2015检验理论与应用1

,PCR技术STR技术组织配型技术测序技术在临床检验的应用进展中日联谊医院科研中心 吴晓冬,PCR技术在临床检验中的应用,PCR技术简史：1983年，提出了PCR的概念1985年，Mullis等提出了耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1988年在Science上发表了关于TaqDNA聚合酶的论文1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年1993年Mullis荣获诺贝尔化学奖,PCR技术的分类,免疫PCR（ImmunoPCR，I-PCR） 套式引物PCR（Nested primer PCR）反转录 PCR（Reverse transcription PCR， RT-PCR） 反向PCR（Reverse PCR） 标记PCR（Labelled primers PCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 玻片PCR（SlidePCR） 定量PCR 锚定PCR（Anchored PCR）,实时荧光定量PCR,1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。,定量与常规的差别,常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析。定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析。,实时荧光定量PCR原理,实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,Threshold 即能够检测到的荧光信号域值，通过比较不同样品达到域值所需的循环数，从而可以比较不同样品的浓度。CT (Cycle Threshold) -在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,Monitoring Real-Time PCRThree Phases of PCR,相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性。,实时荧光定量PCR原理,Ct值与起始模板的关系 ：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,荧光定量标准曲线,实时荧光定量PCR原理,荧光化学 ：荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。,Taqman荧光定量PCR技术,TaqMan探针,Target sequence,R = 报告荧光 (FAM or VIC 染料)Q = 淬灭荧光 (NFQ),5,3,Taqman荧光定量PCR技术,探针杂交,反向链引物,正向链引物,5,3,5,3,5,5,Taqman荧光定量PCR技术,正向链引物,反向链引物,5,3,5,3,5,5,退火，延伸,5,3,5,5,3,5,替 换,Taqman荧光定量PCR技术,5,3,5,5,3,5,剪 切,R,Taqman荧光定量PCR技术,5,3,5,5,3,5,延伸结束,R,Taqman荧光定量PCR技术,PCR Amplification Plot,FAM Dye signalfrom sample,VIC Dye signalfrom IPC,CT value = 23.35,CT value = 28.06,Smaller the CT numberthe more DNA detected,定 量 结 果,ng/L,由标准曲线计算样品量,CT,(Log N) initial concentration,DNA标准品扩增图,50 ng/ L,0.023 ng/ L,Smaller the CT numberthe more DNA detected,Used to Calculate CT,样品扩增图,CT = 23.35,CT = 28.01,CT = 30.85,样本未检测到DNA,PCR技术在医学上的应用,病原体的检测基因遗传病的诊断肿瘤基因的检测和诊断 法医学研究,病原体的检测,人类免疫缺陷病毒（HIV）乙肝病毒(HBV)及其分型丙肝病毒（HCV）与戊肝病毒（HEV）人乳头瘤病毒（HPV） 及其分型结核杆菌巨细胞病毒EB病毒幽门螺杆菌其它病原微生物:脑膜炎双球菌、淋球菌、肺炎支原体、寄生虫 等,镰形细胞贫血 由于基因突变而引起Hb的结构异常，正常人Hb的珠蛋白链第6位上谷氨酸被缬氨酸代替而形成血红蛋白S(HbS)所致。 Chehab等设计一对引物，扩增后正常人有2个片段，镰形细胞贫血的纯合子，仅有一个片段；杂合子有3个片段。杜氏营养不良症（DMD） 60的DMD患者存在着dystrophin基因缺失甲型血友病 为X性连锁隐性遗传 另外，一些有遗传倾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血压等,PCR及其相关技术在遗传性疾病诊断中的应用,肿瘤基因的检测和诊断,恶性肿瘤分子标记的检测：如慢性粒细胞性白血病(CML）。