分子生物学 DNA的复制、损伤与修复

Replication and damage repair,第二章 DNA的复制、损伤和修复,第一节 DNA的复制(Replication, DNA biosynthesis),指DNA双链在细胞分裂以前进行的复制过程。,哺乳动物的细胞周期,（一）半保留复制 DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。,意义：半保留复制说明DNA在代谢上的稳定性。经过许多代的复制，DNA链仍可保持完整，这在生物的遗传上是十分重要的。,一、DNA 复制特征,DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作CsCl密度梯度离心.,半保留复制证据,（以原核生物 大肠杆菌为例）原料： dNTP，Mg+双链DNA模板引物（primer），常是RNA，有游离的 3OH。引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物 解螺旋酶 ( helicase ) , DnaB, 由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（Ori C）上解开双螺旋。,与复制有关的酶和因子,复制的起始点与方向,亲代DNA开链，复制起始点呈叉型移动,复制起始点（ori）：DNA复制要从DNA分子的特定部位开始，此部位称复制起始点原核：一个起始点，约245bp,特殊的重复序列 真核：多个起始点,ori,E.coli复制起始点oriC跨度为245bp，包括两个关键序列：13bp的序列和9bp序列,它是决定和控制E.coli染色体复制的唯一片段。,13bp序列区，每一个顺序都由GATC开始，富含A和T，有助于螺旋解开，控制复制何时开始。,9bp重复序列，重复出现4次，能与起始蛋白dnaA特异结合，当dnaA蛋白（约20种）结合于ori的4个部位上时复制开始。 dnaA蛋白（一种专一的蛋白）和ori结合后，双螺旋解开形成复制叉。故dnaA蛋白与启动解链有关,dnaA蛋白是起始的关键成分。,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,复制方向,DNA合成的方向单向、双向？,1个起始点,复制中的大肠杆菌染色体放射自显影图(Caims实验),将3H-胸苷标记大肠杆菌DNA，经过近两代的时间，3H-胸苷掺入大肠杆菌DNA 。用溶菌酶把细胞壁消化掉，使完整的大肠杆菌染色体DNA释放出来，放射自显影，得到上图。非复制部分（C）银粒子密度较低，由一股放射性链和一股非放射性链构成。已复制部分站整个染色体的三分之二，其中一条双链（ B ）仅有一股链是标记的，另外一股双链（ A ）的两股链都是标记的，银粒子密度为前二者的两倍。染色体全长约为1100微米。,双向复制,复制子,真核生物两个相邻复制起始点之间的DNA片段,以起始点为中心，向两个方向进行复制,多个起始点,二、 DNA复制的酶学,1. 模板：解开成单链的DNA母链,3. DNA聚合酶，DNA-pol,2. 底物dNTP ：dATP，dGTP，dCTP，dTTP,4. 引物（primer）：RNA引物,5. 其他酶和蛋白质因子,一、复制的化学反应,生成磷酸二酯键,+dN2TP,+PPi,DNA pol,3TAGAAGACCTATTGGCC5,5ATCTTCTGGATAACCGG3,二、 解链相关酶类,1. 解旋酶(helicase),2. 拓扑异构酶（topoisomerase I、II）,3. 单链DNA结合蛋白(SSB),DNA解旋酶(helicase)（解链酶） 功能：DNA的双螺旋解链（解DNA双链），解开一对碱基，需2分子ATP， 作用点：DNA上局部单链处，向双链方向解链。 种类：E.coli有四种解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。 I、II、III中任一种沿模板5-3 方向移动，rep蛋白沿模板3 -5方向移动。,2. 拓扑异构酶（Topo）,DNA正超螺旋与负超螺旋,负超螺旋,正超螺旋,DNA双螺旋,拓扑异构酶,首先在大肠杆菌中被发现，它可使DNA的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量。 另外，DNA复制时负超螺旋的消除，亦由拓扑异构酶来完成，但它对正超螺旋无作用。,型拓扑异构酶,由两个A亚基和两个B亚基组成，即A2B2。它能使DNA的两条链同时发生断裂和再连接，当它引入负超螺旋以消除复制叉前进带来的扭曲张力时，需要由ATP提供能量。 两种拓扑异构酶在DNA复制、转录和重组中均发挥重要作用。,型拓扑异构酶,拓扑异构酶 I 抑制剂：喜树碱类拓扑异构酶 II 抑制剂：依托泊苷，多柔比星，阿霉素类等,3. 单链DNA结合蛋白（SSB）,作用：防止单链DNA重新形成双链，防止单链DNA被核酸酶水解,SSB,三、DNA聚合酶（DNA-pol） 即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）,真核生物有多种： DNA-pol 、,原核生物有3种： DNA-pol、 、 ,DNA聚合酶功能,53聚合作用53外切酶35外切酶活性,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA聚合酶,分子量每个细胞的分子统计数5-3 聚合酶作用3-5 核酸外切酶作用5-3 核酸外切酶作用转化率主要功能活性（nt/min）,DNA聚合酶,DNA聚合酶（复合物）,109，000400+1校读,修复1000,120，00040+-0 .05,400，00010-20+50复制100000,特 性,不清填补缺口50,四、引物酶(Primase)和引发体,催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一种特殊的RNA聚合酶,DNA合成需在RNA引物的基础上进行,DnaA,引发体（primosome）：包括解螺旋酶 、DnaC、引物酶及DNA复制的起始区域,小 结,主要成员,主要作用,DnaA 识别复制起始位点,解螺旋酶 解开DNA双链,SSB 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,TOPO 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA-pol DNA复制,DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,第三节 DNA生物合成过程,1.