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硕士专业学位论文 论文题目 -3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的 保护作用 研究生姓名 董兴强 指导教师姓名 孙庆林 专 业 名 称 儿科学 研 究 方 向 小儿普外科 论文提交日期 2013年 4月 -3 脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用 中文摘要 I -3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用 中文摘要 目的: 探讨 -3 脂肪酸( -3 fatty acids)对实验性大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。 方法: 选用 36 只成年雄性 SD 大鼠随机分为 3 组(每组 12 只) : 假手术组( S):取腹 部 正中 纵行 切口,长约 2.5cm,用温 生理盐水纱布将肠管推向 腹腔 左侧,显 露右肾内上方的肠 系膜根部,寻及 肠系膜上动脉 (SMA),单纯 分离肠系膜上动脉后不做 阻断。肠缺血再灌注损伤组( I/R): 相同方法 暴 露肠系膜上动脉,用无创血管夹阻断肠 系膜上动脉 ,制作 肠缺血模型,夹闭肠系膜上动脉的同时,自尾静脉给予 0.6ml 生理盐水注射, 45min 后松夹再灌注 2h。 -3 脂肪酸 ( W) 治疗组:按( I/R)组处理,于阻断 SMA后立即经尾静脉注射 -3 脂肪酸 125mg/kg(约 0.3ml -3 脂肪酸 +0.3ml 生理盐水) , 45min 后松夹再灌注 2h。实验 过程中 所有动物腹腔 内 注入 37生理盐水0.5ml/以保持血流动力学稳定。实验结束后立即从腹主动脉采集血标本,行全血离心( 4.0、 4000r/min) 10 分钟后分装血清, -70.0保存备用 ,检测血清中 超氧化物歧化酶 (SOD)、肠脂肪 酸 结合蛋白( IFABP)、白介素 -6( IL-6)的含量 。并分别取 2回肠段 肠管 (距回盲部近端 15cm)行病理组织学观察。 统计方法 采用 SPSS16.0 统计软件,计量资料结果以均值标准差 (X SD)表示,组间比较采用 LSD-t 检验法,P0.05 提示差异有显著统计学意义。 结果: 1 各组 SD 大鼠肠组织病理形态学改变 S 组大鼠肠绒毛完整,排列整齐,镜下无中性粒细胞浸润; I/R 组可见 肠道 粘膜绒毛结构紊乱, 上皮细胞脱落,绒毛尖端上皮抬高与固有层分离,可见散在的溃疡 点和出血灶,粘 膜下层大量 中性粒细胞浸润; W 组肠黏膜绒毛损伤相对较轻 ,粘膜轻度中文摘要 -3 脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用 II 水肿,少量 绒 毛 表层上皮细胞脱落、坏死, 无明显溃疡出血灶, 镜下 可见 少量中性粒细胞浸润。 2. 各组 SD 大鼠血清中 SOD、 IFABP、 IL-6 的含量变化 I/R 组血清中 SOD 的含量为( 19.24 13.01) U/ml,较 S 组( 122.33 33.73) U/ml 显著减少( t=9.34,P0.05),而 W 组( 35.45 13.06) U/ml 与 I/R 组 比较则显著 增高( t=3.64,P0.05)。 I/R 组血清中 IFABP 的含量为 (2014.67 624.25) pg/ml,较 S 组( 217.26 95.73) pg/ml 显著增加( t=9.89,P0.05),而 W 组 ( 1250.10 309.48) pg/ml与之比较,则显著减少( t=4.67,P0.05)。 I/R 组血清中 IL-6 的含量为( 272.40 60.98)pg/ml, 较 S 组( 75.16 33.86) pg/ml 显著 增高 ( t=10.38,P0.05), W 组( 181.83 48.17)pg/ml 与 I/R 组比较则显著 减少 ( t=4.11,P0.05)。 结论: 1肠缺血再灌注损伤可致血清中 IFABP、 IL-6 的含量明显增高, SOD 的量明显降低。 2. -3 脂肪酸可以明显减轻大鼠肠缺血再灌注损伤,主要 可能 通过抗氧化、清除自由基、抑制炎症介质释放、保护肠粘膜等发挥作用。 关键词: -3 脂肪酸;缺血再灌注;肠粘膜屏障; 抗氧化 作 者 :董兴强 指导老师: 孙庆林 The protection of -3 fatty to intestinal ischemia-reperfusion injury in rats Abstract III The protection of -3 fatty to intestinal ischemia-reperfusion injury in rats Abstract Objective: To study the protection of omega-3 fatty acids (-3 fatty acids) to experimental rat intestinal ischemia-reperfusion injury and possible mechanisms. Methods: Thirty-six adult male SD rats were randomly divided into 3 groups (n = 12): sham operation group (S): just separated the roots of the superior mesenteric artery (SMA) without blocking it; intestinal ischemia-reperfusion + physiological saline group (I / R):separated and clamped the superior mesenteric artery for 45 minutes followed by 2h reperfusion, and 0.6ml saline was injected via the tail vein when the superior mesenteric artery was clamped. Intestinal ischemia-reperfusion + -3 fatty acids (W): separated and clamped the superior mesenteric artery for 45 minutes followed by 2h