CD1332在儿童B系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究

硕士学位论文 论文题目 CD133-2在儿童 B系急性淋巴细胞性白血病 发病中的作用及其机制初步研究 研究生姓名 郭豆豆 指导教师姓名 赵文理 专 业 名 称 儿科学 研 究 方 向 小儿血液与肿瘤 论文提交日期 2013年 3月 CD133-2 在儿童 B 系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究 中文摘要 I CD133-2在儿童 B系急性淋巴细胞性白血病发病中的 作用及其 机制 初步研究 中文摘要 目的： 探究 CD133-2在儿童 B系急性淋巴细胞白血病（ B-ALL）发病中的表达规律、 CD133-2+白血病细胞的生物学特性和调控该群细胞的信号通路相关分子，为鉴定 CD133-2是否为儿童 B-ALL白血病干细胞（ LSC）的一项标志和阐明其调控的分子机制奠定实验基础。 方法： 1、 流式细胞术检测 42例 初诊和复发的 B-ALL患儿 及 10例 对照组儿童的 骨髓（ BM）单个核细胞（ MNCs） 的 CD133-1、 CD133-2表达 ， 并观察其与临床预后指标的相关性 。 2、 选取 6例 CD133-2阳性表达 (表达 比例 20%)的 B-ALL患儿 的新鲜 骨髓标本 ，用 磁珠 分选（ MACS） 分离纯化出 CD133-2+CD19+、 CD133-2+CD19-、 CD133-2-CD19+、CD133-2-CD19-四组 亚群细胞 ， 进行 体外 含 血清 悬浮培养，观察 其 增殖能力 ， RT-PCR检测 融合基因的表达 。 对其中 3例 磁珠分选 的四组 亚群细胞 行 甲基纤维素 半固体 培养，观察其集落形成能力。 3、采用 实时定量 PCR技术对 3例 B-ALL患儿的 CD133-2+CD19-、 CD133-2+CD19+、CD133-2-CD19+、 CD133-2-CD19-细胞 亚群 分别进行 干细胞相关 信号 通路的 基因表达筛查 ， 并重点分析 CD133-2+CD19-细胞群的 相关信号 通路分子 。 结果 ： 1、流式细胞术 结果显示： CD133-1、 CD133-2在 B-ALL中的表达水平明显高于正常对照骨髓中的表达水平，差异具有 显著 统计学意义（ P 0.01）； 在 B-ALL中， CD133-2的阳性表达率 和表达水平均较 CD133-1高，差异具有 统计学意义 （ P 0.05） ； 儿童B-ALL中 CD133-2的表达 与患儿发病时的 性别、年龄、初诊白细胞数、危险等级 、 融合基因、细胞遗传学改变及完全缓解率 等 临床预后指标均无相关性 。 中文摘要 D133-2 在儿童 B 系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究 II 2、 体外悬浮培养结果显示： CD133-2+CD19-细胞 群 在培养中呈倍数增长趋势，在第 6周时扩增了（ 117.9 72.51）倍（有 10倍到 226倍的扩增 ） ， 而其 他三组细胞未出现 明显的增殖 ，差异具有 显著 统计学意义（ P 0.01） 。 一例初诊时 E2A/PBX1融合基因阳性的患儿，其分选后的细胞亚群经悬浮培养 4周后， RT-PCR检测到 E2A/PBX1基因阳性 仍 存在于 CD133-2+CD19-细胞 群 。 3、 体外半固体 集落培养结果显示 ： CD133-2+CD19-细胞 群 在培养后第 7天时 混合集落（细胞数 40） 增长到（ 55 5.57）个， 培养到第 14天时达到（ 215 18.68） 个；CD133-2+CD19+细胞在培养第 7天时 混合 集落为（ 11 2.65） 个，之后未再增多。而其他 两组细胞培养 2周均未出现集落。 各 群细胞 差异具有明显的统计学意义 （ P0.01） 。 4 、 实时定量 PCR 检 测 结 果 显 示 ： CD133-2+CD19- 细胞 群为实验组 与CD133-2+CD19+、 CD133-2-CD19+、 CD133-2-CD19-三组 对照组 细胞相比 ，基因表达差异 主要分布于 Wnt、 TGF、 FGF、 Hedgehog（ Hh）及 Notch信号通路 ， 主要涉及TGF- 、 Wnt和 FGF信号通路中的 BMPR1B、 SMAD6、 SMAD9、 RGMA、 TCF7L2、FZD8及 FGFR2等分子。 结论： 1、儿童 B-ALL中 CD133-2异常高表达，它与 患儿初诊 时的 性别、年龄、初诊白细胞数、危险等级 、 融合基因、细胞遗传学改变及完全缓解率 等 临床预后指标均无相关性 。 2、儿童 B-ALL中 CD133-2+CD19-细胞群体外培养显示 ，其具有 长期增殖和 多向分化能力，具备 LSC生物 学特性，可能 是儿童 B-ALL的 LSC表型标志 。 3、 儿童 B-ALL的 CD133-2+CD19-细胞 群 的 调控可能与 Wnt、 TGF、 FGF、Hedgehog（ Hh）及 Notch信号通路 的异常密切相关 ， 主要涉及 TGF- 、 Wnt和 FGF信号通路中的 BMPR1B、 SMAD6、 SMAD9、 RGMA、 TCF7L2、 FZD8及 FGFR2等分子。 关键词 ： CD133-2； 儿童 B系 急性淋巴细胞白血病； 预后； 白血病干细胞 ；信号通路 作 者 ： 郭豆豆 指导教师： 赵文理CD133-2 在儿童 B 系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究 英 文摘要 III Effect of CD133-2 on the Pathogenesis of Childhood B-lineage Acute Lymphoblastic Leukemia and its Mechanism Abstract Objective Expression of CD133-2, the biological characteristics and signal transduction pathways of CD133-2 positive leukemia cells in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) were exploed so that CD133-2 was proved to be a marker of leukemia stem cell (LSC) and its molecular pathogenesis was clarified. Methods 1. Expressions of CD133-1 and CD133-2 were detected by flow cytometry from 42 cases of newly diagnosed childhood B-ALL and 10 cases of control group.Furthermore, the correlation between CD133 expression and clinical features was analysed. 