第四章 食品卫生细菌学检验技术

Chapter 4食品卫生细菌的检测技术,学习目标,掌握学习食品中菌落总数检测程序和方法。掌握学习食品中大肠菌群检测程序和方法。掌握食品中菌落总数和大肠菌群检测结果的报告方式。,主要内容,S1 菌落总数的测定,一、菌落总数,是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后,所得1mL(g)或1cm2面积检样中所含菌落的总数. 以菌落形成单位（colony forming unit CFU）表示。,二、菌落总数测定的意义,1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2、预测食品存用的期限长短。3、了解细菌在食品中的繁殖动态。,三、菌落总数测定的方法, 平板倾注法平板表面涂布法平板表面点滴法,四、平板倾注法测定菌落总数,检验步骤(程序)： 检样稀释处理做平板培养菌落计数报告结果,（一）、样品稀释及做平板,1ml,1ml,1ml,1ml,1:10,1:1000,1:100,1:10000,1ml,1ml,1ml,加入46营养琼脂1215ml,25g/ml样品,生理盐水,Note： 检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖,（二）培养,普通食品:37 48h 倒放平板清凉饮料、调味品、糕点、酒类： 37 24h 水产品: 30 48h,（三）计数和报告,到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。,（1）、单个菌做一个菌落计（2）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。,1. 菌落的选择,2、平板菌落计数的选择,（1）、选取菌落数在30300之间的平板（SN标准要求为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字。,（2）、如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告（3）、如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告（4）、如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告（5）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。,3、菌落数的报告,菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。,(四)、检验注意事项,1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；3、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整时要使管尖与容器内壁紧贴;4、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触;5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.6、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。,食品卫生细菌的检测技术,三、嗜热菌（芽孢）计数 （一）仪器用具 冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。 （二）培养基和试剂 1葡萄糖-胰蛋白胨琼脂 （同上） 2亚硫酸盐琼脂 将胰蛋白胨10g、硫酸钠1g、硫乙醇酸钠5g溶解于1000mL蒸馏水中，加入5柠酸酸铁10mL，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，pH自然。分装烧瓶，121高压灭菌20min。 3去氧肝汤,食品卫生细菌的检测技术,（三）操作步骤 将检样25g加入到盛有225mL无菌水的三角烧瓶内，迅速煮沸5min以杀死细菌繁殖体及耐热性低的芽孢，然后将烧瓶浸于冷水中冷却。 1平酸菌计数 在5只无菌培养皿中各注入2mL样液，用葡萄糖-胰蛋白琼脂做倾注平板，凝固后在5055培养4872h，计算5个平板上菌落的平均数。 平酸菌在葡萄糖-胰蛋白琼脂平板上的菌落为圆形，直径25mm，具不透明的中心及黄色晕，晕很狭，产酸弱的细菌其菌落周围不存在，或不易观察到。平板从培养箱内取出后应立即进行计数，因为黄色会很快消退。如在培养48h后不易辨别是否产酸，则可培养到72h。,食品卫生细菌的检测技术,2不产生硫化氢的嗜热性厌氧菌检验 将已处理过的样品加入等量新制备的去氧肝汤（总量为20mL）于试管中，以2无菌琼脂封顶，先加热到5055，然后在55中培养72h，当有气体生成（琼脂塞破裂，气味似干酪）时，可以认为有嗜热性厌氧菌存在。 3产生硫化氢的嗜热性厌氧菌计数 将已处理过的样品加入到已熔化的亚硫酸盐琼脂试管中（总量为20mL），共6份。将试管浸于冷水中，培养基固化后，加热到5055，然后在55培养48h。能产生硫化氢的细菌会在亚硫酸盐琼脂管内形成特征性的黑小片（因为硫化氢被转化为硫化铁等硫化物）。计算黑小片数目。某些嗜热菌不生成硫化氢，但代之以生成强大还原性氢，使全部培养基变黑色。,食品卫生细菌的检测技术,四、厌氧菌计数 （一）仪器用具 冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。 （二）培养基和试剂 硫乙醇酸盐琼脂的配制： 将胰消化干酪素15g、L-胱氨酸0.5g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g、氯化钠2.5g、硫乙醇酸钠0.5g、刃天青0.001g溶解于1000mL蒸馏水中，加入琼脂15g，加热煮沸，使琼脂溶化。