造血干细胞与淋巴细胞

造血干细胞与淋巴细胞,什么是干细胞？,干细胞(stem cells)是一群尚未完全分化的细胞，同時具有分裂增殖成另一个与自身完全相同的细胞，以及分化成为多种特定功能的体细胞两种特性。干细胞在生命体由胚胎发育到成熟个体的过程中，扮演最关键性的角色，即使发育成熟之后，一般相信干细胞仍然普遍存在于生命体中，担负着个体的各个组织及器官的细胞更新及受伤修复等重大责任。,干细胞的分类,按分化潜能： 全能干细胞 多能干细胞 定向祖细胞按来源： 胚胎干细胞 成体干细胞,全能干细胞 (Totipotent) 受精卵就是最高层次的胚胎干细胞，是全能干细胞。受精后的最初几个小時內，受精卵会分裂为一些完全相同的全能细胞，每一个均有可能发育成胎儿。 多能干细胞 (pluripotent) 一种或几种组织的起源细胞，它能分化出多种类型的细胞，但它不可能分化出足以构成完整个体的所有细胞。譬如造血干细胞，它能分化成红细胞、白细胞和血小板等 十多种血细胞。,定向祖细胞(multipotent) 源于多能干细胞，具有向特定细胞系分化的能力，但其分化和自我更新能力受限，只能分化成一种或几种专门的细胞，譬如淋系祖细胞。 前体细胞(precursor) 指发育过程中较另一细胞更早期的细胞，有时泛指干细胞和祖细胞。,胚胎干细胞,ES细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。在未来几年，ES细胞移植和其它先进生物技术的联合应用很可能在移植医学领域引发革命性进步。目前是从废弃的胚胎组织中做细胞培养来得到ES细胞，但除有伦理争论，包括已死的胚胎的归属权问题，更有疾病传染等不可控因素。,成体干细胞,成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。,造血干细胞,造血干细胞（hemapoietic stem cell，HSC）是各种血细胞与免疫细胞的起源细胞，可以增殖分化成为各种淋巴细胞、浆细胞、红细胞、血小板、单核细胞及各种粒细胞等。HSC存在部位：胎肝、骨髓、外周血、脐带血、胎盘血。,HSC可以不断自我更新，其数量是稳定的；多向分化增殖能力；多数HSC处于静止状态；具有异质性，可以分为多能干细胞和定向祖细胞两个水平，后者源于前者；形态上类似于小淋巴细胞；具有一定的表面标志。,造血干细胞的生物学特性,HSC的动态平衡可能与HSC不对称分裂或细胞因子调节有关。正常造血干细胞每分裂一次，它的一个子代细胞分化为祖细胞(progenitors)，另一个细胞保持不分化，永不消灭，及所谓的非对称性分裂。此外，由于所处环境的不同，干细胞可进行有限的对称性分裂，即每分裂一次可产生两个干细胞/祖细胞。非对称分裂是以前大家公认的干细胞分裂模式，它能较合理地解释稳态造血。但是考虑到在胚胎期及骨髓移植后的确有造血干细胞的扩增，对称性分裂也可能存在。华中科技大学黄士昂教授于1995年至1998年在加州大学圣地亚哥分校肿瘤中心任副研究员时首次发现HSC的非对称分裂。,造血干细胞的起源,造血干细胞在人胚胎2周时可出现于卵黄囊，第4周开始转移至胚肝，妊娠5个月后，骨髓开始造血；出生后骨髓成为造血干细胞的主要来源，在髓外造血组织中所占比例甚少，如在小鼠骨髓中105有核细胞中的有10个，在脾中105有核细胞中只有1个，在外周血中105有核细胞中仅有0.2个。,出生前的造血部位,卵黄囊 骨髓 肝脏 脾 淋巴结 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 月,骨髓造血微环境,由微血管，神经、基质细胞(Stromal Cells)及细胞外基质共同构成的，对血细胞的增殖、分化、成熟有显著调节作用，是血细胞增殖分化的“土壤”，也是调控造血的中心环节。