2. CD133-2+CD19+,CD133-2+CD19-,CD133-2-CD19+,CD133-2-CD19- cells that came from 6 cases of childhood B-ALL were sorted by Magnetic Active Cell Sorting(MACS).Meantime they were cultured in RPMI-1640 medium with FBS. Sorted cells from 3 cases of childhood B-ALL were cultured in methylcellulose semi-solid medium. The ability of colonies forming was analysed. 3. The key molecules of stem cell signaling pathway of CD133-2+CD19- cells were tested by Real-time quantitative PCR array. CD133-2+CD19+, CD133-2-CD19+, CD133-2-CD19- subgroups were regards as control group. Results 1. Expression levels of CD133-1 and CD133-2 in childhood B-ALL were significantly higher than those of control group (P0.01)；The expression rates and levels of CD133-2 were higher than those of CD133-1 in B-ALL(P 0.05).There was no relevance between expression of CD133-2 and sex,age,white blood cell count,risk stratification, fusion gene,cytogenetics,and the CR rate in childhood B-ALL. 2. In suspension culture of CD133-2+CD19- cells ,there was a 10- to 226-fold expansion at week 6.This expansion was significantly higher than the other subgroups (P0.01).A case with abnormal gene expression(E2A/PBX1) at diagnose ,the same 英 文摘要 D133-2 在儿童 B 系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究 IV E2A/PBX1 was found after 4 weeks culture in CD133-2+CD19- subfraction. 3. The colony numbers of CD133-2+CD19- subfraction were (555.57) and (21518.68) on the 7th and 14th day respectively in colony culture. The colony number of CD133-2+CD19+ subfraction was (112.65) on the 7th day, later no more expansion.While the other two subfractions did not form colonies (P0.01). 4. Compared with the CD133-2+CD19+, CD133-2-CD19+, CD133-2-CD19- subfractions, CD133-2+ CD19- subfraction mainly existed in abnormal genes involved in Wnt, TGF,FGF, Hedgehog（ Hh） and Notch signaling pathways. Conclusion 1. Expression of CD133-2 was abnormally high in childhood B-ALL .There was no relevance between expression of CD133-2 and sex,age,white blood cell count,risk stratification fusion gene,cytogenetics,and the CR rate in childhood B-ALL. 2. CD133-2+CD19- cells owned long-term repopulation and multiple differentiation ability in vitro, and it may possess the characteristics of LSC in childhood B-ALL. 3. Wnt, TGF,FGF, Hedgehog（ Hh） and Notch signaling pathways may be play important roles in CD133-2+CD19- subgroup. Key words: CD133-2； Childhood B-lineage Acute Lymphoblastic Leukemia； Prognosis； Leukemia Stem Cell； Signaling Pathway Written by Guo Doudou Supervised by Zhao Wenli 目 录 序 言 . 