydiagnosedchildhoodBALLand10casesofcontrolgroup.Furthermore,thecorrelationbetweenCD133expressionandclinicalfeatureswasanalysed.2.CD1332CD19,CD1332CD19,CD1332CD19,CD1332CD19cellsthatcamefrom6casesofchildhoodBALLweresortedbyMagneticActiveCellSortingMACS.MeantimetheywereculturedinRPMI1640mediumwithFBS.Sortedcellsfrom3casesofchildhoodBALLwereculturedinmethylcellulosesemisolidmedium.Theabilityofcoloniesformingwasanalysed.3.ThekeymoleculesofstemcellsignalingpathwayofCD1332CD19cellsweretestedbyRealtimequantitativePCRarray.CD1332CD19,CD1332CD19,CD1332CD19subgroupswereregardsascontrolgroup.Results1.ExpressionlevelsofCD1331andCD1332inchildhoodBALLweresignificantlyhigherthanthoseofcontrolgroupP0.01TheexpressionratesandlevelsofCD1332werehigherthanthoseofCD1331inBALLP0.05.TherewasnorelevancebetweenexpressionofCD1332andsex,age,whitebloodcellcount,riskstratification,fusiongene,cytogenetics,andtheCRrateinchildhoodBALL.2.InsuspensioncultureofCD1332CD19cells,therewasa10to226foldexpansionatweek6.ThisexpansionwassignificantlyhigherthantheothersubgroupsP0.01.AcasewithabnormalgeneexpressionE2A/PBX1atdiagnose,thesame英文摘要D1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究IVE2A/PBX1wasfoundafter4weekscultureinCD1332CD19subfraction.3.ThecolonynumbersofCD1332CD19subfractionwere55±5.57and215±18.68onthe7thand14thdayrespectivelyincolonyculture.ThecolonynumberofCD1332CD19subfractionwas11±2.65onthe7thday,laternomoreexpansion.WhiletheothertwosubfractionsdidnotformcoloniesP0.01.4.ComparedwiththeCD1332CD19,CD1332CD19,CD1332CD19subfractions,CD1332CD19subfractionmainlyexistedinabnormalgenesinvolvedinWnt,TGFβ,FGF,Hedgehog(Hh)andNotchsignalingpathways.Conclusion1.ExpressionofCD1332wasabnormallyhighinchildhoodBALL.TherewasnorelevancebetweenexpressionofCD1332andsex,age,whitebloodcellcount,riskstratificationfusiongene,cytogenetics,andtheCRrateinchildhoodBALL.2.CD1332CD19cellsownedlongtermrepopulationandmultipledifferentiationabilityinvitro,anditmaypossessthecharacteristicsofLSCinchildhoodBALL.3.Wnt,TGFβ,FGF,Hedgehog(Hh)andNotchsignalingpathwaysmaybeplayimportantrolesinCD1332CD19subgroup.KeywordsCD1332ChildhoodBlineageAcuteLymphoblasticLeukemiaPrognosisLeukemiaStemCellSignalingPathwayWrittenbyGuoDoudouSupervisedbyZhaoWenli目录序言..........................................................................................................................1第一部分CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病的表达及其生物学特性......3一、材料和方法...........................................................................................................3二、结果...................................................................................................................11三、讨论..................................................................................................................18四、结论..................................................................................................................21参考文献.....................................................................................................................21第二部分儿童B系急性淋巴细胞性白血病CD1332白血病细胞的信号通路初步研究.....................................................................................................24一、材料和方法.........................................................................................................24二、结果..................................................................................................................28三、讨论..................................................................................................................32四、结论..................................................................................................