reperfusion, and -3 fatty acids (125mg/kg) was injected via the tail vein when the superior mesenteric artery was clamped. All animals were prohibited fasting 12h; preoperative 2h prohibit drinking before testing. The rats were anesthetized, then by median abdominal incision; separated and clamped the superior mesenteric artery for 45 minutes, followed by reperfusion was achieved by removal of the clamp. All the animals were administered normal sodium (0.5ml/kg) via abdomen, in order to keep the hemodynamic being stable. The rats were sacrificed after 2 hours of reperfusion. And peripheral blood was taken immediately, and then the samples were centrifugalized in 4000rpm for 10 minutes, and then got the supernatant liquid.The serum was stored in -70 for detecting the content of diamines Superoxide dismutase (SOD) Interleukin-6(IL-6) and small intestine fatty acid-binding protein (IFABP) in the serum. The ileocecum proximal intestine of all the rats was obtained .And the histological examination was performed by the method of staining with haematoxylin-eosin(HE). Software SPSS16.0 was used in all statistical tests and the measurement data were presented as mean(X )standard deviation (SD).Comparisons Abstract The protection of -3 fatty to intestinal ischemia-reperfusion injury in rats IV between 3 groups were calculated using independent sample t test ,and the difference was considered to be significant if the P value was less than 0.05. Results: 1.The pathomorphology change of ileal tissue of each group. In S group, under microscope, the intestinal were completely and linedly.In I/R group, the intestinal mucosa presented dilated and exposed capillaries and denuded villa, some of villa hemorrhage were ulceration; the lamina propria was edema and infiltrated with inflammatory cells. The intestinal mucosal structure maintain intact with lifting of the epithelial layer from the lamina propria and moderate extension of the subepithelial space in W group. 2. The change of content of SOD.IL-6 and IFABP in different group. The SOD content in serum of W group was significantly decreased compared with that in S group (35.45 13.06 U-/ ml vs 122.33 33.73 U-/ ml t = 9.34, P 0.05),but it was significantly increased compared with that in I/R group(19.24 13.01 U-/ ml vs 35.45 13.06U-/ml t = 3.64, P 0.05). The IFABP content in serum of W group was significantly decreased compared with that in I/R group (1250.10 309.48 pg/ml vs 2014.67 624.25 pg/ml t = 4.67, P 0.05),but it was significantly increased compared with that in S group(1250.10 309.48 pg/ml vs 217.26 95.73 pg/ml t = 3.64, P 0.05) The IL-6 content in serum of W group was significantly decreased compared with that in I/R group (181.83 48.17 pg/ml vs 272.40 60.98pg/ml t = 4.11, P 0.05),but it was significantly increased compared with that in S group181.83 48.17 pg/ml vs 75.16 33.86 pg/ml t = 10.38, (P 