ω3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用

硕士专业学位论文论文题目Ω3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用研究生姓名董兴强指导教师姓名孙庆林专业名称儿科学研究方向小儿普外科论文提交日期2013年4月Ω3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用中文摘要IΩ3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用中文摘要目的探讨Ω3脂肪酸（Ω3FATTYACIDS）对实验性大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。方法选用36只成年雄性SD大鼠随机分为3组（每组12只）假手术组（S）取腹部正中纵行切口，长约25CM，用温生理盐水纱布将肠管推向腹腔左侧，显露右肾内上方的肠系膜根部，寻及肠系膜上动脉SMA，单纯分离肠系膜上动脉后不做阻断。肠缺血再灌注损伤组（I/R）相同方法暴露肠系膜上动脉，用无创血管夹阻断肠系膜上动脉，制作肠缺血模型，夹闭肠系膜上动脉的同时，自尾静脉给予06ML生理盐水注射，45MIN后松夹再灌注2H。Ω3脂肪酸（W）治疗组按（I/R）组处理，于阻断SMA后立即经尾静脉注射Ω3脂肪酸125MG/KG（约03MLΩ3脂肪酸03ML生理盐水），45MIN后松夹再灌注2H。实验过程中所有动物腹腔内注入37℃生理盐水05ML/㎏以保持血流动力学稳定。实验结束后立即从腹主动脉采集血标本，行全血离心（40℃、4000R/MIN）10分钟后分装血清，700℃保存备用,检测血清中超氧化物歧化酶SOD、肠脂肪酸结合蛋白（IFABP）、白介素6（IL6）的含量。并分别取2㎝回肠段肠管距回盲部近端15CM行病理组织学观察。统计方法采用SPSS160统计软件，计量资料结果以均值标准差XSD表示，组间比较采用LSDT检验法，P005提示差异有显著统计学意义。结果1．各组SD大鼠肠组织病理形态学改变S组大鼠肠绒毛完整，排列整齐，镜下无中性粒细胞浸润；I/R组可见肠道粘膜绒毛结构紊乱，上皮细胞脱落，绒毛尖端上皮抬高与固有层分离，可见散在的溃疡点和出血灶，粘膜下层大量中性粒细胞浸润；W组肠黏膜绒毛损伤相对较轻,粘膜轻度中文摘要Ω3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用II水肿，少量绒毛表层上皮细胞脱落、坏死，无明显溃疡出血灶，镜下可见少量中性粒细胞浸润。2各组SD大鼠血清中SOD、IFABP、IL6的含量变化I/R组血清中SOD的含量为（19241301）U/ML，较S组（122333373）U/ML显著减少（T934,P005），而W组（35451306）U/ML与I/R组比较则显著增高（T364,P005）。I/R组血清中IFABP的含量为20146762425PG/ML,较S组（217269573）PG/ML显著增加（T989,P005），而W组（12501030948）PG/ML与之比较，则显著减少（T467,P005）。I/R组血清中IL6的含量为（272406098）PG/ML，较S组（75163386）PG/ML显著增高（T1038,P005），W组（181834817）PG/ML与I/R组比较则显著减少（T411,P005）。结论1．肠缺血再灌注损伤可致血清中IFABP、IL6的含量明显增高，SOD的量明显降低。2Ω3脂肪酸可以明显减轻大鼠肠缺血再灌注损伤，主要可能通过抗氧化、清除自由基、抑制炎症介质释放、保护肠粘膜等发挥作用。关键词Ω3脂肪酸；缺血再灌注；肠粘膜屏障；抗氧化作者董兴强指导老师孙庆林THEPROTECTIONOFΩ3FATTYTOINTESTINALISCHEMIAREPERFUSIONINJURYINRATSABSTRACTIIITHEPROTECTIONOFΩ3FATTYTOINTESTINALISCHEMIAREPERFUSIONINJURYINRATSABSTRACTOBJECTIVETOSTUDYTHEPROTECTIONOFOMEGA3FATTYACIDSΩ3FATTYACIDSTOEXPERIMENTALRATINTESTINALISCHEMIAREPERFUSIONINJURYANDPOSSIBLEMECHANISMSMETHODSTHIRTYSIXADULTMALESDRATSWERERANDOMLYDIVIDEDINTO3GROUPSN12①SHAMOPERATIONGROUPSJUSTSEPARATEDTHEROOTSOFTHESUPERIORMESENTERICARTERYSMAWITHOUTBLOCKINGIT；②INTESTINALISCHEMIAREPERFUSIONPHYSIOLOGICALSALINEGROUPI/RSEPARATEDANDCLAMPEDTHESUPERIORMESENTERICARTERYFOR45MINUTESFOLLOWEDBY2HREPERFUSION,AND06MLSALINEWASINJECTEDVIATHETAILVEINWHENTHESUPERIORMESENTERICARTERYWASCLAMPED③INTESTINALISCHEMIAREPERFUSIONΩ3FATTYACIDSWSEPARATEDANDCLAMPEDTHESUPERIORMESENTERICARTERYFOR45MINUTESFOLLOWEDBY2HREPERFUSION,ANDΩ3FATTYACIDS125MG/KGWASINJECTEDVIATHETAILVEINWHENTHESUPERIORMESENTERICARTERYWASCLAMPEDALLANIMALSWEREPROHIBITEDFASTING12H；PREOPERATIVE2HPROHIBITDRINKINGBEFORETESTINGTHERATSWEREANESTHETIZED,THENBYMEDIANABDOMINALINCISION；SEPARATEDANDCLAMPEDTHESUPERIORMESENTERICARTERYFOR45MINUTES,FOLLOWEDBYREPERFUSIONWASACHIEVEDBYREMOVALOFTHECLAMPALLTHEANIMALSWEREADMINISTEREDNORMALSODIUM05ML/KGVIAABDOMEN,INORDERTOKEEPTHEHEMODYNAMICBEINGSTABLETHERATSWERESACRIFICEDAFTER2HOURSOFREPERFUSIONANDPERIPHERALBLOODWASTAKENIMMEDIATELY,ANDTHENTHESAMPLESWERECENTRIFUGALIZEDIN4000RPMFOR10MINUTES,ANDTHENGOTTHESUPERNATANTLIQUIDTHESERUMWASSTOREDIN70℃FORDETECTINGTHECONTENTOFDIAMINESSUPEROXIDEDISMUTASESODINTERLEUKIN6IL6ANDSMALLINTESTINEFATTYACIDBINDINGPROTEINIFABPINTHESERUMTHEILEOCECUMPROXIMALINTESTINEOFALLTHERATSWASOBTAINEDANDTHEHISTOLOGICALEXAMINATIONWASPERFORMEDBYTHEMETHODOFSTAININGWITHHAEMATOXYLINEOSINHESOFTWARESPSS160WASUSEDINALLSTATISTICALTESTSANDTHEMEASUREMENTDATAWEREPRESENTEDASMEANXSTANDARDDEVIATIONSDCOMPARISONSABSTRACTTHEPROTECTIONOFΩ3FATTYTOINTESTINALISCHEMIAREPERFUSIONINJURYINRATSIVBETWEEN3GROUPSWERECALCULATEDUSINGINDEPENDENTSAMPLETTEST,ANDTHEDIFFERENCEWASCONSIDEREDTOBESIGNIFICANTIFTHEPVALUEWASLESSTHAN005RESULTS1THEPATHOMORPHOLOGYCHANGEOFILEALTISSUEOFEACHGROUPINSGROUP,UNDERMICROSCOPE,THEINTESTINALWERECOMPLETELYANDLINEDLYINI/RGROUP,THEINTESTINALMUCOSAPRESENTEDDILATEDANDEXPOSEDCAPILLARIESANDDENUDEDVILLA,SOMEOFVILLAHEMORRHAGEWEREULCERATION；THELAMINAPROPRIAWASEDEMAANDINFILTRATEDWITHINFLAMMATORYCELLSTHEINTESTINALMUCOSALSTRUCTUREMAINTAININTACTWITHLIFTINGOFTHEEPITHELIALLAYERFROMTHELAMINAPROPRIAANDMODERATEEXTENSIONOFTHESUBEPITHELIALSPACEINWGROUP2THECHANGEOFCONTENTOFSODIL6ANDIFABPINDIFFERENTGROUPTHESODCONTENTINSERUMOFWGROUPWASSIGNIFICANTLYDECREASEDCOMPAREDWITHTHATINSGROUP35451306U/MLVS122333373U/MLT934,P005,BUTITWASSIGNIFICANTLYINCREASEDCOMPAREDWITHTHATINI/RGROUP19241301U/MLVS35451306U/MLT364,P005THEIFABPCONTENTINSERUMOFWGROUPWASSIGNIFICANTLYDECREASEDCOMPAREDWITHTHATINI/RGROUP12501030948PG/MLVS20146762425PG/MLT467,P005,BUTITWASSIGNIFICANTLYINCREASEDCOMPAREDWITHTHATINSGROUP12501030948PG/MLVS217269573PG/MLT364,P005THEIL6CONTENTINSERUMOFWGROUPWASSIGNIFICANTLYDECREASEDCOMPAREDWITHTHATINI/RGROUP181834817PG/MLVS272406098PG/MLT411,P005,BUTITWASSIGNIFICANTLYINCREASEDCOMPAREDWITHTHATINSGROUP181834817PG/MLVS75163386PG/MLT1038,P005CONCLUSION1INTESTINALISCHEMIAREPERFUSIONINJURYCANBEINDUCEDINTHESERUMOFIFABP,IL6CONTENTWASSIGNIFICANTLYHIGHER,SIGNIFICANTLYREDUCEDTHEAMOUNTOFSOD2Ω3FATTYACIDSCANSIGNIFICANTLYREDUCEINTESTINALISCHEMIAREPERFUSIONINJURY,MAINLYTHROUGHANTIOXIDANTANDFREERADICALSCAVENGING,INHIBITINGTHERELEASEOFINFLAMMATORYMEDIATORSANDTHEPROTECTIONOFTHEINTESTINALMUCOSAPLAYAROLEKEYWORDΩ3FATTYACIDS；ISCHEMIAREPERFUSION；MUCOSALBARRIER；ANTIOXIDANTWRITTENBYDONGXINGQIANGSUPERVISEDBYSUNQINGLIN目录引言1材料与方法3结果9讨论11结论14参考文献15附录20综述23中英文双解缩略词表33研究生期间发表及待发表文章34致谢35Ω3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用引言1引言缺血再灌注损伤ISCHEMIA．REPERFUSIONINJURY，IRI是指在缺血的基础上恢复血流后，组织器官的损伤不但未见好转反而出现加重，甚至出现不可逆损伤的病理过程。严重创伤、烧伤、感染、失血等应激因素均可造成不同器官的缺血，在全身循环血量不足的情况下，机体为保证心、脑等重要脏器的血流，会进行血流的重新分配，而肠道往往是最早缺血的器官之一。肠道持续低灌注，引起肠道严重缺血、缺氧,随着液体复苏等措施的实施，在恢复肠道血液灌注的同时，还可出现肠缺血再灌注损伤INTESTINALISCHEMIA/REPERFUSIONINJURY，IIRI；通常认为，IIRI除了引起肠道局部组织损伤外，更会由于肠源性细菌/内毒素移位引发远隔脏器的损伤，加重器官炎症反应，引起全身炎症反应综合征SYSTEMICINFLAMMATORYRESPONSESYNDROME，SIRS和多器官功能障碍综合征MULTIPLEORGANDYSFUNCTIONSYNDROME，MODS。所以认为，肠道不仅是MODS的靶器官，更是MODS的启动者12。肠缺血再灌注损伤IIRI是外科的常见疾病，按发病原因可分为原发性肠道疾病及继发性疾病，前者主要因肠系膜动/静脉闭塞或血流量锐减引起的肠缺血坏死或严重缺血损伤，主要包括肠系膜血管的栓塞或狭窄所致肠系膜血管缺血等疾病，多急性起病，且诊断率低，病死率较高。后者主要见于各种原因引起低灌注状态如失血、重大创伤、感染、休克等。在全身循环血量不足的情况下，机体为保证心、脑等重要脏器的血流，会进行血流的重新分配，而肠道往往是最早缺血的器官之一。