红细胞血型血清学技术的发展和应用

2017/12/12,1,红细胞血型血清学 实验技术的发展和应用,2017/12/12,2,二十一世纪临床输血工作,安 全,高 效,准 确,可 靠,2017/12/12,3,输血安全和输血相容性实验,红细胞血型相容性实验规范化 输血传播病原微生物检测 输血相容性实验 血型定型：抗原、基因水平 抗体检测：筛检、鉴定、确证 交叉配血：完全和不完全抗体,相容（Compatible）即和谐共存（existing in harmony）,2017/12/12,4,血型血清学免疫基础概述,抗 原： （1）免疫原性 （2）反应原性/抗原性根据抗原来源与机体的亲缘关系分类： 异种抗原 同种异型抗原：ABO、Rh、HLA等 自身抗原 异嗜性抗原,2017/12/12,5,血型血清学免疫基础概述,抗体:抗体都是免疫球蛋白并非所有免疫球蛋白都具有抗体活性Ab是功能描述，Ig是化学结构描述分泌型Ig(sIg)和膜型Ig(mIg)Ig不耐热，在60-70被破坏Ig能被多种蛋白酶水解,2017/12/12,6,血型血清学免疫基础概述,类：根据CH抗原特异性的差异，将Ig分为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE 五类亚类：根据CH(主要是铰链区)AA和二硫键的差异 IgG: IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 IgA: IgA1、IgA2 IgM: IgM1和IgM2型：根据CL化学结构与抗原性的差异 和型亚型：1、2、3、4,2017/12/12,7,血型血清学免疫基础概述,补 体：主要由肝细胞、巨噬细胞等合成，半衰期约1天多为糖蛋白，占血清蛋白总量的10%左右血清中各成分含量不等，C3含量最高正常生理情况下，以非活化形式存在于血清中性质不稳定，加热56 30min失活对温度、酸、碱、蛋白酶、乙醇等敏感,2017/12/12,8,血型血清学免疫基础概述,补体系统的三条激活途径经典途径（classical pathway）旁路途径（alternative pathway） MBL途径（MBL pathway） ( MBL：甘露糖结合凝集素) 补体系统的激活是在某些激活物质的作用下，各补体成分按一定顺序，以连锁的酶促反应方式依次活化，并表现出各种生物学活性的过程，故亦称为补体级联反应,2017/12/12,9,The complement system explained,2017/12/12,10,血型血清学免疫基础概述,抗原抗体反应是抗原和相应抗体之间的特异性结合反应既可发生在体内，也可发生在体外一般规律： 特异性 可逆性 阶段性 比例性,2017/12/12,11,血型血清学免疫基础概述,特异性：由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定可逆性（reversibility)：指Ag与相应Ab结合成IC后，在一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性IC解离取决于： 抗体对相应抗原的亲和力 环境因素,2017/12/12,12,血型血清学免疫基础概述,环境因素：pH值、离子强度、温度等常用于解离IC的物质有：3M硫氰化钾、pH2.4 0.1M甘氨酸、7M尿素等解离后抗原、抗体仍保持原有特性,2017/12/12,13,血型血清学免疫基础概述,阶段性第一阶段：特异性结合阶段 反应速度快，几秒钟或几分钟即可完成 不出现肉眼可见反应第二阶段：可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合等反应 反应进行慢，需要几分钟、几十分钟或更长 受电解质、温度、酸碱度等多种因素影响,2017/12/12,14,血型血清学免疫基础概述,比例性（proportionality） ：最适比或等价点：指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见反应等价带：抗原与抗体分子比例合适的范围带现象：Ag与Ab比例不适而不出现可见反应 前带(prozone) ：抗体过量时 后带(postzone) ：抗原过量时,2017/12/12,15,血型血清学免疫基础概述,抗原抗体结合力：抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合不形成牢固的共价键，通过非共价键结合涉及几种分子间的作用力： 静电引力 范德华力 氢键结合力 疏水作用力,2017/12/12,16,血型血清学免疫基础概述,影响抗原抗体反应的因素：一、反应物自身因素：抗原：理化特性、Ag决定簇数量、Ag决定簇种类抗体：来源、特异性与亲和力、浓度二、环境条件：电解质：0.85%NaCl酸碱度：pH 69温度：15 40,2017/12/12,17,血型血清学免疫基础概述,检测抗原抗体反应的基本技术：凝集反应（又称直接凝集反应） 颗粒性Ag + 相应Ab颗粒性团块样凝集沉淀反应 可溶性Ag + 相应Ab免疫复合物出现沉淀溶血反应 RBC血型Ag 相应血型Ab溶血（红细胞破坏）,补体,2017/12/12,18,红细胞血型血清学概要,(一)血型定义 血型是血液系统的一种遗传多态性，是产生抗原抗体的遗传性状。