CML的费城染色体(即ph染色体）是标记染色体; 融合基因BCR-ABL的检测癌基因、抗癌基因缺失与点突变研究 肿瘤相关病毒基因的研究： HBV与原发性肝癌；EBV与鼻咽癌、何杰金氏病等有关；近年来用PCR技术在宫颈癌、前列腺癌、肠癌和Kaposi肉瘤等组织中均检出有HCMV DNA顺序，提示 HCMV具有潜在的致癌性。,法医学研究,利用罪犯在犯罪现场留下的任何少量标本，如一根毛发、一滴血液、极小的血斑和精斑等其它分泌物或组织块等进行PCR扩增，结合指纹图谱等分析可进行个体识别、亲子鉴定、性别鉴定等。,STR技术在临床检验中的应用,DNA指纹技术（DNA Profile） 人类基因组超过90的序列为重复序列，它们不编码mRNA前体或其它RNA，由串联、重复排列而成的DNA序列构成数量可变的串联重复序列，其串联重复单位的数目在人群中存在较大差异性，具有高度多态性。重复单位长度为1070bp的称为小卫星DNA.,DNA指纹图的遗传规律,遗传方式：子代图谱中所有的片段都可以在双亲的图谱中找到，片段的传递符合孟德尔遗传规律。 个体的组织同一性：即来源于身体不同部位与类型的组织，其DNA指纹图谱是一致的。 群体遗传学特征：无法判断各靶基因座位基因型，因此不能按照传统遗传学方法调查人群中等位基因数和分析等位基因的频率。,不同的个体有不同的DNA指纹图,DNA指纹图技术存在的缺点,无法确定等位基因。 对任何一条带，无法确定是由纯合子或杂合子产生。 无法确定每条带所代表的基因座即染色体定位。 无法确定基因座之间的独立性。 对检材要求较高。,STR（short tandem repeat）,短串联重复序列，也叫微卫星DNA，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列。其核心序列为2-6bp，重复次数通常在15-30次。 DNA片段长度为100-350bp。它们也是染色体上的来自父母的配对的等位基因。,2-6bp,由于每个人STR基因座的核心单位重复次数不同，造成它们的DNA片段长度不同，因此构成了人群中极为高度的STR基因座的DNA片段长度的多态性。 多数STR基因座具有多态性，其高度多态性主要源于核心序列重复次数的个体间差异，这种差异在基因传递的过程中一般遵循孟德尔共显性遗传规律。,优点：仅需少量模板DNA，灵敏度、扩增效率高。第二代法医DNA指纹技术的核心个体识别率高STR检测和以往的DNA水平的检测相比，由于它在人类基因组中分布极为广泛，且片段小，等位基因多，杂合度高。如两个无关个体在14个STR基因座基因型完全相同的可能性仅为110-14，理论上讲目前地球上60亿人口中没有任何两无关个体在这14个STR基因座基因型完全相同。,获得检材中细胞,经物理化学作用释放DNA,经过一系列实验操作及仪器分析得到分型结果,应用PCR反应的对DNA进行几何级数放大,统计学计算得出结论,组织配型技术的 实验诊断进展,器官移植（organ transplantation ） 由于不同种族、不同个体的HLA型别千差万别，必须采用一定的方法对捐献者和患者的HLA型别进行确定，从而选择与患者HLA相配合的捐献者进行移植，这是器官移植治疗成功的关键。,概 述,HLA “人类白细胞抗原”,HLA, 英文全称 Human Leucocyte Antigen。 HLA作为人体组织细胞的遗传学标志，在机体的抗原 识别、提呈、免疫应答调控以及抗感染免疫等方面发挥 重要作用。 HLA是导致移植物排斥的主要抗原，HLA配型是影响器 官移植存活率的重要因素之一。长期以来人类白细胞抗 原(HLA)又被称为移植抗原。,HLA基因是调节人体免疫反应和异体移植排斥作用的一组基因 HLA系统的基因位于第六号染色体的短臂上。HLA抗原根据不同的基因位点分为一类、二类和三类抗原,HLA “人类白细胞抗原”,一类抗原: HLAA，B，C 位点 二类抗原：HLADR，DQ，DP 位点 三类抗原：补体,HLA的多态性及其遗传规律,正常情况下，人体细胞是二倍体型的。染色体上HLA各位点的等位基因全部为共显性的。由于在一条染色体上HLA各位点之间距离非常近，因此HLA常作为一个整体遗传给子代。在一条染色体上HLA各位点的基因组合称HLA单倍体型(Haplotype)，如：A1，B8，DR17。在细胞膜上能检测出的抗原特异性，则称为表现型(Phenotype)，如：A1，A11，B8，B55，DR17，DR7。两个同源单倍体型构成HLA的基因型 (Genotype):如A1，B8，DR17（母亲），A2，B7，DR15（父亲）。,HLA的多态性及其遗传规律,两条染色体，一条来自父亲，一条来自母亲。每个位点含有两个等位基因，一个来自父亲，一个来自母亲。一般来说，两个同胞之间具有相同基因型的机会为25%；两个单倍体型完全不同的占25%；一个单倍体型相同的是50%。,HLA的主要应用,HLA与器官移植HLA与临床疾病HLA与人类学的研究HLA与亲子鉴定,HLA在器官移植中的应用,1954年，美国Murry医生为一同卵双生姐妹进行肾移植获得成功。