1 第一部分 CD133-2在儿童 B系急性淋巴细胞性白血病的表达及其生物学特 性 . 3 一、材料和方法 . 3 二、结 果 .11 三、讨 论 . 18 四、结 论 . 21 参考文献 . 21 第二部分 儿童 B系急性淋巴细胞性白血病 CD133-2+白血病细胞的信号通路 初步研究 . 24 一、材料和方法 . 24 二、结 果 . 28 三、讨 论 . 32 四、结 论 . 36 参考文献 . 36 全文结论 . 39 综 述 . 40 中英文对照缩略词表 . 49 攻读学位期间公开发表的论文 . 51 致 谢 . 52 CD133-2 在儿童 B 系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究 序 言 1 序 言 急性淋巴细胞白血病（ ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤，虽然近年危险分层和支持技术的持续改进 已使 80左右的 B-ALL 患儿长期无病生存， 甚至治愈，但是仍有20左右的病例复发，而复发后的治疗 给血液学工作者带来巨大的挑战。因为复发时白血病细胞对化疗药多已耐药，化疗难以发挥作用，造血干细胞移植又因供者来源和高昂治疗费用等的限制，难 以普遍开展， 所以儿童 ALL 治疗的难题在于复发，必须寻找复发的根源，才能有针对性地提出新的治疗方法。 研究表明，白血病患者 体内存在一群极微量的细胞群，约占所有白血病细胞的0.1 1，这些细胞通常对化疗药物不敏感，是导致白血病复发的根源之一。它们无论在体外长期的细胞培养中还是动物模型体内都能引发白血病 ,这群细胞被称为白血病干细胞（ leukemia stem cell, LSC） 1。抗癌药物虽然能够杀灭大量白血病细胞，但难以杀灭其中的微量残留病（ MRD）细胞，尤其是 LSC，从而造成白血病的复发。 CD133 抗原是一种分子量 约 为 150kb 的糖蛋白， 由一条长 865 个氨基酸的多肽链组成，含 5 个跨膜（ TM）区，是新 TM 受体超家族成员。 1997 年 Yin 和 Miraglia等发现了一种新的造血干细胞 /祖细胞（ HSC/HPC）表面标志 AC133 蛋白，该蛋白在2000 年第七届国际白细胞分化抗原工作组会议上被正式命名为 CD133，并被认为 是多种干 /祖细胞的表面标志之一 2-3。 目前发现 人 CD133 有两种亚型： CD133-1 和CD133-2，其基因分别定位在人类的 4 号和 2 号染色体上， CD133-2 基因比 CD133-1基因少 1 个 27 bp 的 4 号外显子 4。 Gallacher 等 5 研究发现，从 CD34-CD38-Lin-细胞群中分选出 的 一小群具有 CD133+CD7-的细胞群 能 高度富集 CD34+干细胞，也是CD34-CD38-Lin-细胞群中唯一能在体外培养中产生 CD34+细胞的细胞亚型，将此群细胞移植入 NOD/SCID 小鼠骨髓 8 周后，比 CD133-CD7-细胞 扩增了 400 倍， 该结果提示 CD133+细胞含有比 CD34+更原始的造血干 /祖细胞 ， CD133 可能是比 CD34 更为原始的造血干 /祖细胞表面标记 。 而后，有学者从 脑肿瘤 6、乳腺癌 7、前列腺癌 8、肝癌 9、脑胶质瘤 10、结肠癌 11等肿瘤中也分离出具有肿瘤干细胞特性的 CD133 阳性细胞。 因此， CD133 目前已被认定为是 多种 肿瘤干细胞（ CSC）的表面标志分子。 序 言 D133-2 在儿童 B 系急性淋巴细胞性白血病发病中的作用及其机制初步研究 2 研究表明， CD133 在急性白血病（ AL）中高表达。 Wuchter 等 12 检测了 298份 AL 患者 CD133 的表达 情况，发现其中 有 114 份 （ 38%） CD133 为阳性表达 ，且在 AML 中 CD133 明显在 CD34+细胞中高表达 。 天津血研所 对 76 例 急性白血病（ AL）患者骨髓白血病细胞表面的 CD133 表达水平 研究发现， AL 患者 CD133 的 中位表达率为 19.3（ 0.01-90.52） %， 而 正常对照组的中位表达率为 0.29（ 0.01-0.57） %， CD133在 AL 中的阳性表达率 显著高于正常对照组 ， 其中 AML 的 CD133 阳性表达率为43.4%， ALL 的 CD133 表达阳性率为 38.1%13。 国内唐文钰等 14检测了 34 例 儿童ALL 骨髓细胞 的 CD133mRNA 阳性表达率显著高于对照组 。 2009 年 COX 等 15在对B-ALL 儿童研究中，将分离纯化后不同免疫表型的白血病细胞亚群植入 NOD/SCID小鼠体内后 观察到 ，能发生有效增殖的细胞是 CD133+CD19-亚群，说明儿童 B-ALL的白血病干细胞具有 CD133+CD19-表型特征。 这些研究结果提示 CD133 很可能是急性白血病干细胞的表面标记物。 我们 在 前期 研究中 以 B 系急性淋巴细胞性白血病 （ B-ALL） 患儿 骨髓 MNCs 为研究对象，利用流式细胞术检测 CD133-1、 CD133-2 的表达 ，结果显 示 CD133-2 阳性率（ 62.5%）高于 CD133-1 的阳性率（ 39.6%)， 且表达水平也高于 CD133-1 组 ，差异具有统计学意义 。 经 诱导 化疗后， CD133-2 的表达水平相对 CD133-1 下降较缓慢，且 CD133-2 的表达与 微量残留病（ MRD） 水平有显著相关性。 这些结果 说明 CD133-2分子对评估儿童 B-ALL 预后可能更有 价值 。 故本课题通过流式细胞术检测 B-ALL 患儿白血病细胞 表面 的 CD133-2 的表达情况。然后 应用免疫磁珠分选法分离纯化 B-ALL 患儿的 骨髓 MNCs 为