基质细胞：指骨髓中的网状细胞、内皮细胞、纤维母细胞、吞噬细胞和脂肪细胞。 细胞外基质：主要由纤维组织构成支架，其中有多种由基质细胞分泌和血液运输来的对血细胞生成有调控作用的物质，如细胞因子、Fe、硫酸软骨素、纤维连接蛋白、粘附分子。,人： CD34+CD33-CD38-CD45RA-c-kit-HLA-DR-Lin-Lin：CD3、CD4、CD14、CD16、CD19、CD41、CD56等；,HSC的表面标志,小鼠HSC的表面标志,HSC的分化,HSC分化过程,全能干细胞 多能干细胞 祖细胞 终末细胞 BFU-E CFU-E 红细胞 髓系 CFU-GM 单核/巨噬、中性粒 CFU-GEMM CFU-Eos 噬酸粒 CFU-Baso 噬碱粒 HSC CFU-Meg 巨核/血小板 CFU-TL TL 淋巴系 CFU-BL BL CFU-NK NK,造血细胞生长因子和白介素的调控,_ SC E Meg N Eo BA M BL TLIL-1 + (+) (+) (+) (+) - (+) + +IL-2 - - - - - - - + +IL-3 + + + + + + + - -IL-4 - (+) (+) (+) (+) + - + +IL-5 - - - - + - - + +-IL-6 全髓增殖因子IL-11 全髓增殖因子GM-CSF + + + + + - + - -G-CSF （+）（+） （+） + - - + - -M-CSF + + - -EPO - + - - - - - - -TPO 巨核系_,HSC移植(SCT),造血干细胞移植是指将别人或自己的HSC移植到经超剂量放、化疗的患者体内，替代原有的病理性或缺陷的HSC，以重建造血和免疫功能。,SCT的种类,异基因骨髓移植(Allo-BMT)自体骨髓移植(ABMT)外周造血干细胞移植(PBSCT)脐血干细胞移植(CBSCT),SCT适应症,恶性血液病：急性白血病、慢性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等。恶性非血液病：乳腺癌、肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、其他实体瘤等。非恶性疾病：再生障碍性贫血、珠蛋白合成障碍性贫血、夜间阵发性血红蛋白尿、骨髓纤维化、骨髓增殖性疾病、自身免疫性疾病、放射病等。 先天性免疫缺陷病、先天性造血异常症、先天性骨骼异常、粘多糖储积症、粘蛋白脂质代谢病、微粒体病等。,外周造血干细胞移植的优点,采集时不使用麻醉剂及骨穿；造血及免疫重建快 ；可提供较骨髓更多的干细胞；可以富集CD34+细胞提高干/祖细胞的浓度；能去除引起GVHD的T淋巴细胞；能去除肿瘤细胞。,SCT的先期条件,年龄45岁以下，根据患者具体情况，要衡利弊选择病人，包括禁忌症，移植效果和经济费用等情况；自体移植年龄可超过60岁。白血病病情处于CR期（无临床症状，体征、血液学检查正常），无中枢神经系统白血病迹象。与供髓者ABO血型相合或供者为O型、HLA相配、混合淋巴细胞培养刺激指数小于3，交叉淋巴细胞毒试验阴性。无影响移植的疾病（主要是心、肝、肺、肾）。移植前输血少，或输血较多，但时间已超过3个月者。,造血干细胞与基因治疗,为了带有目的基因的细胞在病人体内长期或永久地表达，必须选一种能在体内自我更新和自我维持的永不消亡的细胞作为宿主细胞。造血干细胞具有可以执行和自我更新能力，在体内常态造血过程中永不耗竭；同时它又可在分化过程中保持基因组DNA的相对稳定。因此，造血干细胞一直是基因治疗理想的靶细胞之一。,造血干细胞用于基因治疗的难点,干细胞数量不足。