免疫细胞治疗齐鲁细胞治疗

临床信息部,生物免疫 治疗,山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司山东省脐带血造血干细胞库山东省细胞组织库,45岁进入了肿瘤发病高峰，且肿瘤风险随年龄增加呈几何倍数上升65岁的老年人患肿瘤的几率是25岁年轻人的50多倍,40岁后肿瘤发病率逐年增长,免疫器官,免疫细胞,免疫分子,免疫系统是人体的防御体系，一方面清除细菌、病毒等外来异物，另一方面清除体内衰老的无功能细胞以及发生突变的细胞。一个人身上每天有数万亿个细胞在复制，在复制中，约有万分之一到百万分之一的细胞会出现差错，也就是说，每天约有50-100万个细胞可发生突变。有的突变细胞进一步变为癌细胞。,免疫系统免疫防御、免疫监视、免疫自稳,“In large, long-lived animals, like most of the warm-blooded vertebrates, inheritable genetic changes must be common in somatic cells and a proportion of these changes will represent a step toward malignancy. It is an evolutionary necessity that there should be some mechanism for eliminating or inactivating such potentially dangerous mutant cells and it is postulated that this mechanism is of immunological character.” Sir Frank Macfarlane Burnet 诺贝尔生理学或医学奖 1960,肿瘤免疫治疗理论“免疫监视”理论 (Immune Surveillance Theory),“肿瘤免疫编辑”(Tumor Immunoediting） Elimination: 免疫消除Equilibrium: 免疫平衡Escape: 免疫逃逸,发病时,健康时,肿瘤的潜伏期长达10年以上,癌细胞反复进行分裂，约30次后大小约0.7cm时，初次被影像学识别为 “癌症” ；早期癌症被发现时的大小约是1cm，重量约是1g，其中癌细胞的个数约是10亿个；据统计，肿瘤发展到临床诊断，所经过的时间约为10年，这期间是防治的黄金时间。,Chester Southam: 在五十年代首次给志愿者注射活的癌细胞,结果:注射的癌细胞在健康人体内不生长.注射的癌细胞在癌症病人体内可长成大肿瘤。结论：癌症病人体内失去健康人所具有广谱抗癌活性。研究项目受到伦理学及法律的极大挑战。研究结果为抗癌界带来极大提示，1968年被推选成全美抗癌学会主席。,Science，1957年 一月 125: 158-160,首次证明人体内天然抗癌活性的存在,人体免疫与肿瘤的发生,恶性肿瘤离我们有多远?,我国每年新发肿瘤病例约为312万例平均每天8550人（全国每分钟有6人被诊断为癌症）肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤、脑肿瘤和乳腺癌,肿瘤的治疗,肿瘤的治疗,攻克癌症 人类的第一次,手术1809年德国医生McDowell第一次用手术切除卵巢癌，并取得36年生存期的良好效果。放疗1895 年伦琴发现了X 线, 1896 年即用X 线治疗了第1 例晚期乳腺癌。化疗化学治疗 上世纪40年代用氮芥治疗恶性淋巴瘤取得显著疗效，自此开始了肿瘤的化学治疗。50年代以环磷酰胺、氟尿嘧啶合成为标志是化疗的第二里程碑，70年代顺铂及阿霉素进入临床并得以广泛应用是化疗的第三里程碑。90年代以后，抗肿瘤的新药不断推出。,？,？,？,1973年 肿瘤生物研究取得了一个惊人的进步。美国学者Steinman发现了DC细胞(树突状细胞)，这个细胞被证实可以跟踪和识别人体内的任何部位的癌细胞。接着就发现了免疫系统抑制肿瘤的机理。即DC细胞发现癌细胞后激活免疫反应，引发T细胞对癌细胞的剿灭。1982年 Grimm等首先报道外周血单个核细胞（PBMC）中加入IL-2体外培养4-6天，能诱导出一种非特异性的杀伤细胞，这类细胞可以杀伤多种对CTL、NK不敏感的肿瘤细胞1984年11月 Rosenberg研究组经美国食品和药品检验局（Us Food and Drug Administration,FDA）批准下，首次应用IL-2与LAK协同治疗25例肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤患者。