................36参考文献.....................................................................................................................36全文结论........................................................................................................................39综述........................................................................................................................40中英文对照缩略词表.....................................................................................................49攻读学位期间公开发表的论文......................................................................................51致谢........................................................................................................................52CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究序言1序言急性淋巴细胞白血病(ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤,虽然近年危险分层和支持技术的持续改进已使80%左右的BALL患儿长期无病生存,甚至治愈,但是仍有20%左右的病例复发,而复发后的治疗给血液学工作者带来巨大的挑战。因为复发时白血病细胞对化疗药多已耐药,化疗难以发挥作用,造血干细胞移植又因供者来源和高昂治疗费用等的限制,难以普遍开展,所以儿童ALL治疗的难题在于复发,必须寻找复发的根源,才能有针对性地提出新的治疗方法。研究表明,白血病患者体内存在一群极微量的细胞群,约占所有白血病细胞的0.1%~1%,这些细胞通常对化疗药物不敏感,是导致白血病复发的根源之一。它们无论在体外长期的细胞培养中还是动物模型体内都能引发白血病,这群细胞被称为白血病干细胞(leukemiastemcell,LSC)1。抗癌药物虽然能够杀灭大量白血病细胞,但难以杀灭其中的微量残留病(MRD)细胞,尤其是LSC,从而造成白血病的复发。CD133抗原是一种分子量约为150kb的糖蛋白,由一条长865个氨基酸的多肽链组成,含5个跨膜(TM)区,是新TM受体超家族成员。1997年Yin和Miraglia等发现了一种新的造血干细胞/祖细胞(HSC/HPC)表面标志AC133蛋白,该蛋白在2000年第七届国际白细胞分化抗原工作组会议上被正式命名为CD133,并被认为是多种干/祖细胞的表面标志之一23。目前发现人CD133有两种亚型CD1331和CD1332,其基因分别定位在人类的4号和2号染色体上,CD1332基因比CD1331基因少1个27bp的4号外显子4。Gallacher等5研究发现,从CD34CD38Lin细胞群中分选出的一小群具有CD133CD7的细胞群能高度富集CD34干细胞,也是CD34CD38Lin细胞群中唯一能在体外培养中产生CD34细胞的细胞亚型,将此群细胞移植入NOD/SCID小鼠骨髓8周后,比CD133CD7细胞扩增了400倍,该结果提示CD133细胞含有比CD34更原始的造血干/祖细胞,CD133可能是比CD34更为原始的造血干/祖细胞表面标记。而后,有学者从脑肿瘤6、乳腺癌7、前列腺癌8、肝癌9、脑胶质瘤10、结肠癌11等肿瘤中也分离出具有肿瘤干细胞特性的CD133阳性细胞。因此,CD133目前已被认定为是多种肿瘤干细胞(CSC)的表面标志分子。序言D1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究2研究表明,CD133在急性白血病(AL)中高表达。Wuchter等12检测了298份AL患者CD133的表达情况,发现其中有114份(38)CD133为阳性表达,且在AML中CD133明显在CD34细胞中高表达。天津血研所对76例急性白血病(AL)患者骨髓白血病细胞表面的CD133表达水平研究发现,AL患者CD133的中位表达率为19.3(0.0190.52),而正常对照组的中位表达率为0.29(0.010.57),CD133在AL中的阳性表达率显著高于正常对照组,其中AML的CD133阳性表达率为43.4,ALL的CD133表达阳性率为38.113。国内唐文钰等14检测了34例儿童ALL骨髓细胞的CD133mRNA阳性表达率显著高于对照组。2009年COX等15在对BALL儿童研究中,将分离纯化后不同免疫表型的白血病细胞亚群植入NOD/SCID小鼠体内后观察到,能发生有效增殖的细胞是CD133CD19亚群,说明儿童BALL的白血病干细胞具有CD133CD19表型特征。这些研究结果提示CD133很可能是急性白血病干细胞的表面标记物。我们在前期研究中以B系急性淋巴细胞性白血病(BALL)患儿骨髓MNCs为研究对象,利用流式细胞术检测CD1331、CD1332的表达,结果显示CD1332阳性率(62.5)高于CD1331的阳性率(39.6,且表达水平也高于CD1331组,差异具有统计学意义。经诱导化疗后,CD1332的表达水平相对CD1331下降较缓慢,且CD1332的表达与微量残留病(MRD)水平有显著相关性。这些结果说明CD1332分子对评估儿童BALL预后可能更有价值。故本课题通过流式细胞术检测BALL患儿白血病细胞表面的CD1332的表达情况。然后应用免疫磁珠分选法分离纯化BALL患儿的骨髓MNCs为CD1332CD19、CD1332CD19、CD1332CD19、CD1332CD19四群细胞,对各亚群细胞进行体外悬浮和集落培养,观察其生长增殖能力进行体外白血病干细胞的生物学特性鉴定。在此基础上,应用实时定量PCR对分离纯化后的细胞进行干细胞相关信号通路的基因表达检测,为儿童BALLLSC标志物的开发和儿童BALL复发机制的阐明奠定实验基础。CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究第一部分3第一部分CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病的表达及其生物学特性一、材料和方法(一)研究对象1、白血病患儿临床资料选取苏州大学附属儿童医院血液科自2012年3月至2012年12月收治的经细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子生物学(MICM)确诊的B系急性淋巴细胞性白血病(BALL)患儿42例(含复发患儿3例),男22例,女20例,平均年龄5.3岁(1.2岁12岁)。所有患儿均采用CCLG2008方案危险分层和治疗。另外,选取本院同期诊治的单纯性缺铁性贫血患儿10例作为对照,男6例,女4例,中位年龄4.1岁(11月14岁)。具体临床资料见表1。表1流式细胞术检测的BALL患儿临床资料总数42性别男22女20ALL危险度标危14中危15高危8复发3放弃a2染色体正常核型24异常核型18融合基因BCRABL1MLL4其他b18正常19白细胞≥100109/L9100109/L33强的松预处理敏感35不敏感7D33缓解情况完全缓解39未缓解3D33的MRD<10418≥10424a未完成诱导化疗。b包括HOX115例、TEL/AML18例、E2A/PBX15例。
编号:201403192117530442    大小:2.29MB    格式:PDF    上传时间:2014-03-19
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vyyolyg827上传于2014-03-19

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