抗核抗体检测的质量要求及结果的合理判读李晓军(2)

抗核抗体检测的质量要求及结果,的合理判读,李晓军,南京军区南京总医院,全军临床检验医学研究所,自身免疫性疾病,自身免疫病(Autoimmune diseases,AID),主要病理基础：,-血清中存在有一种或多种针对自身组织成份的抗体标志,物及自身反应淋巴细胞,致病机制：,-自身抗体和自身反应淋巴细胞在AID的发病过程中起重,要作用,1)体液免疫：由自身抗体介导、过敏反应导致的组,织损伤,2)细胞免疫：自身反应性T细胞介导的细胞毒作用3)二者共同参与：抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用,（ADCC）,4),自身免疫病的系统受累,AID的类型：,1）器官特异性AID,2）系统性AID（非器官特异性）,AID主要特征：,1）相关的临床症状,2）ESR增高, 血清Ig, 自身抗体、CIC阳性, 血清补体(C3、C4)活,性降低,3）有病变且病变处存在有与自,身抗原分布相关的免疫活性细胞或抗体,4）将相关抗原给动物注射时能,重复出类似人的疾病，当被动输入淋巴细 胞或抗体时可将疾病从患病动物转移给正常动物,自身免疫病的“病谱”,器官特异性,非器官特异性,桥本甲状腺炎,扩张性心肌炎,自身免疫性溶血性贫血,系统性红斑狼疮,原发性粘液水肿 恶性贫血,特发性血小板减少性紫癜 干燥综合征,甲状腺机能亢进 自身免疫性胃炎,特发性粒细胞减少症,类风湿关节炎,Addisino病1型糖尿病重症肌无力多发性硬化症脱髓鞘疾病寻常型天疱疮类天疱疮,自身免疫性肝炎原发性胆汁性肝硬化原发性硬化性胆管炎溃疡性结肠炎克罗恩病自身免疫性肾小球肾炎肺肾出血综合征,绝经过早（少数病例）男性不育（少数病例）交感性眼炎晶状体源性葡萄膜炎,硬皮病多发性肌炎/皮肌炎混合性结缔组织病系统性血管炎抗磷脂综合征药物性狼疮,自身免疫病共同特征,1. 病因不明,2. 女性居多，发病率随年龄增加而增加3. 有遗传倾向,4. 患者血清中有多种自身抗体或自身反应性致敏淋巴细胞5. 疾病有重叠现象，即一个病人可同时患一种以上自身免疫,病,6. 病程一般较长，多迁延为慢性,7. 病损局部可发现淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞等浸润8. 免疫抑制剂治疗可取得一定疗效,自身免疫病主要实验检查,自身抗体,免疫球蛋白补体,淋巴细胞细胞因子,自身抗体与临床疾病的关系,天然自身抗体：维持机体内环境稳定,靶抗原：肌动蛋白、肌球蛋白、角蛋白、DNA、胶,原、Ig、细胞因子等，多为IgM型、低滴度；,病理性自身抗体：在免疫风湿病的发病过程中起重要作用,1）诊断、鉴别诊断：抗dsDNA、抗Sm抗体与SLE；抗CCP与RA；AoAb与、女性不育、流产有,关者,2）疾病监测、预后判定：抗dsDNA为SLE疾病,活动标志,自身抗体的特性,自身免疫性疾病的重要标志,高滴度存在于自身免疫性疾病患者,与疾病的活动性相关,参与免疫病理性损伤,常检测的自身抗体,抗核抗体（ANA）,抗可提取性核抗原抗体（A-ENA）抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）类风湿因子（RF）,抗角蛋白抗体（AKA）,抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）,抗核抗体（ANA）,抗核抗体:针对真核细胞（HEp-2、肝细胞）各种核,成分靶抗原的自身抗体的总称。