1986年 Rosenberg研究组首先报道了肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）。TIL细胞表型具有异质性，一般来说，TIL中绝大多数细胞CD3阳性。,2011年度诺贝尔生理学或医学奖由三人分享。其中一半奖励布鲁斯巴特勒(Bruce A. Beutler)和朱尔斯霍夫曼(Jules A. Hoffmann)在激活先天免疫方面的发现。 另外一半奖励拉尔夫斯坦曼(Ralph M. Steinman)“发现树状细胞和它在适应性免疫中的作用”。,临床信息部,细 胞 产品,一、CIK细胞,CIK细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)，即细胞因子诱导的杀伤细胞，是一种新型的免疫活性细胞，该细胞对肿瘤细胞的识别能力很强，如同“细胞导弹”，能精确“点射”肿瘤细胞，但不会伤及“无辜”的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力。,DC细胞寻找肿瘤细胞的“雷达”DC又称树突状细胞。它是目前发现的功能最为强大的专职抗原递呈细胞，也是唯一能激活幼稚T细胞的抗原递呈细胞，在免疫应答的诱导中具有独特地位。经临床研究的结果显示，DC细胞可促使患者T细胞增殖分化，还可激活B淋巴细胞，全面启动抗体免疫系统产生高效而特异的抗肿瘤效应，帮助重建肿瘤患者对肿瘤细胞的免疫监视功能。DC细胞的功能如同“雷达”，通过在体内随着血液全身各处主动搜索、识别肿瘤细胞，并把信息传递给免疫活性细胞，促进其激活和大量繁殖。,二、DC细胞,三、DC-CIK,通过负载肿瘤抗原的DC与CIK的有机结合（即DC-CIK细胞）能产生特异性和非特异性的双重抗肿瘤效应，二者具有一定的互补作用。DC-CIK细胞不仅能激发、增强肿瘤患者特异性抗肿瘤免疫应答，有效清除体内残留病灶，且在患者体内诱发免疫记忆，从而获得长期的抗瘤效应。DC-CIK自体细胞免疫治疗可以有效杀灭术后的残留肿瘤细胞，防治复发和转移，减轻放化疗的毒副作用，减轻患者痛苦，提高患者自身免疫机制和生活质量，延长患者生命。,扩增活化的自体淋巴细胞（Autologous Immunotherapy Lymphocytes,AIL），又称为高效CIK细胞。 是从患者自体外周血（50-100ml）中分离单个核细胞，经过体外激活扩增培养，得到的一种在生理条件下能够杀伤肿瘤细胞的细胞群，主要效应细胞包括MHC限制性效应细胞（CD3+CD8+细胞毒性T细胞、CD3+CD4+辅助性T细胞）、非MHC限制性效应细胞（CD3+CD56+细胞、CD3-CD56+NK细胞），可有效辅助恶性肿瘤的治疗。,四、AIL细胞,AIL与CIK培养方法比较,50 ml外周血,PBMC,A培养法：,B培养法：,A培养法（传统CIK）：DI：IFN-1000U.ml-1D2：OKT3 mAb.100ng. ml-1 、IL-2 1000U. ml-1、PHA 100ug.ml-1,B培养法（AIL）：DI：IFN-1000U.ml-1 D2：OKT3 mAb.100ng. ml-1 、IL-2 1000U. ml-1、PHA 100ug.ml-1 ，AIL扩增试剂,自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK）是一种细胞质中具有大颗粒的细胞，来源于骨髓，主要存在于外周血、脾脏和骨髓中。对靶细胞杀伤时既不需特异性抗体参加，也不需抗原预先致敏。自然杀伤细胞可在接触病原体或肿瘤细胞后，立即发挥非特异性杀伤靶细胞的作用，尤其是对多种肿瘤细胞有迅速杀伤和溶解作用。因此，NK细胞对癌症的监视作用已越来越受到重视。,五、NK细胞,一、NK细胞是人体内抗癌活性的第一道防线，可直接杀死癌细胞，抑制肿瘤的生长及扩散；二、NK细胞会抑制肿瘤附近新血管的增生，因此可限制肿瘤取得所需要的养份进而限制肿瘤生长；三、NK细胞可直接改善并调节患者的免疫力及神经系统，间接提高患者之生活品质；四、副作用低或几乎无副作用。,NK细胞作用原理,六、iAPA-细胞,SOCS1 是维持机体免疫耐受的重要分子,Si-Yi Chen et al. 