蚕豆病鉴定的实验设计

年级、专业、班级： 2010级临床三、四大班实验课时间：2012年4月18日实验室：第二实验室组别：第四组组员：梁婧、和珍、李艳、张玲艺、解汐卓、成春梅、 吴皎、杨紫燕、王骁、张庆昆报告人：吴皎,患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。 体格检查：体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。 实验室检查：红细胞 1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（+），潜血(+)，尿胆红素()，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。,案例,1、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初 步判断患儿是何种疾病？2、请设计实验进一步明确诊断。3、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。4、 要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？5、 患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？,初步判断患儿是何种疾病？,红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症（蚕豆病）,性别：男性年龄：3岁主要症状：体温38、面色苍白、血尿1天、皮 肤及巩膜黄染、恶心、呕吐 诱因：1天前食用新鲜蚕豆既往史：患者的姐姐也曾发生过类似情况,概念：G6PD缺乏症是一种遗传性溶血性疾病。发病率 具有地方、民族差异性。,发病机制：,G6PD,NADPH+H+,GSH, 红细胞的抗 氧化能力,发生溶血,红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症,正常红细胞,溶血性贫血 红细胞,左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）,左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）,正常红细胞,溶血性贫血 红细胞,左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）,正常红细胞,溶血性贫血 红细胞,左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）,分类： 伯氨喹啉型药物性溶血性贫血 新生儿黄疸 蚕豆病 感染性溶血 先天性非球形细胞溶血性贫血（CNSHA）,红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症,蚕豆病 是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。,红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症,主要临床表现：早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾肿大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于12日内死亡。,遗传方式：G6PD缺乏症是一种X连锁不完全显性遗传,母：XX 父：XY,子代： XX XX XY XY,儿子一定患病，女儿则50%,母：XX 父：XY,子代： XX XX XY XY,儿子一定正常，女儿则50%,母：XX 父：XY,子代： XX XX XY XY,女儿50%机会患病，儿子50%机会携带该基因,X-致病基因,患该病的男女比例约为=7:1,从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果,主要临床表现：1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白 2. 皮肤及巩膜黄染 3. 体温升高 4. 呼吸急促,1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白,G6PD,GSSG(氧化型谷胱甘肽),NADPH+H+,NADP+,A,AH2,2GSH(还原型谷胱甘肽),GSH的主要作用： 保护红细胞内的含硫氢基（-SH）血红蛋白 、酶蛋白和膜蛋白的完整性，免遭氧化 与谷胱甘肽过氧化酶共同使H2O2还原成H2O,NADPH+H+,红细胞的抗氧化能力,GSH,红细胞 膜破裂,溶血性贫血（面色苍白）,游离Hb肾 吸收阈值,血红蛋白尿/ 含铁血黄素尿,2. 皮肤及巩膜黄染,机理：溶血性黄疸,3. 体温升高,机理： 红细胞破裂, 血红蛋白暴露, 免疫系统攻击（单核-吞噬细胞系统）, 体温升高,4. 呼吸急促,溶血性贫血 具有载O2能力的Hb含量下降机体缺O2呼吸急促,红细胞 1.981012/L （6.0-7.0）1012 血红蛋白53g/L （170-200)g/L 血清总胆红素85.5mol/L （3.4-17.1）mol/L 结合胆红素13.7mol/L 未结合胆红素71.8mol/L 尿蛋白（+） 、潜血(+) 尿胆红素()、尿胆素原(+),从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果,实验室检查结果 正常值,2、设计实验进一步明确诊断。,贫血、黄疸,有和无遗传史,无或有诱因（食用蚕豆、服用药物、感染）,体征：脾肿大、黄疸,血常规检查,血清学检查,检查HA的病因,G6PD筛选试验,G6PD确诊试验,Hb、网织红细胞,间接胆红素尿胆原游离Hb结合珠蛋白,怀疑其他HA,相应病因检测结果正常,G6PD荧光斑点试验,红细胞G6PD活性测定,G6PD基因分析,其他筛选试验,高铁血红蛋白还原试验,初诊或确诊G6PD缺陷症,确诊溶贫（血管内溶血）,确诊G6PD,做1项或2项,做1项,高铁血红蛋白还原试验 G6PD荧光斑点试验 红细胞G6PD活性测定,筛选试验,确诊试验,一、高铁血红蛋白还原试验,实验原理：在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）。,亚铁血红蛋白 高铁血红蛋白,亚硝酸钠,高铁血红蛋白还原酶 NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体),实验反应方向,实验原理,主要试剂：0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液、 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液、混合液 （等量+）、生理盐水、抗凝剂,仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支,高铁血红单白还原实验,实验流程,取静脉血1. 8mL 于抗凝管，混匀抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg),离心沉淀 1000 r/ min 15 min,调整 血细胞血浆=11 ，混匀 调整后全血（备用）,1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 混匀 混合试剂（备用） 1ml 0.14 mmol/ L 亚甲基蓝液,高铁血红单白还原实验,实验流程,取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入试剂,高铁血红蛋白还原试验操作步骤,混合试剂/ mL 0. 