调pH为7.07.1，分装烧瓶、试管中，121高压灭菌15min。,食品卫生细菌的检测技术,（三）操作步骤 1倾注平板 将检样稀释液lmL，注入于已溶化并晾至4550的硫乙醇酸钠琼脂管内，摇匀，倾注平板。 2叠一层琼脂 冷凝后，在其上再叠一层3无菌琼脂。 3培养、计数 凝固后，在37培养96h，然后取出进行菌落计数。,食品卫生细菌的检测技术,五、革兰氏阴性菌计数 （一）仪器用具 冰箱、培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、平皿、试管等。 （二）培养基和试剂 VRB琼脂的制备： 将胰蛋白胨7g、酵母浸膏5g、氯化钠5g、乳糖10g、胆盐1.5 g溶解于1000mL蒸馏水中，加入琼脂15g，加热煮沸，使琼脂溶化，再加入中性红0.03g、结晶紫0.002g，再煮沸2min。pH7.40.2 （三）操作步骤 1制备营养琼脂平板 倾注1520mL营养琼脂于无菌培养皿中，凝固后，在37烘去表面水分。,食品卫生细菌的检测技术,2涂布 吸注检样稀释液0.1mL于平板上，共2份，立即用无菌L形玻棒涂开，放置片刻。 3层叠VRB琼脂 层叠已溶化并凉到4550的VRB琼脂34mL。 4培养、计数 在30培养48h后，计数菌落。,食品卫生细菌的检测技术,S2 大肠菌群的测定,一、大肠菌群,1、 什么是大肠菌群？指一群需氧及兼性厌氧，在37能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。2、大肠菌群的组成:大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。,1、粪便污染的指标菌：大肠菌群或大肠杆菌2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因在粪便中数量最大；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；检测方法简便容易。,二、大肠菌群的测定意义,3、大肠菌群的测定意义（1）、判断食品中否受到粪便污染。（2）、有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）、有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。,三、大肠菌群的生物学特性,1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：在琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。,EMB平板照片及原理,麦康凯琼脂平板Age of culture is 24 h,大肠杆菌平板菌落照片,肠杆菌扫描电镜照片.,食品卫生细菌的检测技术,一、乳糖发酵法 （一）原理 由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行的。 （二）设备和材料 恒温恒湿培养箱（361）、冰箱（04）、显微镜、天平、高压灭菌锅。恒温水浴（44.50.5）。均质器或乳钵、酒精灯、试管架、平皿（直径为90mm）、试管、吸管、广口瓶或三角烧瓶（500mL）、玻璃珠（直径约5mm）、载玻片、盖玻片等。,食品卫生细菌的检测技术,（三）培养基和试剂 1 乳糖胆盐发酵管 成分： 蛋白胨 20g、胆盐（猪或牛或羊）5g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000 mL。 制法：将蛋白胨、胆盐、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示剂溴甲酚紫，分装于试管，并倒放入一个小试管（杜拉姆发酵管），在121高压灭菌15min，备用。 2伊红美蓝琼脂平板（EMB） 成分： 乳糖10g、蛋白胨10g、磷酸氢二钾2g、琼脂17g、2%伊红Y溶液20mL、0.65%美蓝溶液10mL、蒸馏水1000 mL。 制法： 先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀，使之溶解。再以蒸馏水补足至1000mL。校正pH值为7.27.4，分装于烧瓶内，121、15min高压灭菌备用。临用时加入乳糖并加热融化琼脂。冷至60左右以无菌手续加入灭菌的指示剂伊红Y溶液和美蓝溶液，摇匀。倾注平皿，备用。,食品卫生细菌的检测技术,3 乳糖发酵管 成分： 蛋白胨20g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25mL、蒸馏水1000 mL。 制法： 将蛋白胨、乳糖溶于水中，校正pH7.4，加入指示剂溴甲酚紫，分装于试管，并倒放入一个小试管（杜拉姆发酵管），在121高压灭菌15min，备用。 4EC肉汤 成分： 胰蛋白胨20g、胆盐（3号或混合胆盐）1.5g、乳糖5g、磷酸氢二钾4g、磷酸二氢钾1.5g、氯化钠5g、蒸馏水1000 mL。 制法： 将上述成分混合溶解后，分装在有发酵倒管的试管中，在121高压灭菌15min，最终pH为6.90.2，备用。,食品卫生细菌的检测技术,5磷酸盐缓冲稀释液 成分： 磷酸二氢钾34g、1mol/L氢氧化钠溶液175 mL、蒸馏水825 mL。 制法： 先将磷酸盐溶解于500 mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠溶液校正pH7.2后，再用蒸馏水稀释至1000 mL，制成储存液。 