复制的起始,2.链的延长,3.复制的终止,一 复制的起始,(一) DNA解成单链,由特定蛋白质识别复制起始位点（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及单链DNA结合蛋白的共同作用下，DNA解链，解旋，形成复制叉,倒Y,(二)引发体的生成,解旋酶解开双链后引物酶进入形成引发体,（三） RNA引物的合成,参与复制起始的蛋白因子,名称,功能,DnaA蛋白 辨认起始点,解螺旋酶（DnaB，Rep） 解开DNA双链,DnaC 协助解螺旋酶,引物酶（DnaG） 催化RNA引物生成,SSB 稳定解开的单链,拓扑异构酶 理顺DNA链,OriC E.coli复制起始点,领头链的合成,复制过程简图,随从链上不连续性片段的连接,二、真核生物DNA生物合成,（一）DNA的复制只发生在S期（二）多复制子（三）真核细胞含有5种DNA聚合酶（四）端粒复制 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,1.端粒telemer：指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。 2.结构特点：（1）由末端单链DNA序列和蛋白质构成。（2）末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。,3.功能：（1）维持染色体的稳定性（2）维持DNA复制的完整性 4.端粒酶：由RNA和蛋白质组成（1）RNA发挥模板作用（2）蛋白质发挥逆转录酶活性,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,引物合成后，由DNA pol（在真核细胞为DNA聚合酶和)催化，按碱基配对原则，将dNTP逐一添加到引物3 末端，形成磷酸二酯键，使新合成的链不断延长,二 复制的延长,3AAGACCTATT5,5TTCTGGATAA3,DNA Pol I, II and III,延 长,冈崎片断,（三）终止阶段,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,半不连续复制(semi-discontinuous replication),领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),基因组能独立进行复制的功能单位称为复制子(replicon)，每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)，可能还有终止复制的终点(terminus)。每个起始点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成时，复制叉相遇并汇合连接。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子。,（2）复制子,DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制. 但在低等生物中,也可进行单向复制（如滚环复制）. 原核细胞：染色体和质粒 固定起点 双向复制，. 真核生物：染色体DNA，复制时多个起始点。,（3）复制方向,三、需要引物 DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段核酸片段提供3OH末端作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。 RNA引物的大小，在原核生物中通常为50100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。四、双向复制 DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。,五、半不连续复制（semidiscontinuous replication）,由于DNA聚合酶只能以53方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为35。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。定义：在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以35方向的母链作为模板指导新的链以5 3方向连续合成;另一股以5 3 为方向的母链则指导新合成的链以 5 3方向合成10002000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段）。这种复制方式称之为半不连续复制。,PPP,OH,+,DNA合成方向不可能是35的解释,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,前导链,随从链,岗崎片段,半不连续复制,以35方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为53，这一条链被称为领头链(leading strand)。而以53方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是53，这条链被称为随从链(lagging strand)。,前导链：在引物的3端按53方向连续不断地合成的DNA链。随从链：在引物的3端按53方向不连续合成的DNA链。冈崎片段：随从链上不连续合成的DNA短片段（不包括引物）,由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。 冈崎片段的大小，在原核生物中约为10002000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。