0.05) Conclusion: 1. Intestinal ischemia-reperfusion injury can be induced in the serum of IFABP, IL-6 content was significantly higher, significantly reduced the amount of SOD. 2. -3 fatty acids can significantly reduce intestinal ischemia-reperfusion injury, mainly through antioxidant and free radical scavenging, inhibiting the release of inflammatory mediators and the protection of the intestinal mucosa play a role. Key word: -3 fatty acids; ischemia reperfusion; mucosal barrier; antioxidant Written by: DONG Xing-qiang Supervised by: SUN Qing-lin 目 录 引 言 . 1 材料与方法 . 3 结 果 . 9 讨 论 . 11 结 论 . 14 参考文献 . 15 附 录 . 20 综 述 . 23 中英文双解缩略词表 . 33 研究生期间发表及待发表文章 . 34 致 谢 . 35 -3 脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用 引 言 1 引 言 缺血 -再灌注损伤 (ischemia reperfusion injury, IRI)是指在 缺血的基础上恢复血流后,组织器官的损伤 不但未见好转 反而 出现 加重 , 甚至出现 不可逆损伤的病理过程。严重 创伤、烧伤、 感染、 失血等应激因素均可造成不同器官的缺血, 在全身循环血量不足的情况下,机体为保证心、脑等重要脏器的血流,会进行血流的重新分配,而肠道往往是最早缺血的器官之一。 肠道持续低灌注,引起肠道严重缺血、缺氧 ,随着液体复苏等措施的实施,在恢复肠道血液灌注的同时,还可出现肠缺血再灌注损伤(intestinal ischemia/reperfusion injury, IIRI);通常认为, IIRI除了引起肠道局部 组织损伤外,更会由于 肠源性细菌 /内毒素移位 引发远隔脏器的损伤,加重器官炎症反应,引起全身炎症反应综合征 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障碍综合征 (multiple organ dysfunction syndrome, MODS)。所以认为 ,肠道不仅是MODS的靶器官,更是 MODS的启动者 1-2。 肠缺血再灌注 损伤 (IIRI)是外科的常见疾病,按 发病 原因可分为 原发 性 肠道疾病及继发性疾病,前者 主要因肠系膜动 /静脉 闭塞或血流量锐减引起的肠 缺血 坏死或严重缺血损伤,主要 包括 :肠系膜血管 的 栓塞 或狭窄 所致 肠系膜血管缺血等 疾病,多急性起病 , 且 诊断率低, 病死率较高。后者主要见于各种原因引起低灌注状态 :如失血、重大创伤 、 感染、 休克 等 。在全身循环血量不足的情况下, 机体 为保证心 、脑等重要脏器的血 流, 会进行血流的重新分配,而 肠道 往往是最早缺血的器官之一 。 肠缺血损伤首先表现在肠粘膜的损伤, 肠黏膜由于缺氧、酸中毒、氧自由基、炎性介质 因子的释放 等众多因素 的影响而导致细胞 坏死脱落, 肠粘膜的 机械屏障 被 破坏, 通透性增加;同时 伴随的肠 内菌群紊乱 ,细菌与内毒素移位,肠黏膜及系 膜内免疫组织产生炎症介质 因子 释放,进一步加重 肠黏膜 损伤,增加肠粘膜 通透性,促进细菌移位,从而 形成恶性循环。待机体复苏后,肠道血 液 循环的恢复常滞后于全身循环的恢复,黏膜血供恢复的时间越长,越加重肠黏膜屏障功能的损害 3。其对肠道的局部不会产生根本性损伤 , 但由此造成的肠黏膜屏障功能障碍是其严重并发症的一个重要原因 4。 近年 对于 IIRI研究成为一个热点问题 , 目前 主要 可能 的机制 有能 量衰竭、白细胞引 言 -3 脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用 2 黏附、钙超载、补体学、递质病、氧自由基损伤、内皮细胞损伤 等一系列学说。在近几年提出的细胞层面、基因层面和病理生理学层 面上的一些新论断,使机制的研究进一步完善和准确。现在并针对可能的机制进行了许多研究,提出了许多防治的方法:有预处理法、药物疗法、祖国 传统医药疗法及一些基因、细胞层次上的疗法,也都取得了很好的效果 5-8。 小肠脂肪酸结合蛋白 (Intestinal fatty acid binding protein, IFABP)是由小肠单层柱状上皮细胞分泌的一种特殊蛋白质,主要存在于小肠成熟肠上皮细胞胞液中,正 常 情况下血清中 IFABP含量极低。当组织遭受缺血再灌注损害时 导致 肠粘膜细胞膜通透性增大,从而使 IFABP分子 可以 通过毛细血管和毛细淋巴管进入血液 , 此时 血清中IFABP含量增高 , 而且血清 IFABP在室温 状态下 24h内 可 保持活性的 95%,便于检测。通过基础与临床研究发现 , IFABP作为 早期诊断肠缺血的一个敏感指标 ,其水平的变化与创伤、炎症严重程度和胃肠功能障碍程度呈正相关 ,这种变化可能对创伤后胃肠功能障碍的早期预测有较重要意义 9。 超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase, SOD)是生物体内重要 的抗氧化 酶,广泛分布于各种生物体内,如动物,植物,微生物等。 它 是一种内源性氧自由基清除剂 ,将过氧化物转化为过 氧化氢,并在过氧化酶的作用下生成水,从而减少 氧 自由基对细胞 造成的 伤害。 研究表明 SOD和过氧化氢酶具有减轻 肠缺血再灌注 损伤的作用 。因此,可以把内源性 SOD活性的变化作为观察 肠缺血再灌注损伤中 氧自由基产生的指标。 -3脂肪酸属于多不饱和脂肪酸,主要包括 a-亚麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等 10。 近年来的研究表明 -3脂肪酸有抗炎、调节免疫及脏器保护的作用,具有较好的临床应用前景 11-12。研究表明 -3脂肪酸对急性肺损伤具有保护作用 13-14。 -

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