取磷酸盐缓冲储存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL。分装每瓶100mL或每管10 mL，在121高压灭菌15min，备用。6. 生理盐水。,食品卫生细菌的检测技术,7.革兰氏染色液 （1）结晶紫染色液 成分： 结晶紫1g、95%乙醇20mL、1%草酸铵水溶液80mL。 制法： 将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 （2）革兰氏碘液 成分： 碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300mL。 制法： 将碘与碘化钾进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。 （3）沙黄复染液 成分： 沙黄0.25g、95%乙醇10mL、蒸馏水90mL。 制法： 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。,食品卫生细菌的检测技术,8蛋白胨水（作靛基质试验用） 成分： 蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL。 制法： 将上述成分加热熔化，调pH值为7.07.2，分装小试管，高压灭菌121、15min。 9靛基质试剂 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。 试验方法：接种细菌于蛋白胨水中，于44培养24h。沿管壁加柯凡克试剂0.30.5mL，轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。,（四）大肠菌群检验程序,图7-3 大肠菌群乳糖发酵法检验程序,食品卫生细菌的检测技术,（五）操作步骤 1检样稀释 （1）以无菌操作将检样25mL（或g）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 00010000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。 （2）用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液。 （3）另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。,食品卫生细菌的检测技术,2乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置361温箱内，培养242h，观察是否产气。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 3分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板（EMB）上，置361温箱内，培养1824h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。,食品卫生细菌的检测技术,4证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置361温箱内培养24 h2h，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。 5结果报告 （1）记录 详细记录试验现象。 （2）报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查表7-2“大肠菌群最可能数（MPN）检索表”，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。,食品卫生细菌的检测技术,食品卫生细菌的检测技术,食品卫生细菌的检测技术,（六）粪大肠菌群（faecal coliferm）的检验 粪大肠菌群： 指一群能在44，24h内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产生靛基质，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，属大肠埃希氏菌型。 粪大肠菌群的唯一来源是粪便，所以它是粪便污染的确切指标。在被检样品中，如果有粪大肠菌群存在，在大肠菌群检验中也被计入，大肠菌群数实际上就是总大肠菌群数。 一般，大肠菌群和粪大肠菌群数均高，多考虑为近期污染；如果大肠菌群数高，而粪大肠菌群数低，则应着重考虑粪便的远期污染。,食品卫生细菌的检测技术,1.检样稀释 （1）以无菌操作将检样25mL（或g）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 00010000r/min的速度处理1min，做成1:10的均匀稀释液。 （2）用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液。 （3）另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。,食品卫生细菌的检测技术,2. 44乳糖发酵试验 取10mL 1:10稀释的检样，以无菌操作接种于10mL双料乳糖胆盐发酵管内（1mL及 1mL以下者，用单料管），置440.5水浴内，培养24 h2h，经培养后，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为阴性。如有产气者，则按下列程序进行。 3. 证实试验 将所有产气发酵管分别划线转种到伊红美蓝琼脂平板（EMB）上，置361温箱内，培养1824h，同时取该培养液12滴接种到蛋白胨水中，置440.5培养24 h2h。 