,五、DNA聚合酶（DNA polymerase）,聚合酶III 主要的复制酶，兼有校读、纠错的功能 有从53 延伸多核苷酸链的聚合酶活性，有模板依赖性，其延伸的方式是依据碱基互补配对的原则，将原料dNTP与末端核苷酸游离的3 OH以3,5磷酸二酯键连接，同时释出一个PPi 。DNA聚合酶延伸多核苷酸链的方向总是5 3 有从35 外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸,聚合酶 I 用于切除引物RNA,并填补留下的空隙 有从53 延伸多核苷酸链的聚合酶的活性； 有从35 外切酶的活性，以切除可能错配的核苷酸； 有从53 外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II 活性弱,作用与聚合酶III相似 有从53延伸多核苷酸链的聚合酶活性； 有从35 外切酶的活性,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol ,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,六、DNA连接酶（ligase）,将不连续的DNA片段以3，5磷酸二酯键连接起来，原核生物通过分解NAD为NMN和Pi提供能量，真核生物则消耗ATP,复制的终止,由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填补空隙，由DNA连接酶将DNA片段连接起来。,一个复制子只含有一个专一的复制起点和复制结束的终点。一个完整的复制子在一个细胞周期只复制一次(真核)。 原核生物染色体和质粒都是独立（只有单一个）复制子；真核细胞染色体中有多个复制子组成。,（七）真核生物端粒的形成 端粒(telomere)是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成可重复数十次至数百次。 线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。 端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒（telomere） 染色体线性DNA分子末端 通常膨大成粒状 共同的结构特征: 富含TG 短重复序列 维持染色体稳定端粒酶（telomerase） RNA-蛋白质复合体 逆转录酶 延长末端DNA链进行,在真核生物，由端粒酶（telomerase）催化, 在真核线性DNA的末端形成一种特殊的结构并与蛋白质结合成端粒（telomere）。,端粒由成百个6个核苷酸的重复序列所组成（人为TTAGGG，四膜虫为TTGGGG）。端粒的功能为稳定染色体的末端结构，防止染色体间末端连接，并可补偿滞后链5-末端在消除RNA引物后造成的空缺。复制可使端粒5末端缩短，而端粒酶（telomerase）可外加重复单位到5-末端上，结果使端粒维持一定的长度。,4、 DNA的几种复制方式（1）、 直线双向复制单点双向，T7多点双向，真核染色体DNA（2）、型复制：环状双链DNA，对称复制，单向或双向（E .coli.）（3）、 滚环复制：环状单链DNA，x174（4）、 D环复制（取代环复制）：不对称复制，线粒体、叶绿体DNA。两条链的复制起点不在同一点上，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代：当一条链复制到一定程度时才暴露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。,三、滚环复制和D环复制,滚环复制(rolling circle replication)：是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制的过程,D环复制(D-loop replication) ：是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,线粒体(mitochodria DNA,mtDNA),哺乳动物线粒体mtDNA是一个长度为16.5kb的紧密双链闭合环状分子，外环为重链（H链），内环为轻链（L链），以D环复制方式进行。,第二节 DNA的损伤一、DNA的损伤（突变） 由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。（一）引起突变的因素1自发因素(1) 自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。(2) 自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。(3) 复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。,2物理因素 由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。,3化学因素(1) 脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。(2) 烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。(3) DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。(4) 碱基类似物：如5-FU等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。(5) 断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。,（二）DNA突变的类型 碱基的转换,第三节 DNA损伤的修复 DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。, hv UV TT 光复活酶 修复 TT,（一）直接修复1光复活（light repairing） 这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。,其修复过程为： 光复活酶（photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物在300600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复光复活酶从DNA上解离。,2转甲基作用 在转甲基酶的催化下，将DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。3直接连接 DNA断裂形成的缺口，可以在DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。,（二）取代修复1切除修复(excision repairing) 这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动，一种是核酸内切酶，另一种是DNA糖苷酶。 可修复TT，电离辐射，某些化学诱变剂造成的DNA结构的破坏 参加的酶有：特异的核酸内切酶；外切酶；聚合酶；连接酶。,2重组修复(recombination repairing) 这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。(重组修复，复制后修复 ),3SOS修复 由DNA损伤或抑制复制的处理所引起的一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS）。这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。 DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。,DNA损伤与药物评价,1.遗传毒性试验遗传毒性研究在药物研发中处于比较的重要位置。遗传毒性试验能检出DNA损伤及其损伤的固定。以基因突变、较大范围染色体损伤、重组和染色体数目改变形式出现的DNA损伤的固定，一般被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤发展过程的环节之一。在检测这些类别损伤的试验中呈阳性的化合物为潜在人类致癌剂和/或致突变剂。由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关系，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的关系，故遗传毒性试验主要用于致癌性预测。,实验方法,Ames试验（污染物致突变性检测）是检测化学物质基因突变的常用方法。,沙门氏菌回复突变试验,鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。,在评价突变危害中常用的有特殊重要意义的试验,TK基因突变试验,TK基因突变试验是一种哺乳动物体细胞基因正向突变试验,近年来其应用价值有明显的提高。 TK基因突变试验的检测终点是胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因的突变。在人类，TK基因定位于17号染色体长臂远端；在小鼠则定位于11号染色体。故TK基因的突变属于常染色体基因突变。,TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷（TdR）生成胸苷酸（TMP）的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸（dUMP），即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加入胸苷类似物（如三氟胸苷，即TFTtrifluorothymidine），则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变，故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷，则TFT不能磷酸化，亦不能掺入DNA，故细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数，计算突变频率，以判定受试物的致突变性。,试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTK1等。其基因型均为tk+/-。TK基因突变试验可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。,转基因小鼠基因突变试验,转基因小鼠基因突变试验可在整体状态下检测基因突变,比较不同组织(包括生殖腺)的突变率,确定靶器官,对诱发的遗传改变作精确分析等。国外已陆续发展了多种用于突变检测的转基因动物,其中3种已投入商品化生产,MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠,它们分别采用大肠杆菌乳糖操纵子的LacZ和/或Lacl作为诱变的靶基因。,反向限制性酶切位点突变分析法(inverserestrictionsitemutation,iRSM),iRSM适用于快速检测诱变剂所致体内外DNA的突变，这些突变的特点是使某一酶切位点变为另一酶切位点。该方法建立者Jenkins等首先将iRSM应用于化学诱变剂所致动物体内p53基因的突变检测:小鼠分别口服N-乙基N-亚硝基脲(ENU)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)和二甲基酰肼(DMH)3天后,以iRSM方法相应地检测小鼠脾、骨髓和肝组织p53基因第6内含子区域的ApaAva位点反向突变。结果表明ENU诱发肝组织p53基因突变的发生率为33%,2-AAF使肝组织突变的发生率为25%,这一阳性突变率反映出了不同诱变剂对相应组织的致突变强度,进一步验证了该方法的高灵敏度和准确性。它具有灵敏度高、快速、操作简便、以及突变检测部位明确等优点,是一种较具实用价值和生命力的突变检测手段。,但是,iRSM的不足之处是仅能检测诱发限制性酶切位点反向的DNA突变。根据文献资料分析,化合物致突的发生具有一定的规律性,即结构类似的一组化合物常常引起一些特定序列较固定的碱基改变。例如,烷化剂和芳香胺类虽易使一连串鸟嘌呤(G)3端G发生突变12,13,这可能与该部位电荷密集有关,多数活性氧生成物质的D