血流感染标本和呼吸道标本操作规范及临床意义

,血流感染标本和呼吸道标本操作规范及临床意义,广东省中医院大学城医院检验科 张伟铮,标本类型,血培养 呼吸道标本 (痰标本、咽部标本）尿培养脑脊液培养生殖道标本培养抽吸物和组织标本的培养（需氧、厌氧培养）伤口拭子粪便培养,血培养Blood Culture,血培养是进行血流感染诊断的最佳手段,血培养概念,采集患者的血液或无菌体液标本,送至微生物实验室培养检测.检测原本无菌的血液及体液中是否有细菌存在.如有细菌,则极有可能为致病的细菌.进一步进行鉴定/药敏试验.,完整的血培养过程,医师开出医嘱护理人员收集送检样本实验室检测、分离并鉴定导致血流感染的微生物三级报告：为临床医生提供抗菌药物敏感性试验结果,目前血培养的问题,采血时机不合适采血套数不够采血量不足只做需氧培养，不同时做厌氧培养采血前或采血时正在使用抗生素治疗,血流感染与血培养的规范实践,关于血培养指征,“只有在发热时，才需要进行血培养。”,想采就采,？,血培养的指征,当怀疑血流感染或脓毒症时，应常规行血培养。怀疑患者有血流感染的症状有：不明原因的发烧(38)或体温过低(36)白细胞增多（ 10,000/ul），粒细胞减少（ 1,000/ul）休克，寒颤，僵直严重的局部感染(脑膜炎，心内膜炎，肺炎，肾盂肾炎，腹部术后感染，)心率异常加快低血压或高血压呼吸频率加快,关于采血时机,“何时采血进行血培养，无特殊时间要求。”,？,关于采血套数及部位,“为减轻患者痛苦，只从一个穿刺部位采一份血液标本即可。”,？,血培养采血时机,细菌浓度,体温,0,30,60,时间 (分钟),基本概念,成人“一套” 血培养应该包括需氧瓶和厌氧瓶各一个，也叫“一份”注意：一次穿刺采血，算“一套”，采集第二套应从另一个穿刺点获得。儿童一般只做需氧培养，但仍需从多个部位采集多次。特殊患者才考虑厌氧培养。,采血套数,Weinstein et al. Detection of Bloodstream Infections in Adults: How Many BloodCultures Are Needed J Clin Microbiol. 2007; 45:3546-3548,表皮葡萄球菌的临床意义,污染菌,？,致病菌,采集1套无法判断是病原菌还是污染菌。,23套血培养，有助于污染的判断。,关于血培养套数与采血部位,每位患者每次采血最少2套，3套更好初发患者，绝不能只采1套标本多个穿刺部位采血。因多部位同时发生污染的几率较小，便于对结果进判断, 关于采血间隔,“两套血培养采集间隔无特殊要求。”,？,关于标本采集间隔时间,对于非持续性菌血症，同时或短时间内采集2-3套血培养，因为体内巨噬细胞吞噬系统会在1530min内清除掉进入人体内的细菌。可疑急性心内膜炎患者要立即取血作血培养，30分钟内完成3套血培养的采集，采集后立即进行抗菌药的经验治疗。如果24小时内报告阴性，则继续采集2套血培养。可疑的亚急性心内膜炎患者每间隔30分钟至1h采集1套，连续采集3套标本。如果24小时内报告阴性，则继续采集2套血培养。, 关于采血量,“每瓶采集多少血液无特殊要求。”,？,采血量(ml)与检出率的关系,血培养物每增加一毫升，真性菌血症成年人微生物的检出率增加3,但并非越多越好，超过一定数量的采血量会稀释培养瓶内的肉汤，使肉汤无法有效中和血中的抑制物质（补体、抗体、抗生素）。所以血液与肉汤的最佳比例为1：41：10,关于采集血液量,采血量是影响灵敏度最关键因素成人一份标本2个培养瓶（需氧厌氧），每瓶810ml，共20ml；要求至少采两份标本，即40ml。