01 / /生理盐水/ mL / 0. 01 /0. 18 mol/ L 亚硝酸钠- / / 0. 010. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1来回摇动1520 次,置37 水浴箱静置3 h蒸馏水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml,试剂 A B S,高铁血红单白还原实验,B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管及“S”管吸光度,实验流程,计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb % = (1 - A/ S) 100 %,高铁血红单白还原实验,实验过程注意事项,实验一（高铁血红蛋白还原试验）：,1、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。 应将血细胞比容调整到0.35-0.402、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等 应无菌3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果， 故应2h内送检4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏,二、G6PD荧光斑点试验,实验原理：葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性,NADP NADPH,G6P 6PGA,G6PD,实验原理,试剂：反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀,仪器：长波紫外灯、滤纸、水浴箱,G6PD荧光斑点试验,实验流程,G6PD荧光斑点试验,取试管，加10l全血+100l反应液，混匀，取一滴于滤纸上（第一斑点 ）作为对照,将上液置于37水浴10min ，再取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）实验组,晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时,根据结果作出相应诊断,实验二（G6PD荧光斑点试验 ）：1、检测的第一点作为实验对照应无荧光或弱荧光出现2、每次试验应用正常标本（已知G-6-PD正常）作阴 性对照。如可能选用已知G-6-PD缺乏者的标本作 阳性对照3、如贫血严重取血量应相应加大，或用红细胞混悬液 进行检验4、为提高敏感性可在反应液中加入1份8.0mmol/L GSSG,实验过程注意事项,三、红细胞G6PD活性测定,实验原理：基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次），求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。方法：WHO推荐的Zinkham;NBT定量法等,实验原理,试剂：生理盐水、溶血素 、3.8mmol/L NADP 、0.5mol/L Tris缓冲液（pH7.5） 、0.63mol/L氯化镁溶液 、33mmol/L G-6-P液,仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管,实验流程,取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心 10min）,除去上清液和乳白层（白细胞和血小板）加等体积生理盐水红细胞悬液,红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min 溶血液并测定其Hb浓度,进行比色 （见下表）,红细胞G6PD活性测定,G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 ),试管 对照管 测定管,NADP液（ml） 0.1 0.1Tris液（ml） 0.1 0.1氯化镁液（ml） 0.1 0.1蒸馏水（ml） 0.68 0.58G6P液（ml） 0.1 37预热溶血液（l） 20 20,红细胞G6PD活性测定,立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化,实验流程,计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =A/min1000/6.221020/20 Hb(gL-1),A/min:每min吸光度的平均变化值1000/6.22:为微摩尔消光系数1020/20:总容量与溶血液的量之比；,实验流程,红细胞G6PD活性测定,实验三（红细胞G6PD活性测定）： 1、急性溶血期后23个月再查或复查 G6PD活性 2、最好同时作阴性对照和阳性对照（影 响因素多） 3、离心沉底后应取底层红细胞测定 G6PD活性,实验过程注意事项,结果分析方法,一、高铁血红蛋白还原试验： 正常值：MHb还原率=75%，脐血=77% 临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者： MHb还原率 30% 脐血 40% 杂合子患者： MHb还原率 31%74% 脐血 41%76%,二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验 正常人： 0min斑点无荧光，5-10min出现， 10min荧光最强 临床诊断： 轻度缺陷者：0-10min荧光很弱或不出现 中度缺陷者：10-30min出现荧光 严重缺陷者：30min内不出现荧光,结果分析方法,三、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以 上即可作出诊断,方法 正常值范围,WHO推荐的Zinkham (12.012.09)IU/gHb(37)ICSH推荐的Glock与McLoan法 （8.341.59）IU/gHb(37)NBT定量法 （13.130.0）NBT单位Chapman和Dern法 （2.87.31）IU/gHb(25),结果分析方法,G6PD缺乏症的诊断要点,临床符合上述任何一型，加上以下各项中任何一项均可诊断1项筛选试验活性严重缺乏值1项筛选试验活性属中间缺乏值，伴有明确的家族史2项筛选试验活性均属中间缺乏值1项G6PD活性定量测定其活性较平均值降低40%以上,综合诊断 诊断要点,可以用哪些技术检测什么目的基因？ G6PD基因分析,探针技术 放射性核素 生物素（DIG探针） 荧光染料 印迹技术,DNA印迹蛋白质的印迹分析,实验原理：原位杂交（in situhybridization histochemistry ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。,原位杂交技术,原位杂交技术（DIG探针）,主要试剂：二甲苯、各级浓度酒精、蒸馏水、0.01mol/LPBS 、3%双氧水-甲醇溶液 、打孔液 、过氧化氢封闭液 、消化工作液（胃蛋白酶