1963年，美国医学家进行人类历史上第一例肝移植1963年，美国另一位医生做了第一例肺移植1967年，南非开普敦的一所医院完成了第一例心脏移植1968年，美国几位科学家又进行了第一例心肺联合移植肾移植受者与供者HLA-A、HLA-B、DR三个位点抗原相同与否器官存活率的差别：第一年12%，第三年为19%，第十年为33%。 尤其是DRB1的相配，可以提高一年存活率610%。人类白细胞抗原（HLA）主要配型：HLA-A、B、DR位点,一 移植前后的常规检测 血型、血尿便常规、肝肾功能、血电解质、出凝血功能、血气分析、感染免疫、细菌、真菌、病毒检测 二 移植术前相关检测 HLA抗原检测、群体反应性抗体（PRA）、淋巴细胞毒实验、细胞色素P450酶系3A亚家族中CYP3A5 基因检测等 三 移植术后相关检测 PRA、外周血T淋巴细胞及其亚群、HCMV感染检测、细胞因子、免疫抑制剂药物浓度监测等,组织器官移植的常用检测项目,一、 淋巴细胞毒交叉配型试验(CDC） 也称为补体依赖性细胞毒性反应 受者血清 供者淋巴细胞 抗体 抗原 补体 细胞穿孔、细胞溶解 染料 死亡细胞数量,组织器官移植的常用检测项目,荧光单克隆抗体分型技术荧光单克隆抗体+ 受者淋巴细胞 补体 细胞溶解 染料 死亡细胞数量,组织器官移植的常用检测项目,二、HLA分型技术,组织器官移植的常用检测项目,组织器官移植的常用检测项目,DNA分型技术限制性片段长度多态性-PCR（PCR-RFLP）序列特异性寡核苷酸探针-PCR（PCR-SSO）单链构象多态性-PCR（PCR-SSCP）DNA 序列测定序列特异性引物-PCR（PCR-SSP),3 HLA分型技术,组织器官移植的常用检测项目,Reverse SSO Typing with a Multiplex Flow System,精确 快速 简易 大标本量 经济,LABType SSO技术的特点,特异性位点扩增及最新的探针设计 可在同一块板同时扩增HLA-A,B,DR位点 降低非特异性扩增导致的反应信号 改善传统SSO技术的精确度, 将模棱两可率降到了1% 同一PCR扩增条件适用于所有位点 DNA浓度的可接受范围：10-200ng/L 所有试剂不需要预先孵育（pre-incubation),每次扩增96份标本 扩增时间90分钟 扩增后每处理96份标本时间90分钟（1个人） 扩增后标本可在4冰箱内储存72小时 标本可以重新测定 不需要制胶及电泳, 避免接触有毒物质 计算机分析结果 ，大大降低了人为误差,LABType SSO技术的特点,多元化分析在一个反应体系完成全部反应无需试纸条或杂交膜适于处理大样本分型，同时也适于小样本自动读取数据和分析结果，降低人为误差高效、准确和低成本,LABType SSO技术的特点,LABType SSO技术的原理,包被了探针的微球示意图,96孔读板 示意图,2. 变性、中和,3. 杂交,4. 标记,1. 扩增,三、 群体反应性抗体（PRA）检测及其方法 淋巴细胞 患者血清 已知抗原 + 特异抗体 补体 细胞溶解判断患者的免疫状态及HLA 抗体的特异性。,组织器官移植的常用检测项目,组织器官移植的常用检测项目,四、细胞色素P450酶系3A亚家族中CYP3A5 基因检测 CYP3A5基因多态性 CYP3A5 *1/*1和*1/*3型患者早期要达到目标血药浓度,需提高该组患者的起始用药剂量, CYP3A5 *3/*3型患者则应适当降低起始剂量。 根据CYP3A5基因多态性作为FK506个体化用药的依据,可以减少早期急性排斥反应及不良反应发生率。,组织器官移植后的实验室监测（一）移植器官的功能监测 1.肝功能的监测 2.肾功能的监测 3.造血干细胞的功能监测,组织器官移植的常用检测项目,（二）移植排斥反应监测 1. 淋巴细胞亚群 2. 排斥反应相关细胞因子 3. 激活的淋巴细胞内细胞因子的检测,组织器官移植后的实验室监测,（三）免疫抑制剂药物血药浓度监测1. 环孢素（CsA）浓度的监测2. 他克莫司（FK506）浓度的监测3. 马替麦考酚酯（骁悉）浓度监测4. 雷帕明（RAPA）浓度监测,组织器官移植后的实验室监测,（四）感染监测1. 病毒感染（1）人巨细胞病毒感染（2）EB病毒感染（3）单纯疱疹病毒（HSV）感染对移植器官受者的影响2. 细菌感染3. 真菌感染,组织器官移植后的实验室监测,一、肾脏移植（一）组织配型（二）常用的实验检测 1 移植术前的实验检测 乙肝、丙肝、常规检测 2 移植术后的实验检测 （l）尿液检查 （2）肾脏功能检查 （3）免疫学检查 （4）其他检查：血、尿2 -MG 、药物浓度（环孢素A或FK506）等,常见器官移植的实验诊断,二、肝脏移植（一）组织配型（二）常用的实验检测1 移植术前的实验检测（1）肝功能检测（2）肝脏肿瘤的血清标志物检测（3）肾功能检验（4）病毒性肝炎标志物（5）动脉血气分析 2. 肝移植术后的实验检测（l）肝功能检测（2）肝移植排斥反应的检测：超急性排斥反应可见肝功异常（3）根据不同免疫抑制剂方案监测相应的血药浓度,常见器官移植的实验诊断,三、造血干细胞移植（一）组织配型（二）常用的实验检测1 移植术前实验检测 （l）骨髓检查 （2）CD34造血干祖细胞计数 （3）染色体分析2 移植术后实验检测 （l）移植后嵌合状态检测 （2）GVHD 的实验检测 急性GVHD 慢性GVHD 骨髓象检查,常见器官移植的实验诊断,HLA 组织配型是指应尽可能选择与受者HLA 相同的供者进行器官移植的选配过程。