医学遗传学设计实验

医学遗传学设计实验,实验设计方案：,6参考文献,一、实验名称 ：,二、总体设计思路：,三、具体设计方案：,1实验目的,2实验原理,3实验材料、试剂及器材,4实验方法及注意事项,5实验预期结果及遗传指导,一、实验名称 ：,从孕妇外周血中提取胎儿DNA进行a地贫的产前诊断,二、总体设计思路：,抽取孕妇外周血 提取胎儿DNA 利用 PCR技术进行胎儿DNA扩增 利用Sou-thern分子印迹杂交法检测出限制性片段长 度多态性（RFLP）进行基因诊断【用DNA限制酶处理扩增产物 琼脂糖凝胶电泳 转膜 探针标记 预杂交 Southern杂交 洗膜 放射性自显影检测】,三、具体设计方案：,1实验目的利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进行a地贫的产前诊断，从而进行遗传指导。 2实验原理：地中海贫血的分布遍及全世界，我国南方省区的发病率也较高，如广西壮族自治区可高达14.6%，其次为广东、海南、云南等。在遗传咨询的基础上，对高风险的胎儿进行产前诊断和选择性终止妊娠是防止遗传病、先天畸形患儿出生的最有效而可行的方法，对于减少群体中致病基因频率和提高人口素质具有十分重要的意义。,传统产前诊断方法一般采用羊膜腔穿刺、绒毛膜取样和脐静脉穿刺等，它们都具有创伤性，可能对孕妇及胎儿造成一定危害，如宫内感染、出血甚至流产、死胎等。利用孕妇外周血中游离的胎儿DNA进行产前诊断是一项非创伤性产前诊断技术，易于被孕妇接受。孕妇外周血中游离的胎儿DNA含量相对高，提取及分析过程简单，易于发展为可应用于临床的大样本高通量的检测方法。另外胎儿DNA在孕早期就可检测到，且分娩后很快被清除，不会受前次妊娠的影响。,PCR技术能在体外快速简便地扩增特异的DNA片段，为基因诊断分析提供了方便，被广泛运用于遗传病和肿瘤的基因诊断。若PCR产物的片段中包含有RFLP的切点，则可将PCR扩增产物用相应的限制酶处理，经电泳后检测其多态性，结合系谱进行分析，可进行基因诊断。,Southern分子印迹杂交是将酶解后的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过吸附作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，附着在滤膜上的DNA与32p标记的探针杂交，利用放射自显影技术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。此法可检测出限制性片段长度多态性（RFLP），从而进行基因诊断。,3实验材料、试剂及器材 3.1 材料： 孕妇的新鲜外周血5 ml、琼脂糖凝 胶（新制备）、硝酸纤维素滤膜（NC膜）、透明胶带、防护眼镜、塑料瓶、塑料袋、保鲜膜、滤纸、X光底片3.2 试剂： EDTA（乙二胺四乙酸）盐抗凝剂，012 ml 10% 的中性buffer溶液(含4 %的甲醛)，QIAamp DNA提取试剂盒(Qiagen)；Taq酶(Takara)，双蒸水， PCR缓冲液， dNTP (Promega)， AmpF1STR扩增试剂盒(ABI)；BamHI内切酶，DNA上样缓冲液，放射性物质（32p），变性液，预杂交液，2SSC（50%甲酰胺），X光片冲洗液。,3.3 主要仪器： 离心机，冰箱，基因扩增仪、微量移液枪(20l)，电泳仪，紫外透射仪，封口器，southern印迹杂交实验仪器，水浴锅（0，42，100），琼脂糖平板电泳装置，放射性检测仪，暗盒（加双侧增感屏）,4实验方法及注意事项4.1 方法步骤：4.1.1 血浆制备： 抽取孕妇外周血5 ml，加入EDTA抗凝剂，012 ml 10% 的中性buffer溶液(含4 %的甲醛)进行预处理。4.1.2 提取胎儿游离DNA：（1）离心 第一次离心：经预处理后的血浆以1600g的速度 离心10min，离心后取上清液置一20保存备用；,第二次离心：将第一次离心后的上清液以1300016000g的速度高速离心10min，离心后取上清液置一20保存备用。（2）提取胎儿游离DNA： 取出上清液按照血样DNA提取试剂盒(QIAamp DNAbloodmini, Qia2gen)说明书中血液DNA的提取方案提取DNA。,4.1.3 利用PCR技术进行胎儿DNA扩增: 采用15 bp的随机引物，反应体系为： l0PCR缓冲液5l ，Taq酶5 U，25 mmolL MgC12 5 l ，2.5 mmolL dNTP 4l ， 200 mmolL 15 bp随机引物5 l ，加双蒸水至50 l ，置于基因扩增仪上。反应条件为94预变性4 min 后，开始循环：94 1 min，37 2 min，55 4 min，循环30次，最后72 延伸5 min，4保存。,4.1.4利用Southern分子印迹杂交法检测出限制性片段长度多态性（RFLP）进行基因诊断 1用BamHI内切酶酶处理扩增产物，反应体系如下： 待酶切DNA 1g 双蒸水 适量 10X Buffer BamHI 2l BamHI 0.5-1l 总体积 20l 37孵育1小时或更长时间 结果可能获得10kb、14kb两种长度的含a珠蛋白基因簇的DNA片段。,2琼脂糖凝胶电泳（1）加样：取18l胎儿DNA酶处理液与2l的DNA上样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。（2）电泳：加完样后，插上导线，打开电源，按 照 需 要 调 节 电压至120V，电泳开始，观察电泳槽中负极的铂金丝处是否有气泡出现。（3）当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约1cm时，将电压回零，关闭电源，停止电泳。