发现： SOCS1 (Suppressor of Cytokine Signaling 1) 是一种重要的免疫负调节因子(antigen presentation attenuator, APA) ，对DC细胞的抗原呈递起负调节作用，限制抗原呈递的时间和强度，从而限制自体抗肿瘤免疫反应。该研究第一次提出了抑制免疫负调控因子来增强DC疫苗的概念,Nature Biotechnol. 2004; 22:1521-2评述：Nature Biotechnol. 2004;22:1546-53 J. Clin. Invest. 2006;116:90100,STAT,SOCS1,JAK,Cytokine,IFN, IFN, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-12, IL-7, IL-15, M-CSF, etc.,LPS,MyD88,TRAF6,IKK,IKK,RelA,p50,IB,IKK,IRAK,Mal,SOCS1,TLR 配体,TAA,s-Flagellin,SOCS1-siRNA: 解除DC免疫耐受(persistent and enhanced Signals 2/3),肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen , TAA) intracellular Survivin (T cells) surface MUC1 (T cells and Ab),分泌型FliC: TLR5 ligand auto- and paracrine activation of APCs(enhanced Signals 2/3),siSOCS1-TT,iAPA技术治疗肿瘤,iAPA-细胞,与传统免疫细胞治疗相比，iAPA技术的优势,结构新颖：iAPA因子包含抑制SOCS1的siRNA、肿瘤抗原（Survivin, muc1）和鞭毛蛋白。机制新颖：iAPA技术不但针对性增强DC免疫活性，而且去除了免疫负性调控因素，从而更有效的增强了免疫效应。创新靶点：iAPA技术作用的靶点独创性针对免疫活化通络上的关键性分子iAPA分子-SOCS1,29,30,2017年12月16日星期六,iAPA技术完全打破了传统的免疫治疗理念与方法，代表了免疫学理论的一场新的革命，为国际首创、世界一流。许多研究成果已分别发表在国际一流权威杂志，包括Nature biotechnology、Nature medicine与JCI等。,基础研究：国际首创世界一流为国际医学界所公认,CTL(Cytotoxic T Lymphocyte)，细胞毒性T细胞，其表面标志是CD8。这些细胞的功能就像一个“杀手”，它们可以直接攻击带有特殊抗原的靶细胞，在抗病毒感染和抗肿瘤免疫中具有极其重要的用，细胞毒性T细胞也被称为杀手T细胞。,七、CTL细胞,肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocytes，TIL）是通过采集患者胸腔积水或者腹水，经过体外激活扩增培养，得到的一种在生理条件下能够杀伤肿瘤细胞的细胞群。它是新一代的特异性免疫活性细胞疗法，具有高效、特异、副作用小等优点，可有效辅助恶性肿瘤的治疗。,八、TIL细胞,TIL细胞流程及适应症,TIL细胞的适应症：适用于顽固性恶性胸腹水。,临床信息部,临床应用及案例,一例晚期肝癌患者实现6年带瘤生存Hepatology (28),5,1436-7,1998.,患者：62岁，男性，丙肝，肝癌Child B级，约7厘米大小。已出现右门静脉肿瘤栓塞和右肾转移（T4N0M1,B期）该肿瘤已无法切除。该患者因此接受了质子照射治疗，治疗后肿瘤出现坏死并且体积缩小至原来的50%。CIK治疗：放射治疗之后患者每12月应用一次过继性免疫治疗平均每次回输细胞1.40.510（10）绝大多数为T细胞标记阳性（95%2% CD3+，902%CD3+/HLA-DR+，61%9% CD8+，39%8% CD4+）且对Daudi细胞具有细胞毒活性的细胞。细胞回输在6年内共为53次完成（平均5-6周一次回输）累计回输细胞总数为7.310（11）结果：获得了6年无复发生存，整个过程没有出现治疗相关的不良反应。在长期观察中，该患者健康状况良好，未出现肝癌的复发，且肝功能好转。,放疗后，回输自体T细胞，肿瘤于1994年中期消失，6年无复发。AFP和AST持续降低，处于正常范围内，HCV-RNA降低。,胰腺癌广泛肝转移,男性，38岁。