经培养后取出平板，观察有无典型菌落生长。大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。（也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落。亦常为大肠菌群，均应注意挑选）。 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。,食品卫生细菌的检测技术,4结果评定 凡平板上有典型菌落，革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性者，则证实为粪大肠菌群阳性，则可报告被检样品中检出粪大肠菌群。 5结果报告 根据证实为粪大肠菌群阳性管数，查表7-2“大肠菌群最可能数MPN检索表”，报告每100mL（g）粪大肠菌群的最可能数。,食品卫生细菌的检测技术,（七）说明 1MPN检索表 MPN 为最大可能数（Most Probable Number）的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。 MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 2 初发酵和证实试验 国家标准的三步法，是利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37分解乳糖产酸产气”。 初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。,食品卫生细菌的检测技术,3乳糖发酵试验 乳糖发酵试验使用乳糖胆盐发酵培养基，细菌分解糖类是依靠细菌细胞所产生的各种酶类的作用，细菌产生的分解糖的酶随细菌种类不同而异，可以此鉴别细菌。 大肠杆菌能分解乳糖而产生酸，使培养基的pH降低（指示剂变色）。这一现象可作为观察结果的指标。大肠杆菌细胞在酸性环境中，由于甲酸脱氢酶的作用，可使甲酸分解成C02和H2，在培养基中产生大量气体而进入倒管中，以观察产气。,食品卫生细菌的检测技术,产气量与倒管： 在乳糖发酵试验中，经常可以看到在发酵倒管内有极微量的气泡，（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。类似这样的情况能否算产气阴性？一般来说产气量与大肠菌群检出率呈正相关，但产气量小不一定大肠菌群都是阴性，因此应慎重处理。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。,食品卫生细菌的检测技术,4挑选菌落 国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，需要对初发酵阳性培养物接种于伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。在该平板上，大肠菌群细菌发酵乳糖产酸，使伊红美蓝结合成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有时还可产生金属光泽。而不发酵乳糖的细菌如沙门氏菌、志贺氏菌等则为无色菌落。 由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。大肠菌群或粪大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。,食品卫生细菌的检测技术,另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。 5抑菌剂 大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。 抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。 在胆盐用量上，实验表明l、0.5和0.25三个剂量间无何差异，所以本方法采用的胆盐剂量（0.5）是适宜的，在称量时稍有误差，亦不致影响大肠菌群的检出。,食品卫生细菌的检测技术,二、LTSE快速检验法 （一）原理 大肠菌群能分解乳糖，由于具有甲酸解氢酶作用于甲酸，产生氢和二氧化碳气体，因此气体的产生是在产酸的同时进一步分解酸而形成的。根据这个原理，将样品接种到LTSE培养基肉汤内15h。看结果有无产气现象，然后加氧化酶试验和涂片革兰氏染色镜检结果综合判断是否有大肠菌群的存在。 （二）设备与材料 高压蒸汽灭菌锅、干热灭菌箱、恒温箱培养箱、天平、均质器、显微镜、冰箱、接种环、载玻片、试管、童汉氏小管、刻度吸管等。,食品卫生细菌的检测技术,（三）培养基和试剂 1LTSE培养基肉汤（1号）成分：乳糖 5g胰蛋白胨 20gSDS（十二烷基硫酸钠） 0.5g氯化钠 5g磷酸氢二钠（无水） 5.74g磷酸二氢钾（无水） 1g微量元素溶液 0.5mL蒸馏水 1000mLpH 7.01,食品卫生细菌的检测技术,制法：将上述各固体成分加到蒸馏水中，加热溶解，调节pH为7.01，冷却后再加微量元素溶液05mL，边加边摇匀，分装入有童汉氏小管的试管各5mL。双料成分均加倍，即将上述LTSE肉汤浓缩2倍配制，分装入内有童汉氏小管的试管各10mL（仅分装30mL的供酱油及酱类检验用），置高压蒸汽灭菌器中以115灭菌2030min，贮存于4冰箱或阴凉处备用。 2氧化酶试剂（1盐酸二甲基对苯二胺） 配制：称取盐酸二甲基对苯二胺01g，溶于蒸馏水10mL，于冰箱内避光保存。 3革兰氏染液 见本章本节一。,食品卫生细菌的检测技术,（四）检验程序 大肠菌群LTSE快速检验法检验程序见图7-4。 （五）操作步骤 1检样稀释 （1）以无菌操作将检样25mL（或25g）放于含有225mL灭菌生理盐水的无菌瓶内，经研磨或充分振摇溶解成为110的均匀稀释液。 