（4）取出凝胶，在波长为302nm的紫外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。,3转膜： 将凝胶中的单链DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜 上。4探针标记： 将纯化的DNA片段用放射性物质（32p）标记。5预杂交（prehybridizafion）（1）把预杂交液放在灭菌的塑料瓶中，在水浴中预热至杂交温度（42）。 （2）将表面带有目的DNA的硝酸纤维素滤膜放入一个稍宽于滤膜的塑料袋，用5-10ml2SSC浸湿滤膜。,（3）将胎儿DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷 却1-2min，使DNA变性。 （4）从塑料袋中除净2SSC，加入预杂交液，按每平方滤膜加0.2ml。 （5）加入变性的胎儿DNA至终浓度200g/ml。 （6）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，上下颠倒数次以使其混匀，置于42水浴中温育4h. 6Southern杂交（1）将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性。 （2）从水浴中取出含有滤膜和预杂交液的塑料 袋，剪开一角，将变性的DNA探针加到预杂交液中。,（3）尽可能除去袋中的空气，封住袋口，滞留在袋中的气泡要尽可能地少，为避免同位素污染水浴，将封好的杂交袋再封入另一个未污染的塑料袋内。 （4）置42水浴温育过夜（至少18h）。7洗膜 取出NC膜，在2XSSC溶液中漂洗5min，然后按下列条件洗膜：2SSC，42，10min；1SCC，42，10min；0.5SCC，42，10min；0.2SSC，56，10min；0.1SSC， 56，10min。边洗边用放射性检测仪检测放射强度，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。洗完的膜浸入2SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。,8放射性自显影检测（1）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感 屏）。 （2）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶带固定，合上暗盒。将暗盒置-70低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 （3）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。,4.2 注意事项： 1胎儿游离DNA提取时应尽量减少血样放置时间，以减少细胞坏死和溶解，提高胎儿游离DNA的检出率。2PCR扩增时，其最关键的是引物的设计：长度为1530核苷酸，GC含量50% TM值处于5662之间，3末端必须严格与模板DNA配对，其构成DNA延伸的起始点。3PCR扩增时，反应的退火温度应慎重选择，温度高可提高特异性，但敏感性降低，温度低则反之。4印迹时，两块玻璃板之间灌的胶一定要早并且要防止胶漏。5应确保每孔上样量一致，不致使带跑得比窄。,6倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓缓加，不要打到头，以免带入气泡。7转膜过程中注意降温，要防止微量进样器被 堵。8内切酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20保存。9把Buffer和水等充分混匀后再加入内切酶，加入内切酶后可以用枪吹打或轻轻Vortex混匀。10加样时小心操作, 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。,11紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩, 以免损伤眼睛。12因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA。因此，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，13转膜必需充分，要保证DNA已转到膜上。14若用到有毒物质，必需注意环保及安全。 15在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性。16保鲜膜与硝酸纤维素滤膜之间不能有气泡。,5实验预期结果及遗传指导,预期结果： 1 2 3 4 10kb 14kb,_ _ _ _,（1）出现结果1（aa/aa），正常，建议生育；（2）出现结果2 (aa/a-)，静止型a地中海贫血，患 者无任何临床症状和异常血象， 仅在出生时的脐血中检出1%5%的Hb Barts。视情况建议生育；（3）出现结果3（aa/-），轻型a地中海贫血，临床上无明显的临床症状，个别人表现为轻度低色素小细胞性贫血，出生时有5%15%的Hb Barts。红细胞有轻度形态和渗透性改变，可查到少量的HbH包涵体。建议不生育；（5）出现结果4（a-/-），HbH病， 建议不生育；,6参考文献1王文博、张 毅、孙树汉。孕妇外周血中胎儿游离DNA在产前诊断中的应用，第二军医大学学报 2009年4月第30卷第4期。2王修海、姜晓静、纪向虹。孕妇血浆胎儿DNA检测及其在产前诊断中的应用，青岛大学医学院学报，2007年2月第43卷第1期。3 龙兴江、龙桂芳、林伟雄。利用孕妇外周血浆中小片段游离胎儿DNA进行a-地中海贫血无创性产前诊断，中国优生与遗传杂志，2008年第16卷第10期