(二)血型抗原 红细胞上的化学构型，必须是用相应抗体检测到的红细胞表面抗原。当给缺乏某种抗原的个体输入此种抗原时，可以刺激产生相应的抗体。,2017/12/12,19,红细胞血型血清学概要,人类红细胞血型抗原 309个 30个血型系统 ，270个抗原;个血型系列，系列（低频率） 18个抗原； 系列（高频率） 9个抗原； 未归类，2个抗原。,2017/12/12,20,红细胞血型血清学概要,血型抗原是红细胞上的化学构型。按照生化性质人红细胞抗原决定簇可分为糖分子和多肽2类。 决定簇是糖分子的血型抗原：ABO, Hh, Lewis, P, Ii, 也称为组织型抗原，因为它们不仅存在于红细胞表面，而且广泛存在于大部分上皮细胞、各种体液、分泌液中。组织型抗原决定簇可以是细胞分化和成熟的标志。 决定簇为多肽的血型抗原：MNS, Rh, Kell, Kidd 等，其抗原化学组成为蛋白质、糖蛋白、脂蛋白，只分布于红细胞膜或其它骨髓造血干细胞。,2017/12/12,21,红细胞血型血清学概要,有临床意义的抗原：ABO、Rh、Diego 、Duffy、Kell 、Hh、Kidd、P、和Ss等一定条件下具临床意义的抗原：Colton、Cromer、 Dombrock 、Gerbich 、Indian、Wiener 、和Yt等无临床意义的抗原（37 无反应） : Lutheran、MN、P1等 目前尚未发现有临床意义的抗原: Chido/ Rodgers、JMH、Knops、Xg 等。,2017/12/12,22,Blood groups structures,L-岩藻糖,D-半乳糖,N-乙酰葡萄糖胺,N-乙酰半乳糖胺,前体物质,H物质,ABO基因位于染色体9q34.1-34.2;基因产物是糖基转移酶,ABO抗原的化学结构是糖蛋白,O基因为无效基因，A基因 N-乙酰-D-半乳糖转移酶，B基因 D-半乳糖转移酶,H基因 L-岩藻糖基转移酶,2017/12/12,23,抗 原,2017/12/12,24,Differences between normal D, D-weak and partial-D phenotypes,2017/12/12,25,红细胞血型血清学概要,（三）、血型血清学抗体的定义辨析及其意义血型抗体一般为IgM、IgG或IgA, IgA不多见血型抗体免疫球蛋白的特点,2017/12/12,26,红细胞血型血清学概要,天然抗体（natural antibody）：也是机体对抗原免疫应答的产物，只是没有可觉察的抗原刺激，并非天然产生的抗体。主要存在于ABO, MN, P, Lewis。产生机制可能与环境中广泛存在的菌类、花粉、尘埃等有关，这些物质与某些抗原有共同成分，通过隐性刺激产生血型抗体。免疫抗体：有可查知的抗原刺激而产生，抗原一般通过输血、妊娠、注射3种方式引入。血型不相容的输血是很强的免疫刺激，输入受血者没有的血型抗原，可能产生相应抗体。,2017/12/12,27,红细胞血型血清学概要,规则抗体：ABO系统产生抗A、抗B是有规律的，即A型人产生抗B，B型人产生抗A，O型人产生抗A和抗B，这是符合Landsteiner规则的，称为规则抗体（regular antibody）。不规则抗体(irregular antibody)：除ABO系统外，其它系统产生的抗体均无此规律，称为不规则抗体或意外抗体，不规则抗体通称意外抗体(unexpected antibody)。,2017/12/12,28,红细胞血型血清学概要,完全抗体(complete antibody)：在盐水介质中能凝集红细胞，又称盐水抗体，多为IgM抗体。不完全抗体(incomplete antibody)：能使红细胞致敏，但在盐水中不能凝集红细胞的抗体，多为IgG，通过抗人球蛋白法或其它非盐水介质法检测。,2017/12/12,29,红细胞血型血清学概要,血型抗体的临床意义 能够引起红细胞存活期缩短、新生儿溶血病、溶血反应的抗体具有临床意义。并非所有血型抗体都有临床意义。 一般来说，在37不与红细胞发生反应的抗体无临床意义。 对于有临床意义的抗体，输血时应选择相应抗原阴性、交叉配血相合的红细胞。 对于无临床意义的抗体，输血时选择交叉配血相合的红细胞即可。,2017/12/12,30,红细胞血型血清学概要,临床输血重要的人血清红细胞抗体,2017/12/12,31,红细胞血型血清学概要,临床输血重要的人血清红细胞抗体,2017/12/12,32,红细胞血型血清学概要,红细胞破坏的免疫学机制血管内：通过补体系统活化形成膜攻击复合物而引起红细胞破坏。血管外：吞噬细胞表面有抗体或补体的结合位点，通过其调节作用，单核巨噬细胞系统吞噬红细胞。,2017/12/12,33,红细胞血型血清学实验技术的发展,1900：Landsteiner发现A、B、O血型1939：Levine和Stetson发现了Rh血型系统1945：Coombs等建立了抗球蛋白试验1947：Morton和Pickles建立了酶法试验1974：Low和Messeter使用低离子盐水液增强抗原抗体的相互作用,2017/12/12,34,红细胞血型血清学实验技术的发展,1980：Lalezari等建立了 Polybrene试验1984：Plapp等建立了固相试验1987：Nance和Garratty建立了 PEG方法1990：Lapierre等发明了微柱凝胶凝集试验,2017/12/12,35,红细胞血型血清学实验技术的临床应用,ABO、RhD血型鉴定血型抗体筛检、鉴定、确证交叉配血新生儿溶血病诊断血型抗体效价测定,2017/12/12,36,红细胞血型血清学实验技术的临床应用,2017/12/12,37,常用红细胞血型血清学实验技术,一盐水介质凝集试验应用范围：主要用于IgM抗体的检出、 鉴定、配血；本法最为简便、快速、价廉，但有局限性：只能检出ABO、P、Lewis等系统的抗体；不能检出Rh、Kidd、Duffy等系统的抗体。,2017/12/12,38,常用红细胞血型血清学实验技术,二、酶处理细胞的凝集试验 主要用于抗体筛查和交叉配血常用的酶：菠萝酶、木瓜酶、无花果酶等优点：可以增强一些抗原抗体系统的反应活性，对Rh和Kidd系统最明显缺点：会破坏一些抗原的结构(M、N、Fya、Fyb)；酶液批次不同，有活性差异，每批次都需标化最适孵育时间。,2017/12/12,39,常用红细胞血型血清学实验技术,三、聚凝胺试验主要用于抗体筛查和交叉配血优点：简便快捷，对Rh系统敏感度高缺点：可增强自身抗体或冷凝集素干扰，对Kell系统不敏感。注意事项：抗原抗体比例适当；聚凝胺要去除干净；排除肝素等的干扰。,2017/12/12,40,常用红细胞血型血清学实验技术,四、抗球蛋白试验（Coombs Test）主要用于抗体筛查、交叉配血、新生儿溶血病、自身免疫性疾病（贫血等）检测。抗球蛋白试剂：多特异性抗球蛋白含有抗IgG、抗C3d、抗C3b、抗C4b、抗IgM、抗IgA；单特异性抗球蛋白主要有抗IgG和抗C3d两种，主要应用于抗体阳性者分类鉴定。,2017/12/12,41,常用红细胞血型血清学实验技术,抗球蛋白试验特点： （1）是血清血型学试验中经典试验，用于各种血型抗原抗体鉴定。（2）试验同时需做阳性、阴性及自身对照试验，“结果”方才可靠。（3）检测IgG抗体最为可靠。（4）操作烦琐，影响试验结果的因素众多。,2017/12/12,42,常用红细胞血型血清学实验技术,五、微柱凝胶试验基本可以替代传统的红细胞血清学实验方法灵敏度高、特异性强、结果直观并可永久保存,血型鉴定抗体筛检和鉴定交叉配血抗体效价新生儿溶血病抗人球蛋白实验,2017/12/12,43,红细胞血型血清学实验技术原理,红细胞抗原和相应抗体的凝集反应IgM抗体凝集红细胞IgG抗体凝集红细胞（有活性的补体参与则为溶血）,2017/12/12,44,AgglutinationClumping or agglutination of erythrocytes,Because the corresponding antibodies are lacking, there is due to antibodies no agglutination and the cells remain in suspension,以红细胞凝集或溶血为反应终点和判断标准,2017/12/12,45,玻片法,2017/12/12,46,试管法,2017/12/12,47,2017/12/12,48,弱凝集反应结果通常不易判断。非固定性结果 - 不便移交上级主管人员审核。,2017/12/12,49,微孔板法凝集,2017/12/12,50,Solid phase technique,Compare between agglutination and solid phase,2017/12/12,51,Solid phase technique,2017/12/12,52,Reaction environment NaCl,2017/12/12,53,Complete antibodies,Red cells in PBS with water jacket,Complete antibodies (IgM, pentamer),Agglutination,2017/12/12,54,IgM抗体凝集红细胞示意图,IgM在盐水介质中产生凝集,2017/12/12,55,Incomplete antibodies,Incomplete antibodies (IgG monomer),“Sensitized” red cells,Red cells in PBS with water jacket,2017/12/12,56,IgG抗体与红细胞抗原反应示意图,IgG在盐水介质中不产生凝集,2017/12/12,57,缩短间距， IgG使红细胞凝集,酶处理、凝聚胺,2017/12/12,58,POLYBRENE凝集细胞示意图,+ + +聚凝胺,+,无凝集,+,有凝集反应,- - - - - 枸橼酸纳- - - - -,2017/12/12,59,增强技术,白蛋白增强凝集法白蛋白能提高红细胞悬浮液中的介电常数，从而降低zete电位，缩小了细胞间距离，增加细胞与细胞的接触面。低离子强度盐溶液（Liss）法 在凝集反应第一阶段，若降低介质的离子强度，就会减少红细胞周围的阳离子云，促进带正电荷的IgG与带负电荷的红细胞发生反应。,2017/12/12,60,抗球蛋白试验,2017/12/12,61,Antiglobuline Test,Agglutination by adding antiglobuline serum,Incomplete antibodies (IgG monomer),“