固体检样最好用均质器，以800010000r/min的速度处理1min做成110的均匀稀释液。 （2）用lmL灭菌吸管吸取110稀释液lmL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1100的稀释液。 （3）另取lmL灭菌吸管，按上项操作依次10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支lmL灭菌吸管。 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择3个稀释度，每个稀释度接种3管。,图7-4 大肠菌群LTSE快速检验法检验程序,食品卫生细菌的检测技术,2预测试验 将待检样品接种于LTSE发酵管内，接种在10mL或10mL以上者，用双料LTSE发酵管，lmL及lmL以下者，用单料LTSE发酵管。预测试验采用9管法，每一稀释度接种3管，置371温箱内，培养15h1h，观察结果，如有混浊并产气者，即表示为阳性管。对阳性管继续做证实试验。 3证实试验 （1）菌液涂片 用直径34mm的接种环挑取菌液23环进行革兰氏染色，镜检。有革兰氏阴性无芽孢杆菌，而杂菌无或者很少。 （2）氧化酶试验 吸取产气管中的培养物约0.5lmL，滴加氧化酶试剂23滴，摇匀，显粉红色或深红色示为氧化酶阳性，不变色或呈试剂的本色为阴性反应。,食品卫生细菌的检测技术,（六）结果判断和报告 如有产气，氧化酶阴性、革兰氏阴性的无芽孢杆菌存在，表示大肠菌群阳性，然后查MPN检查表（见表7-2），计算MPN值。 （七）正确使用LTSE检验方法的说明 1方法的研制与样品考核结果 （1）LTSE法的敏感性与特异性。大肠菌群4个属菌株在LTSE培养基上经37，15h出现结果，采用多种常见的非大肠菌群的菌株检测不酵解乳糖产气，经试验证明本法灵敏度高，特异性强，比常规法节约经费8258%以上。,食品卫生细菌的检测技术,（2）LTSE培养基的各种成分都是经过了很多试验反复摸索研制成功的，其营养丰富，抑制杂菌效果强，具有加快目的菌生长发育和促进发酵缓慢的大肠菌群产酸产气的效果。在证实试验中增加了氧化酶试验反应，具有排除非肠道杆菌对乳糖发酵产气的特殊功能。本方法不必加入指示剂，便于做证实试验。 （3）本方法研制成功后，经不同的卫生监测单位实验考核各类食品样品共计703件，结果与常规法总符合率为99.3；而与美国标准（ANSl）A-1快速法比较,其特异性与敏感性为优。,食品卫生细菌的检测技术,2革兰氏染色的涂片检查说明 本方法加有涂片检查，主要是进一步证实大肠菌群的形态，因本方法的LTSE培养基SDS加的量大，SDS抑制革兰氏阳性菌的效果好且不影响大肠菌群的生长，如果检验人员没有时间，可以省去涂片和镜检这两步，结果其可靠性仍在99以上。 3操作注意事项及经验介绍 （1）检样要严格遵守操作规程，避免技术操作的差错。由于大肠菌群是呈分裂繁殖生长，在水中往往具有聚集性及分布不均匀的现象，因此检样前固体和液体样品如同常规法一样，要经过前处理。,食品卫生细菌的检测技术,（2）培养基灭菌后，童汉氏小管（小倒管）中应无气泡方能使用；做氧化酶试验的小试管要清洁干净。 （3）本方法灵敏度高，3715h培养与常规法符合率基本一致（即99100），超过15h可提高检出率。 （4）初次观察试管法氧化酶试验难以辨别真假阳性结果，可采用氧化酶阳性结果的非肠杆菌科菌株做阳性对照，如绿脓杆菌、脑膜炎双球菌、弧菌科菌株等等。,食品卫生细菌的检测技术,三、TTC（氯化三苯四氮唑）显色快速法 （一）培养基 1 TTC乳糖培养基 （1）2乳糖发酵管 成分： 乳糖20g、蛋白胨20g、蒸馏水1000mL、pH7.4。 制法： 将乳糖、蛋白胨溶解于蒸馏水，调节pH为7.4，分装于含有小倒管的试管中，每管2.5mL，110经15min高压灭菌后备用。 （2）TTC培养液 成分： 蛋白胨20g、氯化钠10g、磷酸钠（Na2HPO412H2O）10g、十二烷基硫酸钠4g、蒸馏水1000mL、pH7.4。,食品卫生细菌的检测技术,制法： 将以上成分加热溶解，调pH7.4，分装于三角瓶，于121经15min灭菌后，冷至室温，备用；临用前加入无菌100g/L的无菌TTC水溶液8mL，轻轻摇匀。 （3）分装 以无菌操作，把TTC培养液分装2乳糖管中，每管加2.5mL，培养后无污染者可使用。 2三料TTC乳糖培养基 除蒸馏水外，其他成分按TTC乳糖培养基3倍，TTC 2倍，制法同上（加入TTC后培养液稍有云雾状混浊，是正常现象，不影响培养结果）。 （二）检验方法 1接种 每份样品以无菌操作接种1mL、0.1mL及0.01mL各3管于TTC乳糖培养基中，如接种量为10mL，则用三料TTC乳糖培养基。 2培养 接种后，置3537温箱培养1824h。,食品卫生细菌的检测技术,（三）结果判断 观察TTC乳糖培养液有无产红色及产气，结果判定如表7-3。表7-3 显色法大肠菌群结果判断,食品卫生细菌的检测技术,（四）结果报告根据阳性管数，查表7-2“大肠菌群最可能数MPN检索表”。 四、DC（去氧胆酸钠）半固体试管快速法（一）培养基1成分蛋白胨 1.5g氯化钠 0.5g乳糖 lgK2HPO43H20 0.3g柠檬酸铁铵 0.2g10去氧胆酸钠水溶液 lmL0.4BTB 1.6mL安氏指示剂 2mL琼脂粉（或琼脂条0.8g） 0.7g 蒸馏水 lOOmLpH 7.2,食品卫生细菌的检测技术,2制法 将以上固体成分加热溶解于水，调整pH7.2，随即加入二组指示剂与10去氧胆酸钠水溶液，最后煮沸3min备用。 （二）检验方法 1样品处理 各类样品的处理与接种量均按国标方法要求进行。 2接种 （1）流体样品 吸取原液3个lmL，分别注入3个灭菌试管内，再吸取110和1100稀释样品各3个lmL，分别加入灭菌试管内，每管lmL。,