胃癌胰岛素样生长因子2基因的印迹状态的检测0522

胃癌胰岛素样生长因子-2基因的印迹状态的检测,大连医科大学生物学教研室,一、基因印记的概念 是一种在基因组DNA水平对双亲等位基因特异性的修饰作用。结果导致来自不同性别亲本（父母）的同源染色体上等位基因存在功能上的差异。,驴马正反杂交实验结果公驴 母马 公马 母驴 骡 駃騠,基因组印迹现象最早由Helen Crouse于1960年在昆虫研究中首次提出。 Sciara昆虫的两条X染色体,1980年，Cattanach等人发现，具有两条母源11号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠小，而具有两条父源11号染色体的小鼠在胚胎期比正常小鼠大。但是，这两种小鼠胚胎都无法正常发育而死于发育阶段。,1984年，McCrath等人用人工单性生殖的方法产生了两种特殊类型的小鼠胚胎：一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自雄性亲本，另一种小鼠胚胎的全套染色体全部来自雌性亲本。但两类小鼠均在发育期死亡。,1991年，Dechiara等人做了小鼠IGF-2剔除基因的实验，首次证明了生物体本身带有基因组印迹基因。 实验发现，敲除父源IGF-2等位基因小鼠发育成成体个体小，但若剔除的等位基因来自母源，动物的个体没有变化。 直至1993年，Feinberg实验室首次发现了基因组印迹也存在于人类。,二、基因组印迹与肿瘤的关系 IGF-2作为印迹基因，在正常人群里，只有父系的等位基因表达，母系的等位基因则处于静止状态。 约有40%WT的患者肿瘤组织中发现有IGF-2等位基因父母系共同表达。这种静止的基因被重新活化表达的现象，称作LOI（Loss of imprinting）。,结肠癌患者也可检测到IGF-2的LOI现象，而且这种现象不仅存在于癌组织，也存在于癌旁组织和病人的血细胞中。由此被认为这种现象很可能成为该病早期诊断的指标。 此外，已经发现与基因组印迹异常有关的肿瘤还有肝癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、神经胶质瘤、前列腺癌等等。,目前已经被证实与人类肿瘤发生相关的印迹基因除IGF-2外，还有WT1、P57KIP2、P73、NOEY2以及M6P/IGF-2R等等。,三、IGF-2基因 LOI的检测方法,1、DNA水平筛选杂合子2、RNA水平观察杂合性是否完整,酶切位点：GGGCC|C GTGCCC C|CCGGG CACGGG,即该序列在人群中存在SNP： 等位基因a 5-GGGCCC-3等位基因b 5-GTGCCC-3人群中将形成三种基因型： GG TT GT,杂合子的鉴定可以通过PCR产物酶切后电泳的方法完成,GG TT GT,236 bp,173 bp,63 bp,LOI的鉴定可以通过杂合子RT-PCR产物酶切后电泳的方法完成,236 bp,173 bp,63 bp,正常(印记) 正常,LOI,一、实验安排,实验一 基因组DNA的提取,【基本原理】 常规酚/氯仿抽提法提取基因组DNA的原理在于用蛋白裂解液和蛋白酶将组织充分消化后，再应用酚/氯仿将蛋白质变性，而核酸则溶于水相，再在一定浓度的盐和无水乙醇的作用下将核酸从水相中析出。,【器材】 1电子天平；2匀浆器；3EP 管 ；4冰盒；5手套；6高速离心机【试剂】 1酚；2氯仿；3无水乙醇；475% 乙醇；5纯水,【操作步骤】,胃癌组织,洗涤200ul PBS,离心8000rpm 5min,消化180ul TE,20 ul 10% SDS3 ul 蛋白酶K ,50 2h,弃上清留100 ul,酚提取300 ul 酚,离心10000rpm 10min,移水相至新管,酚、氯仿抽取150 ul 酚150ul 氯仿,离心10000rpm 10min,移水相至新管,沉淀DNA1/10 V NaAC (30 ul)2V 乙醇 (600ul),离心10000rpm 5min,洗DNA75 % 乙醇 300 l,弃上清,离心8000 rpm 5min,弃上清,干燥,溶解DNA适量TE,实验二 组织总RNA的提取,【基本原理】 组织中的RNA主要分布在胞浆中，包括mRNA、tRNA 和 rRNA 三种。mRNA 含量最低，半衰期短，易于降解。在 RNA 的提取过程中，主要采用强变性剂，如异硫氰酸胍等破坏细胞结构，失活RNA酶。细胞碎片、蛋白质等经酚、氯仿等有机溶剂抽提被去除。