胰腺癌广泛肝转移；KPS100分2008.08：TACE1次后，分子靶向治疗+CIK 1次/2周+健择 1次/周；2008.10：MR; 肝转移灶减少、缩小2009.02：SD；肝转移进一步减少、缩小,301医院,肺腺癌病人经一个疗程DC+CIK后的CT结果,治疗前,治疗后,青岛市中心医院,肺泡癌经过3个疗程DC+CIK治疗后的CT图像,治疗前,治疗后,青岛市中心医院,过继性免疫治疗降低肝癌术后复发率的随机对照试验,治疗方法,肝癌术后患者，分为2组，CIK治疗组76人，不进行任何治疗组，74人。手术前一天采血50ml用于细胞培养，冻存2*108细胞用于后续细胞培养；术后第2、3、4、12、24周回输细胞，平均每次治疗回输1.5*1010细胞，每个病人平均回输7.1 *1010细胞；不进行其他任何治疗。,治疗结果,副反应,免疫细胞治疗的不良反应以自限性低烧为主，一般发生在回输后4-8小时，体温一般38 左右，发热在2-4小时内可缓解，不需特殊处理，对体温超过38.5的患者可用退烧药解除症状（如消炎痛栓100mg塞肛）。其他不良反应，如头痛、恶心、头晕、瘙痒、心动过速、关节疼痛等较为少见，出现时可对症处理。,CIK治疗转移性肾癌的随机试验,转移性肾癌治疗现状,预期不良：中位生存期12个月，5年生存率不到10%；放化疗、激素治疗耐受；极少数患者可以使用高剂量的IL-2获得完全缓解，但是副作用极大；靶向药物：sunitinib， sorafenib， temsirolimus，bevacizumab等成为一线治疗方式，但是仅仅是姑息治疗，很少能达到完全缓解。,入选标准,进展且不可切除的转移性肾癌；预期生存期大于3个月；KPS评分大于40%；血清胆红素、肌酸酐小于正常上限的1.25倍；无充血性心衰、严重的冠心病、心律不齐、HIV感染、慢性肝炎、糖皮质激素治疗；治疗前1个月未进行化疗及免疫调节治疗；孕妇或哺乳期的妇女；共入选148名患者，分成CIK组和IL-2、IFN-2a组,平均10 cycles，2-35 cycles,治疗结果,两组的副作用比较,微创联合CIK降低了肝癌的短期复发率,患者入组,肿瘤大小2-13cm；无肿瘤堵塞门静脉；无远端转移；Child-Pugh A、B；KPS大于90。治疗组45人；对照组40人；,治疗方案,所有患者都进行连续的TACE和RFA之后每14天连续回输CIK，每次1-1.5*101039位患者回输8次6位患者回输10次,治疗结果,治疗前后患者外周血淋巴细胞亚群变化,无复发生存率（RFS）,增加的CIK回输次数降低了胃癌患者死亡的风险,患者分组,手术后156位患者分为两组，Group I：化疗组；Group II：化疗+CIK组,治疗方式,化疗组：oxaliplatin (120 mg/m2 D1, 5-Fu 400 mg/m2 CIV 24 h D1-5, CF 200 mg/m2 D1-5)化疗+CIK组：6周期的化疗后回输CIK，每次1*109,治疗结果,患者的选择,确诊为恶性肿瘤；生活自理，卡氏体力状况评分标准60分以上；预期生存期3个月的患者；实验室检查必须符合下列条件： 淋巴细胞绝对值0.8*109/L，PLT 50*109/L，HGB 70g/L；5. 病人有自知能力，能签署知情同意书；,治疗方案,1. 联合手术使用 术前采血培养，术后2-7天回输，提高免疫力，机体恢复快，防止复发和转移2. 联合化疗使用 化疗前采血培养冻存，给药后3-7天回输（根据化疗方案配合），提高机体免疫力，增加药物敏感性，降低药物毒副作用，进一步抑制或杀伤癌细胞3. 联合放疗使用放疗前采血培养冻存，放疗疗程结束后当天回输放疗疗程间歇期回输（例如，周五放疗后给细胞，周一开始放疗）4. 与靶向药物联合使用提前采血，靶向药物使用后的第2天回输5. 单独使用采血培养，14天后回输，间隔3天，2次/疗程，连续使用至少3个疗程,目前CIK/DC-CIK/AIL治疗的疗程,在支持治疗的基础上，静脉取血后2周左右开始第一次回输，回输2次，每3天一次。 首次治疗需连续回输至少4次。权威专家指出 免疫细胞治疗肿瘤不要按疗程，要从所回输的细胞质量上看疗效，一个免疫细胞治疗周期回输有效细胞数应大于6x109，最好能达到甚至超过1x1010。,61,采血前检查 进行患者筛查：包括乙肝、丙肝、艾滋病毒、梅毒等感染。极晚期患者需进行血培养检查，以排除患者菌血症。（艾滋病阳性患者不能进行细胞培养；菌血症患者不能进行细胞培养）。 检查患者血常规，根据淋巴细胞比例和淋巴细胞绝对值决定患者采血量。 