相配位点越多，移植物生存时间越长。 PRA反映移植受者的预致敏状态，用于识别受者不可接受的HLA 基因。 移植后病人长期服用免疫抑制剂的药物浓度监测，直接影响到移植物的存活情况。,测序技术在临床上的应用,1 一次测序可以检测多个突变位点2 可能检测到新的耐药突变位点3 数据结果准确、直观4 毛细管内荧光检测，灵敏度高5 自动化程度高、速度快,测序诊断的特点,肿瘤易感基因检测 与大肠癌相关K-ras易感基因检测,K-ras基因是什么？K-ras基因为一种原癌基因，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要的调控作用，在参与表皮生长因子受体（EGFR）信号传导过程起着分子开关的作用。EGFR单克隆抗体可与内源性配体竞争性结合EGFR，阻断EGFR介导的细胞通路，产生抗肿瘤效应。而一旦K-ras基因发生突变，（EGFR）单克隆抗体就会失效，不能起到抑制肿瘤的作用。正常的K-ras基因（野生型）可抑制肿瘤细胞生长，而一旦发生突变，它就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，从而导致肿瘤的发生。,EGFR基因是什么？EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶活性，是原癌基因Cerb一1(HER一1)的表达产物，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，EGFR基因与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关 。,肿瘤易感基因检测 与肺癌相关EGFR基因检测,抗EGFR单抗作用机制抗EGFR单抗通过阻断EGFR二聚体的形成，抑制其下游的细胞内信号传导，从而抑制肿瘤细胞的存活、增殖、转移以及心血管生成KRAS基因突变致抗EGFR单抗失效K-ras基因突变可旁路激活细胞内信号传导，从而导致抗EGFR单抗丧失抗癌活性,K-ras基因与结直肠癌我国大肠癌发病率已占到常见肿瘤的第四位，这其中很多都是30至40岁的中年人。K-ras基因突变在西方结直肠患者人群中，K-ras基因突变型约占40%，我国目前没有大样本测序数据，一项基于国内40家检测中心已完成的近1000例K-ras基因检测结果显示，65.9%的结直肠癌患者为K-ras野生型。大部分突变发生在密码子12和13，密码子61的突变发生率很低。,DNA测序中检测的K-ras突变点针对KRAS基因突变的检测主要集中密码子12和13,结直肠癌从此“一分为二”K-ras基因是野生型还是突变型，使传统意义上的一种疾病被分成两种独立的疾病。K-ras突变型结直肠癌患者约占40%，这类患者不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用。其余60%左右的K-ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。,K-ras基因检测临床意义,对结直肠癌预后评价K-ras可以筛选出抗EGFR（表皮生长因子受体）靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后，延长患者生存期。早期检测K-ras还可以通过该基因的状态了解到病人的复发转移风险，为将来选择最佳治疗做好准备。,K-ras基因检测临床意义,提高了对结直肠癌的靶向治疗K-ras基因突变检测做为结直肠癌患者进入个体化靶向治疗疗程之前需要进行的检测，已被美国癌症综合网络（NCCN）列为结肠癌临床治疗指南与直肠癌临床治疗指南临床用药必检项目：用于辅助临床医生筛选出可受益于Cetuximab（西妥昔单抗/爱必妥）和Panitumumab（帕尼单抗）等特效药的结直肠癌患者。另外，09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南明确指出：当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib）进行分子靶向治疗。,K-ras基因检测临床意义,肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤，并已成为绝大多数国家癌症死亡的主要原因。其中以非小细胞肺癌(NSCLC)最常见。目前靶向治疗已经成为非小细胞肺癌（NSCLC）临床治疗的重要手段。 易瑞沙（吉非替尼）和特罗凯（厄罗替尼）作为表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。 但是，临床试验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30%的NSCLC病人有显著疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，绝大多数携带