儿童一般只需采集需氧瓶，在保证采集血量1总血量下，一般为1-3ml采血量不足时应优先保证需氧瓶，因临床90以上的感染为需氧菌或兼性需氧菌感染,关于各种血液标本的采集顺序,先采生化、凝血标本，再采血培养标本。”,？,采各种血液标本的先后顺序,血培养对无菌操作的要求比注射、采集生化、凝血等其它标本要高。所以要最先采集血培养标本。污染率的指标是 3%（100份标本里只能有不到3个标本出现污染）。,关于皮肤及培养瓶消毒,“消毒的重点是足够量的消毒剂。”,？,皮肤消毒程序：,推荐使用碘町、洗必泰或碘伏作为皮肤消毒剂。碘町作用1min碘伏作用1.5-2min洗必泰作用时间与碘町一样（但不能用于少于2个月婴儿皮肤消毒）,培养瓶的消毒程序：,去掉培养瓶口的塑料瓶盖。75%酒精消毒血培养瓶橡皮塞子60秒。自然待干。将标本注入培养瓶内。5.颠倒混匀标本与肉汤，以避免血液凝集。,关于培养瓶的储存温度,“培养瓶未使用时，需要冷藏或冷冻。”,？,关于未用培养瓶的储存温度,不需冷藏，更不能冷冻。保存在1525的室温即可，温度过低会导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡。,关于夜班血培养的送检,“加入标本后的培养瓶夜班未能及时送到检验科，可以冷藏或放入35的温箱。”,？,关于夜班血培养的送检,培养瓶夜班未能及时送到检验科，存在室温即可，不能冷藏也不能放入35 的温箱 。过夜不会对检测造成影响，但仍需尽快送检。冷藏可能导致对温度敏感的耐瑟氏菌等死亡。温箱会导致细菌进入生长对数期，从而错过检测的最佳时期。,关于采血部位,“患者静脉中插有导管，可直接从导管采血。”,？,关于从静脉留置装置直接采血,不可以，常规血培养不宜从静脉导管或静脉留置装置中采集，检出污染或定植菌的可能性较大。除非怀疑导管相关性血流感染，请参照导管相关性血流感染的采血方法。,血培养标本的拒收,瓶子上帖的标签错误或未帖标签。血培养瓶打破的、损坏的或渗漏。血液凝固。,培养基的选择,推荐使用商品化的培养基使用添加抗菌药物吸附剂的血培养瓶有助于提高已接受抗菌药物治疗患者血培养的检出率，增加细菌的分离率和分离速度，但同时也会增加污染菌的检出率。,血培养报阳时间,当前推荐的连续血培养检测系统的标准培养时间为5天大部分临床意义的致病菌都在培养的前3天检出在培养的前2天,检出率为94%,Bourbeau PP., Foltzer M. Routine incubation of BacT/ALERT FA and FN blood culture bottles for more than 3 days may not be necessary. J Clin Microbiol. 2005;43:2506-2509,血培养的危急报告制度,1.初步报告 血培养阳性报警后，应立即抽取培养液进行涂片、革兰染色、显微镜镜检，初步药敏试验，并将结果向临床主管医生进行紧急报告。2.二级报告 阳性报警的血培养转种培养基培养1618小时后，观察培养基上菌落形态、革兰染色后菌体形态以及初步药敏结果，尽可能通知临床初步鉴定结果和某些耐药特征。3. 最终（书面）报告 报告最终菌种鉴定及药敏试验结果,菌种鉴定对判断血培养污染的价值,当分离出的微生物为金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌以及其他肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、白色假丝酵母菌时，90%以上是血流感染病原菌。