干细胞通过不对称性的有丝分裂，在不断产生祖细胞的同时，使自己不增殖也不分化。有国外学者报告认为正常造血干细胞是不能扩增的。许多人热衷于体外扩增干细胞，但至今未见有成功的报告。这是因为目前还缺乏一种模拟体内造血微环境的培养体系，希望正常干细胞在培养中既大量增殖，又不分化，这实际上意味着细胞的恶性生长。此外，迄今为止，造血干细胞还没有一个体外培养集落检测的方法。,基因转染率太低。基因治疗常用的逆转录病毒颗粒要进入靶细胞，首先必须是病毒颗粒的外壳糖蛋白gpTO和靶细胞表面受体专一性的结合。与小鼠不同，人的造血干细胞表面逆转录病毒受体(PIT-2受体)数量极少，限制了转染效率。此外，逆转录病毒只能感染分裂细胞，对处于静止状态的HSC效率很低。目前，慢病毒载体因其可以转导静止细胞的特性而在基因治疗中越来越受重视。,淋巴细胞,淋巴细胞：1012/个体，占外周血白细胞总数的2045，具有很强的异质性。根据免疫功能的不同，分为： 1、T细胞(T Lymphocyte, TL) 2、B细胞(B Lymphocyte, BL) 3、NK细胞(natural kill cells, NK),T淋巴细胞,介导细胞免疫应答，并在TDAg诱导的体液免疫应答中发挥重要的作用。TL的分化发育： 前TL 胸腺皮质 髓质 T淋巴细胞,T细胞的分化和发育,绝大多数胸腺细胞不能识别胸腺上皮细胞表面的自身MHC分子经阳性选择而在皮质内凋亡；通过阳性选择的胸腺细胞(能识别自身MHC分子，即获得了自身MHC限制性)向髓质迁移，那些与树突状细胞和巨噬细胞表面的自身MHC肽复合物呈高亲和力的会经阴性选择而凋亡，最终输出到外周的成熟T细胞也就具有了自身耐受性。,T细胞的表面标志,T细胞的膜表面标志主要有各种表面受体、表面抗原和黏附分子，是T细胞识别抗原、与其他免疫细胞相互作用以及接受信号刺激并产生应答的物质基础，也是鉴别和分离T细胞的重要依据。,T细胞表面受体,T细胞抗原受体(TCR)：T细胞特异性识别抗原的受体，也是所有T细胞特征性的表面标志。细胞因子受体(CKR)：可接受来自各种细胞因子的信号，调节T细胞的活化、增殖和分化。病毒受体：CD4是HIV病毒的受体 AIDS。有丝分裂原受体：临床上可用于检测机体细胞免疫功能的活性。,T细胞抗原受体(TCR),结构： TCR复合体TCRCD3分子功能： 是T细胞特异性识别抗原的受体。传递结合抗原的信息到细胞内，使T细胞活化。,TCR复合体,TCR识别APC递呈的MHC:抗原肽复合物，CD3不直接识别抗原，当TCR接受抗原刺激信号后，CD3分子的ITAM酪氨酸磷酸化，激活信号转导系统，启动T细胞的活化过程。,TCR必须同时识别相应的抗原肽和相应的MHC分子,T细胞表面抗原,MHC抗原白细胞分化抗原(CD分子) CD3 CD4/8 CD2 CD28/CD152,CD4和CD8分子,CD4分子：单链糖蛋白，分布于部分T细胞、胸腺细胞、某些B细胞、单核吞噬细胞和脑细胞。 功能：MHC-II类分子的配体 HIV受体CD8分子：异二聚体，分布于部分T细胞、胸腺细胞和NK细胞。 功能：MHC-I类分子的配体,CD2分子,CD2分子(淋巴细胞功能相关抗原-2，LFA-2；绵羊红细胞(SRBC)受体)： 表达于成熟T细胞、部分胸腺细胞和NK细胞。CD2的配基是CD58。CD2与CD58结合，可增强T细胞和APC细胞或靶细胞之间的粘附，促进TCR/CD3复合体聚合而活化T细胞，并完成CD2分子介导的信号转导。,CD28与CD80(B7-1)/CD86(B7-2),CD28是同源二聚体，在外周血淋巴细胞中，所有CD4+T细胞和50%CD8+T细胞表达CD28。活化T细胞表面CD28表达水平升高。CD28胞浆区与多种信号分子相连，转导T细胞活化的共刺激信号。