采血量（mL）=80/淋巴细胞绝对值数值 采血前没有任何感染、发热（肿瘤热除外）以及心、肝、肺、肾功能异常。,采血注意事项,采血当日 尽量空腹采血，若采血时间较晚也可适当进食，但勿食用油腻食物或进食过量，且最好在进食2-3小时后采血。 采血前不能输液。 手术病人应术前取血；化疗病人应在化疗疗程开始前取血或化疗后血象恢复正常后取血；放疗病人应在放疗疗程开始前取血或放疗后血象恢复正常后取血。 采血前请用碘酊消毒采血管/袋接触采血针处；取血后颠倒混匀，但不能剧烈晃动。 血样保存于10-20的环境中，采血管垂直放置，采血袋水平放置，待接收人员取样。,采血注意事项, 严格核对患者信息 输注前检查包装袋外观是否完整、有无裂痕，悬液有无外溢等现象。 细胞输注之前将细胞悬液在手中摇晃5-10下，使细胞充分混匀 建议在输注细胞前5-10分钟，肌肉注射非那根12.5-25mg ，请勿使用地塞米松等免疫抑制剂。各医院可酌情处理。建议在输注细胞前，准备好应急用的药物，如地塞米松、肾上腺素等。 选择较好的血管做好静脉穿刺，使用输血器，应先输注生理盐水约20-30ml，（目的：将管路用生理盐水湿润，减少细胞损失）。将细胞悬液在手中摇晃5-10下，使细胞充分混匀，将输血器针头换到细胞输注袋进行静脉输注，调整滴注速度约20滴/分钟，观察10-15分钟，如患者无不良反应。调整滴注速度约60-70滴/分钟，1小时内将细胞全部滴完。,回输注意事项, 细胞滴注期间每10分钟摇晃输注袋及轻弹输血器，输血器管路应全部悬挂，严禁有水平放置部分，防止细胞沉淀。全部细胞输注结束后，继续静滴生理盐水20-30ml，滴净管路中的细胞。 细胞滴注中如出现寒战、发热、恶心、呕吐、气促、心悸等任何不适反应，请立即停止滴注。细胞滴注后，患者应住院观察8-24小时，注意休息，当日不洗澡，防止注射部位感染。 近期不得服用免疫抑制剂等药物。 注意饮食清淡，不饮酒及食用海鲜、蛋白类等刺激或易引起过敏反应的食物。,回输注意事项,根据不同肿瘤的生物学特性（肿瘤类型、分期和肿瘤的免疫源性）、患者的遗传背景（是否具有家族倾向？）、目前的病情状况（体质，免疫状况）、前期治疗方法、年龄等，在常规治疗的基础上，制定出适合病人的个体化体细胞免疫治疗方案。,二、制定适合病人的个体化体细胞免疫治疗方案,（一）针对老年肿瘤晚期患者，体质弱、免疫功能极度低下采取抽少量血多次回输的治疗方案,抽血30-40ml外周血,第1天,第3次CIK回输,第2次CIK回输,第4天,第8天,第12天,第14天,第16天,开始下一个疗程的治疗,第1次CIK回输,(二）化疗联合细胞治疗的增效方案,化疗前1天抽血50ml，进行CIK或D-CIK免疫细胞培养,第一周,第二周,7天,第1次开始化疗,第2次开始化疗,回输CIK或D-CIK等细胞,化疗前1天抽血50ml，进行CIK或D-CIK免疫细胞培养,（三）体细胞免疫治疗联合放疗的增效方案,放疗前抽外周血50ml，上午放疗前,放疗,放疗,放疗,两周后，当天放疗后回输免疫细胞,第2天周二,第3天周三,第1天周一,第4天周四,第6天周六,第7天周日,第5天周五回输培养的CIK、NK、D-CIK等细胞,休息,休息,（四）抗肿瘤效应细胞交替使用方案,第二周D-CIK,第三周NK,第四周D-CIK,抽血30ml,回输NK,抽血50ml,抽血30ml，回输NK细胞,抽血50ml，回输D-CIK细胞,第五周NK,第六周D-CIK,回输D-CIK,第一周NK,（五）体细胞免疫治疗联合抗肿瘤的细胞因子，抗肿瘤抗体，生物分子靶向药物增强疗效的方案,Threshold for tumor regression,Immunestimulation/inflammation,Spontaneous release of immune modulatorsby tumor cells,Spontaneous regression/response totherapy,Tumor progression,Antigen-specific Immunization，生物靶向药物 （抗肿瘤抗体和小分子化合物）,NK cells，CIK cells，D-CIK,IL-2.IFN-,（六）体细胞免疫治疗联合肿瘤常规治疗的基本原则,恶性肿瘤,手术治疗,放化疗敏感 (常规放化疗)放化疗间隙联合细胞免疫治疗（卵巢癌，乳腺癌，小细胞肺癌和鼻咽癌等）,疾病稳定期,专科治疗（微创介入）,不能手术（期，期）复发者,可手术,放化疗不敏感 （肾癌，前列腺癌，黑色素瘤