,抗核抗体（ANA）抗DNA抗体（anti-dsDNA，anti-ssDNA ）抗组蛋白抗体（histones: H1 , H2A , H2B , H3 , H4 , H2A-H2B）抗ENA（抗: Sm , nRNP , SSA/Ro , SSB/La,rRNP , Scl-70 , Jo-1 , PCNA , .）,ANAs,抗非组蛋白抗体抗着丝点抗体（ anti-CENP -A , B , C ，D，F，G）抗核仁抗体抗其他细胞成分抗体（高尔基体，中心体，纺锤体，线粒体，溶酶体，肌动蛋白，Vimentin，细胞角蛋白，Lamin),1.,2.,3.,4.,抗核抗体谱的分类和命名,以首先检出该抗体的患者名字命名，如抗Sm、抗Sa 抗体等；,以相关疾病命名，如抗Scl-70、抗SS-A、抗SS-B 抗体等；,以抗原的部位命名，如抗核仁抗体、抗线粒体抗体、抗核膜抗体、抗细胞浆抗体等；,以抗原的化学名称分类命名，如抗DNA、抗RNP、抗组蛋白抗体,抗核小体抗体等。,常规临床诊断ANA种类:数十种,新自身抗体和检测方法:陆续被引进临床实验室,为临床医生提供更多的选择和诊断指标,另一方面也带来一定的困惑?,如何根据患者病情挑选具有诊断价值的最佳自身抗体组合?如何选择合理的检测方法，并对结果作出正确的判断?将为患者得到及时准确的诊断和治疗发挥至关重要的,作用!,免疫检验工作者的目的:,广泛向临床医生宣传有关ANA项目及其检测技术的价,值及其限制，,宣传ANA选择的适应征及有效性，从而对检测结果作,出科学合理的判读。,保证检测结果的可靠性和准确性,让临床医生了解各种测定方法的特性,包括方法的精确度、灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值、似然比等，关系到医生如何准确地选择这些检测项目服务于患者，并合理地利用资源。,敏感性（sensitivity）特异性（specificity）,敏感性: 某检验项目对某病具有鉴别、确认的能力,患者阳性结果的百分比,特异性: 某检验项目排除无某病的能力,非患者阴性结果的百分比,敏感性和特异性取决于所选用的cut-off值某法敏感性越高，特异性就越低，反之亦然,应优选能获得最佳敏感性和特异性组合的cut-off值,敏感性和特异性并不能告诉医生阳性结,果的个体是否患某种疾病，阴性结果的个体是否不患某种疾病,而临床医生关心的是，ANA阳性者中有多少是CTD患者；ANA阴性者中有多少不是CTD患者。PPV和NPV即回答这一问题,阳性预测值（PPV）阴性预测值（NPV）,PPV：试验结果阳性者中真正患病的概率NPV：试验结果阴性者中未患病的概率,PPV和NPV是临床试验中对试验有用性的正确评价指标PPV和NPV受人群患病率的影响：,患病率： PPV ，NPV,理想的ANA试验：,高PPV：大部分阳性结果者是CTD患者高NPV：大部分阴性结果者不患CTD,ANA检测的选择原则,临床医生选择ANA检测的目的：,1）在有典型症状患者中作出CTD的诊断2）在症状不确定患者中排除CTD的诊断3）明确CTD的类别4）判断病情活动度,ANA检测的选择原则,通常原则:,）首先采用以HEp-2细胞为基质片的IFA作,为筛查实验，以有效地排除CTD的存在,）ANA阳性 进一步检查抗ds-DNA或抗ENA抗体，以期对CTD作出特异性地诊断。）