CD28分子的配体是表达于B细胞等抗原递呈细胞表面的B7家族分子，包括CD80（B7-1）/CD86（B7-2）。CD28与CD80（B7-1）/CD86（B7-2）是一组最重要的共刺激分子，它们之间的结合提供T细胞活化必需的第二信号。,协同刺激,T细胞和APC的膜表面分子,CD152分子,CD152又称细胞毒T细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4, CTLA-4)，为同源二聚体，主要表达于活化T细胞，静止T细胞不表达。CD152与CD28高度同源，其配体都是B7-1和B7-2，但亲和力显著高于CD28。CD152与B7-1/B7-2结合将抑制活化T细胞的扩增，对T细胞介导的免疫应答起负调节作用。CD152属于抑制性受体。,CD28和CTLA-4,CD45,白细胞共同抗原，存在与所有白细胞表面。CD45RA表达在静止T细胞表面CD45RO表达在活化和记忆T细胞表面,T淋巴细胞亚群,根据CD抗原分亚群： CD4细胞亚群：T辅助细胞(Th)释 放细胞因子，促进 TL、BL分化、增 殖。CD2、CD3 CD8细胞亚群：细胞毒T细胞(Tc， CTL)释放穿孔 素和颗粒酶，杀伤 靶细胞。,T辅助细胞的功能,两种TH细胞亚群的主要特性, 主要特性 TH1（炎症性） TH2（辅助性）细胞因子产生种类 IL2 IFN TNF GM-CSF IL-3、4、5、6、10、13 免疫相关功能辅助全体抗体的产生 辅助IgE的产生 诱导嗜酸性粒细胞生长 诱导巨噬细胞活化 诱导迟发型性超敏反应 诱导Tc细胞活性 在抗感染免疫中的作用 胞内感染 胞外感染,NKT细胞,NKT细胞因其表面既有T细胞特有的TCR，又有NK细胞特有的抗原受体(鼠NK1.1/人CD161)而得名，经典NKT细胞主要分布于肝脏、骨髓和胸腺。NKT细胞具有独特的限制性表达TCR库，其TCR具有恒定表达的链和偏向表达的链。NKT细胞为固有免疫细胞，可通过其TCR识别树突状细胞、T、B淋巴细胞和巨噬细胞表面CD1d提呈的糖脂类抗原而被活化，也可通过其表面组成性表达的IL-12R和IL-2R与相应细胞因子结合而被活化。活化NKT细胞具有细胞毒作用，可通过分泌表达穿孔素和FasL等细胞毒性介质，使肿瘤和病毒感染的靶细胞溶解破坏或发生凋亡；也可通过分泌IL-4和IFN-等细胞因子，发挥免疫调节作用。,根据TCR分类：T细胞T细胞,两种TCR受体的T细胞比较,T细胞 T细胞TCR类型 TCR TCR异二聚体 链链 链链编码基因 V-J-C;V-D-J-C V-J-C;V-D-J-CV区基因数目 较少,位于皮肤或同一黏膜 50 57 组织中的T细胞群体 只表达一种相同的TCR体内分布： 主要在黏膜和上皮组织中 主要在外周血 外周血 515% 6070 % 肠道粘膜组织中 10% 少 皮肤下层 较多 少在胸腺内出现的时间 较早 较迟CD抗原 多数CD4、CD8 CD4、CD8 少数CD8 CD4、CD8 极少数CD4识别抗原受MHC限制 主要的免疫功能 参与非特异性免疫应答， 参与特异性免疫应答 在黏膜免疫、抗胞内感 染、抗肿瘤中发挥作用。,抑制性T细胞,Treg细胞双阴性T细胞：能够抑制具有相同TCR特异性的CD8+和CD4+ T细胞，从而抑制小鼠异体皮肤移植的排斥反应。CD4CTL,Treg细胞,Treg细胞在胸腺内发育成熟后输出到外周血，约占小鼠或人类外周血CD4 + T细胞数的5%10%，组成性表达CD25和CTLA-4。Treg细胞调节免疫反应的结果之一是抑制过强的免疫反应。肿瘤细胞可以通过促进Treg细胞的增加，抑制T细胞和NK细胞的抗肿瘤效应。