分离出化脓性链球菌、无乳链球菌、产单核李斯特菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、其它假丝酵母菌和新型隐球菌时污染的可能性更低。棒状杆菌、微球菌、气球菌、芽胞杆菌、丙酸杆菌、草绿色链球菌和凝固酶阴性葡萄球菌等很少是菌血症的病原菌，如重复检出才考虑为病原菌。,台大医院BACTEC 9240 18台,les)/episode2-3 sets (4-6 bottles)/episode9,000-10,000 bottles/month100,000 bottles/year,台湾长庚医院BACTEC 9240 23台,呼吸道标本Respiratory Cultures,上呼吸道标本 Upper Respiratory Tract Specimens,上呼吸道感染：,绝大部分呼吸道感染局限于口咽、鼻咽和鼻腔部位；导致咽痛、鼻涕、常常会发热。感染喉部、中耳、鼻窦炎、结膜炎或角膜炎。可能与严重疾病百日咳、流行性感冒、麻疹和传染性单核细胞增多症并存。,下呼吸道标本 Lower Respiratory Tract Specimens,下呼吸道感染, 急性支气管炎 社区获得性肺炎 院内获得性肺炎 免疫妥协患者肺炎,下呼吸道标本,自然咳痰,诱导痰,气管内吸取物,支气管肺泡灌洗液,保护性毛刷,支气管灌洗液,肺部组织,病原体种类繁多而复杂,使下呼吸道感染病原诊断成为难题,细菌（包括放线菌与奴卡菌，厌氧菌与分枝杆菌）真菌（包括肺孢子菌）病毒支原体、衣原体与立克次体原虫寄生虫,咳痰途经口咽部,不可避免地受到污染,唾液中口咽部定植菌的浓度可达108-109/ml。研究显示，国内常规痰标本中约半数存在唾液严重污染现象。,我国痰细菌培养现状,标本送检率低苛养菌检出率极低结果重复性差报告速度慢感染菌与污染菌不易区分药敏结果与治疗反应存在差距,咳痰标本的采集,标本采集方法医师或护士直视下采集标本病人先漱口，去除表面的菌群教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液临床上约半数咳痰标本不合格！,痰标本的正确采集,人工气道：气管内吸引，可避免口腔正常菌群的污染。敏感性（38%-100%）特异性（14%-100%）。 PSB(聚苯乙烯-丁二烯共聚物):保护性毛刷采样获取下呼吸道分泌物进行培养。敏感性（33%-100%）特异性（50%-100%）。 BALF(支气管肺泡灌洗液 ):支气管肺泡灌洗液获取下呼吸道分泌物进行培养敏感性（42%-93%）特异性（45%-100%） 。,标本质控,判断是否合格标本：白细胞：鳞状上皮细胞2.5：1痰涂片：平时处理痰标本就必须涂片，这是基本工作之一，不会因为院感和临床医生的要求而增加，也不会因为他们不要求，或者人手不足就不做。就如同建房子之前要挖地基一样，不会因为客户不要求就省掉这个步骤痰培养：取脓性痰、粘液脓性痰,标本质量,带血痰,唾液or诱导痰 (?),脓痰,粘液样痰,细胞学筛选标本,合格标本 下呼吸道咳出的痰，含鳞状上皮细胞少，白细胞较多。白细胞：鳞状上皮细胞2.5：1。,不合格标本指唾液或唾液严重污染的痰标本，含鳞状上皮细胞多，而白细胞少。白细胞：鳞状上皮细胞2.5:1。,细胞内细菌,胞内细菌 提示感染,柱状纤毛上皮细胞,肺泡巨噬细胞,滑石颗粒,淀粉样小体,见于迁延长时间的呼吸道疾病,弹性纤维,库什曼螺旋体,呈链排列的革兰阳性球菌和革兰阴性球杆菌。缺乏鳞状上皮细胞提示混合厌氧菌感染,你看见多少种形态？,几种细菌的混合形态，缺乏鳞状上皮细胞=混合厌氧菌感染。如果是呼吸道标本可能是吸入性肺炎。报告临床医生“提示吸入性肺炎”,呼吸道标本中未被染色的，有折射的杆菌=抗酸杆菌,呈链排列的革兰阳性球菌？