肠缺血损伤首先表现在肠粘膜的损伤，肠黏膜由于缺氧、酸中毒、氧自由基、炎性介质因子的释放等众多因素的影响而导致细胞坏死脱落，肠粘膜的机械屏障被破坏，通透性增加；同时伴随的肠内菌群紊乱，细菌与内毒素移位，肠黏膜及系膜内免疫组织产生炎症介质因子释放，进一步加重肠黏膜损伤，增加肠粘膜通透性，促进细菌移位，从而形成恶性循环。待机体复苏后，肠道血液循环的恢复常滞后于全身循环的恢复，黏膜血供恢复的时间越长，越加重肠黏膜屏障功能的损害3。其对肠道的局部不会产生根本性损伤，但由此造成的肠黏膜屏障功能障碍是其严重并发症的一个重要原因4。近年对于IIRI研究成为一个热点问题，目前主要可能的机制有能量衰竭、白细胞引言Ω3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用2黏附、钙超载、补体学、递质病、氧自由基损伤、内皮细胞损伤等一系列学说。在近几年提出的细胞层面、基因层面和病理生理学层面上的一些新论断，使机制的研究进一步完善和准确。现在并针对可能的机制进行了许多研究，提出了许多防治的方法有预处理法、药物疗法、祖国传统医药疗法及一些基因、细胞层次上的疗法，也都取得了很好的效果58。小肠脂肪酸结合蛋白INTESTINALFATTYACIDBINDINGPROTEIN，IFABP是由小肠单层柱状上皮细胞分泌的一种特殊蛋白质，主要存在于小肠成熟肠上皮细胞胞液中，正常情况下血清中IFABP含量极低。当组织遭受缺血再灌注损害时导致肠粘膜细胞膜通透性增大，从而使IFABP分子可以通过毛细血管和毛细淋巴管进入血液，此时血清中IFABP含量增高，而且血清IFABP在室温状态下24H内可保持活性的95,便于检测。通过基础与临床研究发现，IFABP作为早期诊断肠缺血的一个敏感指标,其水平的变化与创伤、炎症严重程度和胃肠功能障碍程度呈正相关,这种变化可能对创伤后胃肠功能障碍的早期预测有较重要意义9。超氧化物歧化酶SUPEROXIDEDISMUTASE，SOD是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。它是一种内源性氧自由基清除剂，将过氧化物转化为过氧化氢，并在过氧化酶的作用下生成水，从而减少氧自由基对细胞造成的伤害。研究表明SOD和过氧化氢酶具有减轻肠缺血再灌注损伤的作用。因此，可以把内源性SOD活性的变化作为观察肠缺血再灌注损伤中氧自由基产生的指标。Ω3脂肪酸属于多不饱和脂肪酸，主要包括A亚麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等10。近年来的研究表明Ω3脂肪酸有抗炎、调节免疫及脏器保护的作用，具有较好的临床应用前景1112。研究表明Ω3脂肪酸对急性肺损伤具有保护作用1314。Ω3脂肪酸预处理已经被证实在新西兰兔心肌缺血再灌注损伤的过程中可以起到抗氧化及心肌保护作用1516。从而推测其在肠缺血再灌注损伤时对肠缺血再灌注损伤具有保护作用。本文在总结前人工作的基础上，通过制作SD大鼠小肠缺血再灌注模型，实验过程中应用Ω3脂肪酸，通过观察血清的的一些特定指标探讨其对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。Ω3脂肪酸对大鼠肠缺血再灌注损伤的保护作用材料与方法3材料与方法一、实验材料1实验动物健康清洁级SD雄性大鼠36只，体重280～320G，由苏州大学实验动物中心提供，许可证SCXK苏20082013。2主要药品与试剂21主要药品Ω3脂肪酸注射液Ω3FATTYACIDS，购于江苏省无锡市华瑞制药有限公司。22主要实验试剂（1）MOUSEIL6PLATINUMELISA试剂盒，购于苏州克曼生物技术有限公司。（2）肠型脂肪酸结合蛋白（IFABP）试剂盒购于美国MARKET公司。（3）总SOD活性检测试剂盒（NBT法）购自碧云天公司。（4）10福尔马林溶液、无菌生理盐水、无水乙醇、无水醋酸等由苏州大学儿科研究所提供。（5）二氨基联苯胺（DAB）溶液、酸盐缓冲液、1盐酸酒精、85乙醇枸橼、PBS液、生物素化二抗、二氨基联苯胺（DAB）溶液、苏木素液等由苏州大学儿科研究所提供。3主要实验仪器（1）50UL、100UL、200UL微量移液器德国EPPENDORF公司（2）温控高速离心机D37520德国OSTERODE公司（3）电热恒温水温箱HHW21CU600上海医疗仪器七厂（4）电子秤瑞士MM7LER公司（5）超低温电冰箱日本SANYO公司（6）KRYOMAT700振动切片机德国LEITZ公司（7）Q550CW计算机图像分析系统法国LEICA公司（8）722光栅分光光度计上海第二分析仪器制造厂