不主张单独用抗ENA抗体作为筛查实验,ANA免疫学测定方法,琼脂双向扩散或对流免疫电泳,-抗ds-DNA，抗Sm，抗U1RNP,Farr试验：抗ds-DNA,间接免疫荧光技术：细胞内抗原自身抗体检测的“金标准” (筛查),-抗核抗体(ANA)、抗ds-DNA抗体、抗平滑肌抗体,(ASMA)、ANCA等,酶联免疫吸附试验(ELISA):自身抗体确认免疫印迹免疫斑点技术:自身抗体确认,-ENA多肽抗体谱、AMA(M2/M4/M9)、抗LKM-1、抗LC-1、抗,SLA/LP等,微阵列免疫芯片技术悬浮芯片技术,IFAANAIFA筛查ANA有效的“金标准”,基质片抗原：鼠肝匀浆组织敏感性差，不能测出抗SSA,Hep-2细胞阳性检出率高,Ro60 cDNA转染Hep-2细胞（Hep-2000TM）可显著提高检测抗SSA/Ro抗体的敏感性,1),IFAANA,如何鉴别假阳性现象(滴度, 核型)?血清稀释度：,1:40：健康人ANA高达30%；,1:160： 则仅5%,高滴度的ANA阳性结果方有诊断意义,2) 核型:,3) A-ENA:健康人A-ENA常为阴性,Mariz.Arth Rheumatol, 2011, 63: 191,ANA-IFA核型有助,于区别正常人,ANA+和ARDANA+?,密而细颗粒型,抗核膜抗体(抗板层素抗体),荧光模式:,在核膜区呈现线状荧光, 中心区域荧光强度弱(Hep-,2), 而肝细胞片:中心区域发暗,无荧光, 此点可与核均,质荧光相区别.靶抗原:,包括60kD, 68kD和74kD 3种蛋白组分,与中间丝相关,以网状形式包被在核内膜的内部.,相关疾病: 慢性活动性自身免疫性肝炎的活动期.,ANA(均质型),荧光模式:,Hep-2细胞: 间期细胞核阳性,呈均匀的荧光; 核仁与,核浆一样呈强度相同的均质荧光; 分裂期染色体阳性,(增强), 亦呈均匀的荧光.,肝细胞片:肝细胞核阳性,呈均匀的荧光, 与Hep-2细胞的荧光强度一致.,主要相关自身抗体:,抗ds-DNA, 核小体和组蛋白抗体等.,EUROIMMUN,粗颗粒型抗RNP/Sm抗体荧光模式: Hep-2细胞:间期时,整个细胞核呈现粗颗粒,但有时也出现中等到细的颗粒荧光,核仁为阴性;在分裂期细胞中,浓缩的染色体部位为阴性,而外周区几乎为均质型、光滑的荧光.灵长类肝组织切片:细胞核亦呈现颗粒型荧光,核仁为阴性,荧光强度与 Hep-2细胞相同.细颗粒型抗SS-A/SS-B抗体荧光模式: Hep-2细胞:间期细胞核呈现细颗粒型荧光,核仁有部分不发荧光。分裂期细胞在染色体以外显示颗粒荧光,而染色体本身则不发荧光. 灵长类肝组织切片: 肝细胞核及部分核仁可见细颗粒荧光,细胞浆不发荧光. 在某些细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞）中的荧光,反应较强,EUROIMMUN,ANA常见核型与疾病关系,Diagnostic Pathology 2009, 4:1,ANA临床诊断CTD特性,Diagnostic Pathology 2009, 4:1,Arth Rheumat,2002,47, pp 434444,ANA(+)临床诊断意义,对疾病诊断非常重要SLE、系统性硬化病,对疾病诊断有一定作用,干燥综合征、多发性肌炎-皮肌炎,对监测预后非常重要,幼年型慢性关节炎、雷诺现象,疾病诊断标准的重要组成部分,药物引起的狼疮、混合性结缔组织病,对疾病诊断、监测预后没有作用,类风湿性关节炎、多发性硬化症、甲状腺疾病、传染病、特发性血小板减少性紫癜纤维组织肌痛,IFA法检测ANA时应注意的问题,ANA滴度和荧光图谱不能作为判断抗体特异性的标准，结,果阳性时应进一步作特异性抗核抗体项目的检查,IFA限制:,*ANA(-)， 抗ds-DNA(+)， 抗ENA(+) 技术误差,SLE特殊类型,*某些ANA(抗SSA/Ro、抗SSB/La)用IFA难以测出*Jo-1抗原属于胞浆抗原，IFA检测ANA阴性时不能排,除抗Jo-1的可能,IFA法检测ANA时应注意的问题,如果临床高度怀疑CTD，应同时做ANA和抗ENA抗体，即使ANA(-) ，也要进行抗ENA抗体的检测，否则会漏检一些ANA如抗SSA/Ro、SSB/La或抗Jo-1抗体。