或革兰阳性分枝杆菌？,肺中的结节吸出物，不规则“球菌”，分叉，无短链，链的末端的呈尖状，都证明是分枝状的革兰阳性杆菌，可能是放线菌或诺卡菌（通常来自脑或肺组织的标本）,呼吸道标本的涂片评估模式,痰标本的培养,前处理：用无菌盐水将痰洗涤3次，除去痰液表面的常居菌，加入等量的1%胰酶溶液（PH7.6），3530min，使痰液均值化后备用。分离培养：处理后的痰液分区划线接种于血琼脂平板、嗜血巧克力平板和麦康凯（或EMB、中国蓝）琼脂平板，置5%-10%CO2环境中，35培养18-24h，根据菌落及形态（革兰染色）特点，作出初步判断。,常用培养基作用及成分,血平板：判读细菌在体内的基本生长情况，分离培养苛氧和非苛氧菌。基础成分：特殊蛋白胨、淀粉、氯化钠、琼脂粉、蒸馏水。特殊成分：脱纤维绵羊血，鉴别溶血反应和提供X因子（血红素）。嗜血巧克力平板：分离培养苛氧菌，尤其适用与嗜血杆菌。基础成分：特殊蛋白胨、淀粉、氯化钠、琼脂粉、蒸馏水。特殊成分：血红蛋白粉和NAD分别含X因子和V因子，嗜血杆菌生长所必须；万古霉素，抑制阳性菌生长。麦康凯：用于检测大肠菌群和肠道致病菌。基础成分：蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、蒸馏水。特殊成分：乳糖和中性红，大肠菌群为粉红/红色，肠道致病菌为透明；3号胆盐和结晶紫，抑制阳性菌及真菌生长。,平板的初步判读,条件致病菌：又为机会致病菌，在某种特定的条件下致病的细菌，为人体正常菌群，但其聚集部位发生改变、机体抵抗力降低或菌群失调时可致病。痰标本的正常菌群主要以阳性菌为主。接板、读板顺序：血平板、嗜血巧克力平板、麦康凯平板血平板：反映细菌在体内的生长情况，用于半定量的判断，观察是否存在溶血、判断优势菌。嗜血巧克力平板：抑制革兰阳性菌，革兰阴性菌及真菌生长良好，不能用于半定量的判断，主要用于流感嗜血杆菌鉴定。,平板的初步判读,流感嗜血杆菌：革兰阴性短小杆菌，氧化酶、触酶反应不定，嗜血巧克力平板上形成微小、无色透明似露滴状的菌落，有特殊气味。血平板可形成“卫星现象”。鉴别诊断：流感：V+X因子；副流感：V因子麦康凯平板：抑制革兰阳性菌及真菌，革兰阴性菌生长良好，不能用于半定量的判断，主要用于大肠菌群与肠道致病菌、非发酵菌的鉴定。大肠菌群包括埃希菌属和肠杆菌科，发酵乳糖产酸，菌落颜色粉红或红色。肠道致病菌、非发酵菌包括沙门、志贺、假单胞菌属、不动杆菌属等。不发酵乳糖，菌落颜色透明或半透明。,细菌的初步鉴定,一、判断溶血溶血：不完全溶血，主要有草链、肺链（湿润、脐窝状、OP阳性）、粪肠、屎肠等。溶血：完全溶血，主要有金葡、溶葡、甲型/乙型链球菌、铜绿、大肠、李斯特菌、芽孢杆菌（污染）等。溶血：不溶血二、观察菌落形态革兰阴性杆菌：菌落较大、湿润、扁平、部分有特殊气味（大肠、铜绿）；革兰染色阴性。革兰阳性球菌：菌落较小、干燥、凸起、部分有特殊气味（葡萄球菌属）；革兰染色阳性。,细菌的初步鉴定,三、生化鉴定革兰阳性菌：触酶阳性：葡萄球菌属、李斯特菌属等。触酶阴性：链球菌菌、肠球菌属等。凝固酶阳性：金葡、施氏葡、中间葡等凝固酶阴性：表葡、溶葡、头葡等，致病力弱，需连续检出才能确定为致病菌。革兰阴性菌：氧化酶阳性：假单胞菌属、弧菌属、气单胞菌属、产碱杆菌属、奈瑟菌属等。氧化酶阴性：埃希菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属、沙门、志贺菌属等。氧化酶不定：洋葱、流感等。值得注意：嗜麦芽氧化酶阴性。,培养结果的判读,有意义：, 合格痰标本培养优势菌中度以上生长(+)，结合临床症