真核生物中18S rRNA、28S rRNA 经琼脂糖电泳后，在紫外灯下可观察到两条清晰的条带。,RNA提取关键: 防止内源性和广泛存在的外源性RNA酶，如器皿、试剂和手上等存在的RNA酶对核酸的降解作用，所用材料、器皿均需经DEPC处理（包括0.1% 溶液浸泡过夜，蒸馏水冲洗及高压灭菌15 min去除残存的DEPC）。,【器材】 1电子天平；2匀浆器；3EP 管 ；4冰盒；5手套；6低温冷冻高速离心机【试剂】 1TRIzol试剂（Invitrogen/GIBCO BRL）；2氯仿；3异丙醇；475% 乙醇；50.1% DEPC处理水,【提取RNA操作步骤】,胃癌组织,制备匀浆200ul Trizol,孵育4 12h,盖上盖后摇动15sec,加氯仿40 ul,冰上放置5min,离心12000rpm 4 ,15min,移水相至新管,加异丙醇100 ul,冰上孵育10min,离心12000rpm 4 ,10min,弃上清,洗涤沉淀75 % 乙醇 200 ul,离心10000rpm 4 ,5min,空气干燥,溶解RNADEPC水 20 ul,-70保存,实验三 反转录聚合酶链反应 (RT-PCR),【基本原理】 PCR是体外扩增DNA的方法，但不能直接以RNA 为模板扩增。利用反转录酶（RTase），可由 mRNA 生成cDNA（第一链）。以此 cDNA 为模板即可进行 RNA 的 PCR扩增。如果在 PCR 反应中，除加入待扩增的特异基因的引物外，再加入常用的 -actin 或GAPDH 引物作为内参基因扩增，则可对特异基因的转录水平进行半定量分析。,RT- PCR的原理,【器材】 1PCR扩增仪；2恒温水浴箱；3紫外灯检测仪；4EP 管；5手套【试剂】1特异基因引物上游引物：5CTTGGACTTTGAGTCAAATTGG 3下游引物：5CCTCCTTTGGTCTTACTGGG 32RT-PCR试剂盒 (Takara 公司),【操作步骤】,一、反转录反应1. 在EP 管中加入以下反应液,2. 按以下条件进行反转录反应,二、PCR反应,1. 取上液10 l 加入P 管中，再加入下列试剂，混匀后，放入PCR 扩增仪中进行扩增，然后用电泳鉴定PCR产物 (10 l)。,2. 按以下条件进行PCR反应,实验四 限制性酶切及电泳检测,一、限制性酶切【基本原理】 SNP的存在导致限制性酶切位点发生改变。 根据IGF2基因第9外显子具有限制性核酸内切酶ApaI位点多肽性的特点，RT-PCR产物行ApaI消化，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行印迹丢失检测。,【器材】 1恒温水浴箱；2EP 管；3手套【试剂】 1ApaI限制性内切酶；210L buffer； 3.纯水,【操作步骤】,RT-PCR产物酶切体系：,37水浴摇床过夜,1.限制性内切酶消化,2. 电泳检测 酶切产物10 ul与电泳上样缓冲液充分混合，在40mA电流 下，2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察杂合子情况。,一、琼脂糖凝胶电泳,【基本原理】琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定 DNA 片段的常用方法。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构象有关。对于线性 DNA 分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭 (EB)，其分子可插入 DNA的碱基之间，因此可在紫外灯下直接观察到 DNA 片段在凝胶上的位置，并可在紫外灯下或经凝胶成像系统观察或拍照。,线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系,【器材】1水平电泳槽；2电泳仪；3紫外透射仪或凝胶成像系统【试剂】11% 琼脂糖；2电泳缓冲液 (1TBE)；310 mg/ml 溴化乙锭 (EB)；4电泳样品上样缓冲液 (6)：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯腈，40%（W/V）蔗糖水溶液，在40C 保存。,1琼脂糖0.2 g ，加电泳缓冲液 (1TBE) 20 ml ，加热熔化。2胶液冷至50C 时，加EB 2l ，小心混匀，缓