,IFA法检测ANA时应注意的问题,由于目前国内缺乏合适的质控品，检测结果在实验室间很难做到标准化。每个实验室必须规范化各自的操作规程，确立各自的cut-off值，使判断标准兼顾到诊断敏感性和诊断特异性的平衡。应该参加当地或国家的室间质量评价（external quality assessment，EQA）计划。目前，国际上已有抗核抗体的标准参考品结果解释应密切结合其他临床指标,ANA室间结果很难具备可比性15个国际Lab同时用HEp-2-IFA进行ANA的检测，所获得的平均变异系数（CV）值如下：,1:40 1:80室内CV（%） 16.5 13.1室间CV（%） 50.7 44.3,1:16012.237.9,1:32012.836.0,每个实验室应根据各自情况，建立本室的cut-off值，以确保实验结果的精确性和可比性,部分自身抗体的国际参考品,参考品WHO Wo80WHO1064,特异性dsDNA 100 IU/ampoule均质型ANA 100 IU/ampoule,MRC 参考品A 均质型ANA 100 IU/ampoule,WHO1063WHO1061CDC参考品,nRNPIgM ANA 100 IU/ampouledsDNA、La、U1-RNP、Sm、Ro、中心粒、Scl70、Jo-1,抗ds-DNA检测,抗ds-DNA与SLE及狼疮性肾炎的发生及其活动程度密切相关。,检测常用短膜虫IFA（CLIF）、Farr试验和ELISA技术。,Farr试验是经典的特异性检测方法，但可测出,高亲和力的IgM类抗ds-DNA。,目前临床推荐使用的是测IgG类抗ds-DNA的ELISA和CLIF,单链DNA,变性的DNA (嘌呤和嘧啶碱基)双链DNA,天然DNA(氧核糖核酸骨架)相关疾病:风湿病: ssDNA: SLE: 80.8%; Sjgrens综合征: 40.0%;硬皮病: 44.0%; RA: 12.3% (欧蒙)健康献血员: 6.8% (欧蒙)风湿病: dsDNA: SLE: 30% - 90%; 欧蒙 (51.7% )抗dsDNA抗体ANA(均质型)组蛋白抗体：抗原:组蛋白H1, H2A, H2B, H3, H4(主要的靶抗原为H1和H2B); 功能: 核小体的形成相关疾病: 药物诱导性 LE:100% (抗组蛋白抗体是该病唯一的标志性抗体); SLE:40% - 80%、欧蒙(56.4%); 在其他风湿病中很少见抗核小体抗体:抗原:组蛋白和DNA形成的复合物; 功能:染色体的功能,亚单位。相关疾病: SLE: 58% (欧蒙研究)欧蒙第二代: 对SLE的特异性为100%,EUROIMMUN,使用注意事项,（1）不同组织来源（哺乳类或非哺乳类）的DNA做固相抗原，,会有不同的结果,（2）某些试验可测出不同Ig类别的抗ds-DNA。如Farr试验，或用多克隆抗人Ig抗体建立的ELISA或CLIF可检测出IgM类抗ds-DNA。该类抗ds-DNA无诊断SLE的特异性。因此应该采用检测IgG类抗ds-DNA的ELISA或CLIF,使用注意事项,（3）高亲和力抗ds-DNA对SLE特别是狼疮性肾炎有特异性诊断价值，低亲和力抗体则无。但ELISA往往能测出低亲和力的抗ds-DNA，因此若ELISA结果阳性，必须用CLIF或Farr试验予以确认。,（4）CRP和ssDNA在Farr试验、脂蛋白-IgG复合物在CLIF中,可引起假阳性结果,（5）严格执行室内质量控制以确保检测结果在实验室间的,可比性，实验室应该参加室间质量控制（EQA）计划,抗可提取性核抗原（ENA）抗体谱的检测, 抗Sm抗体：SLE标记性抗体（20%30%） 抗nRNP抗体：MCTD 95%100%（高滴度） 抗SSA抗体：PSS 60%75%，其它CTD 抗SSB抗体： PSS 10%40%，其它CTD, 抗Scl-70抗体：SSc 25%75%, 标记性抗体 抗Jo-1抗体：PM/DM 25%，标记性抗体, 抗组蛋白抗体： SLE特异性抗体（50%70%）,抗ENA抗体检测方法,双向免疫扩散（ID）对流免疫电泳（CIE）,免疫印迹法（Western-blot）免疫斑点ELISA,酶免疫斑点法,DID和CIEP,抗原与抗体在琼脂(或琼脂糖)凝胶中扩散或电场泳动中相遇形成沉淀线，通过对沉淀线的鉴别和用阳性血清作对照来进行判断。经典的检测ENA抗体的方法CIEP的敏感性和特异性DID,某些带负电荷较少的抗原如Scl-70，在CIEP中的移动方向会与抗体一致而不形成沉淀线优点：操作便利，特异性高，,缺点：果判断带有一定的主观性，需要经验，耗时长，不易获得阳性标准血清,酶联免疫吸附试验(ELISA),操作快速简便，自动化程度高，定性和定量分析关键是获取纯化的特异抗原。重组抗原由于纯度的提高，也大大提高了检测的特异性存在的问题：,）重组抗原中可能混有大肠杆菌抗原，患者体内的抗,菌体蛋白抗体在试验中可能造成假阳性反应,）重组抗原缺乏翻译后折叠修饰过程，不能形成天然二级、三级结构，可能丢失某些空间构像的表位，导致实验的假阴性反应。采用真核系统表达重组抗原有助于解决这类问题。,免疫印迹技术（IB）,特异性和敏感性比DID、CIEP高，能在一次检测中，同时完成对多种特异性（抗Sm、抗U1RNP、抗SSA、抗SSB、抗Scl-70、抗J0-1及抗核糖体抗体等）的识别和过筛,因为抗原经SDS-PAGE后发生变性，该法检测的是抗线型抗原表位的抗体,蛋白质转印效果不佳，本底染色深,SSA抗原转印效果差，加上15%的抗SSA抗体仅识别立体构象的抗原表位，检测抗SSA的敏感性要低于CIEP和ELISA；也不能测出某些抗Scl-70抗体,免疫斑点技术（IB）,IB绕过凝胶电泳，直接将纯化的自身抗原包被在NC膜上,由于抗原位置固定，结果判断比WB简单、可靠,包被抗原纯度高，膜条上没有多余蛋白，显色后非特异背景比WB要弱,Jo-1 Centro,液态芯片技术目前，国际上有BMD、BioRad Diagnostics、INOVA Diagnostics 、ZEUS Scientific 基于液芯平台ANA检测产品国内尚未常规开展,SSA,SSB,RNP,Scl-70,Sm,mere B DNA,Chromatin,迄今为止还没有一种检测抗ENA既高特异又高敏感的方法。欧洲Consensus Workshops曾推荐采用两种或两种以上的方法检测抗ENA抗体，由于费用昂贵，目前难以广泛采纳。某些实验室采用ELISA-CIEP联合应用检测技术来解决ELISA低亲和力的问题，例如，先用简便快速的ELISA筛查抗ENA抗体，阳性标本再用CIEP予以确认，但常规实验室也难以接受,ELISA,DID,CIE,PHA,ANA测定方法比较,方法IFANAWesternblot,优点经济、易操作、高灵敏度和特异性自动化、可定量、高灵敏度、可进行抗体分类经济、高特异性、可同时检测多种抗体经济有效、高特异性、可同时检测多种抗体、比双扩散快半定量、高特异性比