,CD4CTL,CD4 CTL表达FasL，可以与激活的淋巴细胞(包括自己)和激活的APC表面的Fas(CD95)结合，引起活化的淋巴细胞和激活的APC细胞凋亡，防止免疫应答过度。其主要发挥旁观者效应杀伤靶细胞。,B淋巴细胞,是体内产生Ig的细胞，并具有抗原递呈功能。BL的分化发育： 前BL 幼BL 成熟BL 浆细胞,成熟B细胞,浆细胞,浆细胞超微图像,B细胞的膜表面标志,B细胞表面受体： BCRCD79a/b复合体 细胞因子受体 补体受体 Fc受体 丝裂原受体,BCRCD79a/b复合体,BCR的本质是膜表面的免疫球蛋白，主要是mIgM和mIgD，与血清Ig不同之处是具有跨膜区，是鉴别B细胞的主要特征。BCR复合体BCR Ig Ig (CD79a) (CD79b)BCR的胞内区较短，而Ig和Ig的胞内区较长，有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，其作用是激活酪氨酸激酶，传递B细胞活化信号。,B细胞抗原受体及BCR复合体,两种淋巴细胞的抗原受体识别抗原分子的区别,B细胞表面抗原,MHC分子：包括MHC和MHC类分子。其中MHC类分子参与抗原的递呈，还可增强B细胞以T细胞间的黏附作用。白细胞分化抗原(CD分子) CD19/CD21/CD81协同受体复合 体 CD40 B7,CD19/CD21/CD81,CD19是B细胞的表面标志，从B细胞分化早期直到浆细胞前期都存在，参与B细胞的活化。CD21是补体受体，仅存在于成熟B细胞和树突状细胞表面，B细胞活化后即消失。CD21能与结合在BCR的抗原表面的C3b结合，以增强BCR与抗原的结合，同时将结合的信号传导给CD19，为B细胞的活化提供辅助刺激信号。CD19/CD21/CD81组成协同受体复合体，功能上类似于T细胞的CD4/8，起辅助稳定第一信号的作用。,CD40：协同刺激受体，表达在B细胞、单核细胞和树突状细胞等，其配体是TL表面的CD40L(CD154)。为B细胞提供协同刺激信号使其进入充分活化状态。其作用与TL表面的CD28相同。B7(CD80/86)：表达在活化的B细胞、树突状细胞、单核巨噬细胞表面。是TL表面CD28分子的配体，具有协同刺激因子的作用。,B细胞被TD抗原特异激活的步骤,B细胞亚群,B1(T细胞非依赖性细胞) B2(T细胞依赖性细胞) (CD5细胞) (普通B细胞)发生部位 胚肝 骨髓外周分布 肠道相关淋巴组织 脾脏、淋巴结占外周血B细胞% 只占510% 90%表面分子 mIgM mIgD CD5 补充更新 自我更新 由骨髓更新产生抗体 IgM IgM、IgG针对抗原 TI抗原，自身抗原 TD抗原免疫记忆 抗原递呈 ,NK细胞,NK细胞(natural killer cells, NK cells)表面缺少T细胞和B细胞的特异性表面标志，能自发裂解多种肿瘤细胞和被病毒感染的细胞。是一群不需要抗原致敏，不需要抗体参与，就能杀伤靶细胞的淋巴细胞亚群，主要存在于外周血和脾脏中，在人外周血中占淋巴细胞的57%。,形态：大颗粒(溶酶体)淋巴细胞，颗粒内有穿孔素、颗粒酶(丝氨酸蛋白)表面分子： CD16又叫FcR，还见于巨噬细胞和粒细胞，介 导ADCC作用； CD56 CKR KAR/KIR功能：参与机体的抗病毒和抗肿瘤免疫。,NKR-P1,NKR-P1是人类NK细胞表面的KAR，属于C型凝集素家族成员，为型跨膜糖蛋白。其胞膜外C型凝集素区域含有糖类蛋白识别受体，它们与巨噬细胞表面糖类识别受体类似，能广泛识别并结合分布于自身组织细胞、病毒感染细胞和某些肿瘤细胞表面的糖类配体。NKR-P1分子胞浆区含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosi