HPV病毒的分子生物学探究

HPV病毒的分子生物学探究,杨永强,目录,一、高、中、低危型HPV二、HPV检测在临床各阶段中的意义三、HPV的检测,什么是HPV?,HPV的分型,高、中、低危型HPV,目前研究中，与人类癌症存在相关性的病毒包括：,目前真正通过体外病理模型确认的只有HPV16，可导致宫颈癌。并且在HPV这一病毒种属中真正致癌的具体病毒型别仍尚待研究，已确认的致癌型别有，HPV16,18,31,45. （其中HPV16经体外病理模型证实，HPV18，45，31经流行病学证实。）,EBVNasopharyngeal carcinomas 鼻咽癌HBVLiver cancer 肝癌Human herpesvirus type 8Kaposis sarcoma 考伯希肉瘤Human T-lymphotropic retrovirus（HTLV-1) adult T-cell leukemia（ATL) 成人T细胞白血病HPV(16,18,45,31, )cervical cancer 宫颈癌,高、中、低危型HPV,？,HPV的分型,高危型HPV中危型HPV 低危型HPV 高、中、低危型不是依据其致癌性划分，而是依据其致癌的可能性划分的。 所以说，高危型不代表是致癌型，只是表示其致癌的危险性高。,高、中、低危型HPV,人们最早发现的HPV型别是HPV6（Gissmann and zur Hausen，1980）和HPV11 (Gissmann et al.,1982) ，但它们并不能导致宫颈癌。 在研究HPV6和HPV11的致癌性过程中，才发现了真正的宫颈癌元凶HPV16 (Drst et al.,1983)、HPV18 (Boshart et al.,1984) 。,高、中、低危型HPV,HPV的致癌性研究的历史回顾,摘自Infections Causing Human CancerHarald zur Hausen,HPV的致癌性研究,致癌因子可能包含所有的高危型HPV，但并不是所有的高危型HPV都已被确认为有必然的致癌性。 目前确认的是HPV16、18、31、45。,高、中、低危型HPV,高危型HPV病毒致病机理 L1、L2 、E6、E7基因的功能,L1基因：HPV病毒晚期基因，编码的蛋白为病毒颗粒的主要衣壳蛋白，为型特异性蛋白L2基因：HPV病毒晚期基因，编码的蛋白为病毒颗粒的次要衣壳蛋白，为组特异性蛋白E6基因：高危型HPV病毒早期基因 1、E6蛋白结合p53 （一种肿瘤抑制基因）编码的蛋白，并使其降解，从而抑制了p53 的作用 2、抑制p21（一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂）起作用，从而失去对细胞生长周期的正常调控，引起细胞无限增殖并向恶性转化E7基因： 高危型HPV病毒早期基因，编码的蛋白与Rb（一种肿瘤抑制基因）蛋白作用，使之失活，导致细胞周期调节紊乱,高、中、低危型HPV,返回,HPV检测在临床各阶段中的意义,检测对象：宫颈分泌物中的脱落细胞,HPV检测在临床各阶段中的意义,分泌物的检测规范化的指标 内标,HPV检测采用的是分泌物标本，根据医生取样时用力的轻重等，每次取到的宫颈上皮细胞数量会存在差异，甚至有可能没有取到宫颈脱落细胞。为了避免因取样不当而导致的假阴性结果。就必须有一个指标确认是否已经取到了宫颈脱落细胞并且能够测定取样量的多少。,分泌物检测的规范化 内标的意义,现在已经世界卫生组织采用和确认的标准为-globin gene（-球蛋白基因）-球蛋白基因（-globin gene）是一种存在于上皮细胞中的管家基因，可作为宫颈上皮细胞的身份证，它的存在标志着临床所取标本中一定含有宫颈上皮细胞，从而规范地避免了因临床取样未获得足够的（针对分子生物学实验）宫颈上皮细胞而导致实验结果的假阴性问题。,HPV检测在临床各阶段中的意义,HPV检测在临床各阶段中的意义,分型的同时定量,HPV的检测,例：甲乙两患者均感染HPV16型，甲患者相对定量值2105拷贝数，乙患者为2103拷贝 数。如果仅通过相对定量值，该结果提示甲高度HPV16型感染，患宫颈癌的风险属高度。乙轻微HPV16型感染。,而但由于取样等因素导致取到可检测的宫颈脱落细胞不同，相应的病毒载量完全无可比性。而当我们引入内标后，通过相对定量值和内标值之间的换算，可得到该患者病毒载量的绝对定量值，甲为2103拷贝数，乙为2106拷贝数。,分型的同时定量,HPV的检测,此时我们可得到准确的结果提示：乙患者感染HPV16型病毒载量远远高于甲，且乙患宫颈癌的风险属高度。,分型的同时定量,HPV的检测,分型的同时定量,HPV的检测,返回,双色荧光，一管检测多个型别每个标本用3次实时平行扩增反应，通过两种荧光基团对八种高危型HPV进行检测。基因分型:主要高危型: HPV16,18, 45, 31. (建议对阳性患者进行下一步的检查,如: TCT,阴道镜,或病理活检)次要高危型: HPV33,52,58，67. (建议关注阳性患者的病毒量),该试剂HPV的八种分型的重要性在2005年科学(Science, Vol. 308 (April 2005)及新英格兰医学杂志(NEJM 2005)上有专文论证,HPV的检测,一种即高效又实用的临床检测方法,不仅分型，而且定量,一种即高效又实用的临床检测方法,1. 实时定量 检测范围: 病毒拷贝量10E+2和以上(10E+2-10E+8)2. 相对定量，只反映了当次标本所含病毒载量的情况, 因取样因素导致病毒载量无对比性； 绝对定量，引入内标，进行绝对定量，就可比较不同 标本或同一标本不同时间的病毒载量，起 到疗效监控的作用。有研究证明，肿瘤细胞中的病毒量很少，由此可推断，即使绝对定量值小于1，也是有意义的。,HPV的检测,HPV的检测,一种即高效又实用的临床检测方法,一种即高效又实用的临床检测方法,结果提示：1、宫颈上皮细胞参考量为0拷贝（内标没有起跳），提示为该标本内无宫颈上皮细胞，即该标本取样不合格。若HPV检测的相对定量值1.0E+2，提示可能为阴道HPV感染。2、绝对定量值1.0E+5时，提示为高度感染该型别高危型HPV，病毒量极大，提示患宫颈癌的风险属高度；3、绝对定量值0拷贝（内标起跳），相对定量值1E+2时，提示为未感染高危型HPV16/18/31/33/45/52/58/67，高危HPV感染检验阴性；本例结论：该患者（标本编号为33）H