【毕业学位论文】（Word原稿）不同基因型肉仔鸡采食量差异及锌作用的机理研究动物营养与饲料科学博士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 博士学位论文 不同基因型肉仔鸡采食量差异 及锌作用的机理研究 on of of of in on of of of in 摘 要 本 论文 研究共设 3 个试验， 旨在研究初生肉仔鸡摄食启动机理 和 不同基因 型 肉仔鸡采食量差异及锌作用的机理。 试验一采用生长快的 和生长慢的北京油鸡为动物模型，研究出壳后 11 天内的卵黄囊耗用规律及血清和下丘脑 的 摄食 调节 因子 的动态变化规律，并进行品种间比较。结果表明，北京油鸡和 在出壳后 11 天内的生长规律基本相同，但前者的 显著低于后者（ P 二 个 品种的卵黄囊营养耗用规律也较为类似，均随日龄增长呈指数方式降低，且与 显著负相关（ P ， 但 北京油鸡的耗用速度快于 。在出壳后前 3 天，北京油鸡和 的卵黄囊瘦素和胰岛素水平均随日龄增长而增加， 且在相同日龄下， 前者的卵黄囊瘦素和胰岛素水平 均 高于后者（ P P 。本试验结果提示，二 个 品种的初生肉仔鸡卵黄囊耗用规律基本一致，均与 显著负相关，但北京油鸡的耗用速度比 的快，部分原因可能是北京油鸡卵黄囊瘦素和胰岛素水平较高所致； 血清和下丘脑 中与 摄食相关 因子 的动态变化 规律因品种和指标不同而异 ， 瘦素、胰岛素 、 雏鸡 摄食启动 过程中发挥一定作用， 但未 能 很好 解释品种间采食量差异 的原因 。 试验二为了进一步研究初生肉仔鸡采食量调节机理及品种间差异机理，主要观测 了 出壳后 2周的下丘脑 瘦素受体（ 、 胰岛素受体（ 、 前阿 黑皮素原（ 的 基因表达的动态变化规律，并进行品种间比较。结果表明，北京油鸡与 的下丘脑 平随日龄 的 变化趋势较为相似。在出壳当天（ 0 日龄）， 下丘脑的表达量较高，高于其他日龄 （ P 在所观测的各个日龄 中 ，下丘脑 平未见品种间 有 显著差异（ P 在 7 日龄 ， 的 下丘脑 平显著高于北京油鸡（ P 本试验结果提示，下丘脑 能介导了瘦素和胰岛素的作用，且其基因表达 分别 受瘦素和胰岛素的负调控； 雏鸡摄食调节系统建立及摄食启动 过程 中 具有 一定作用； 下丘脑 能很好地解释品种间采食量差异 的原因 。 试验三以初生肉仔鸡为动物模型，研究饲粮锌缺乏对摄 食调节因子的影响，探讨锌影响肉仔鸡采食量的作用机理。结果表明，饲粮锌缺乏显著降低（ P P or of Y A a in an Y A in to of in Y in A of in a in of in of be by to R、 in of to of of of R, Y A IR PY in at ), at P no P in R R PY A at P R R a in of by a in of of in of be by R, to of of to of in P 示 90核酸。 （ 15）提取后的质粒可用于序列测定 （上海生工） ，或 准曲线的绘制。 光定量 系的优化（ 300 定量 ） （ 1）模板浓度优化 模板共设置 3 个浓度梯度，每梯度 3 个重复，反应体系如下。 组分 样体积 l) 2 物 F（ 10M/L） 物 R（ 10M/L） .2 .5 2O 体积 15 15 15 反应参数： 50 2 95 1095 15s， 60 140 个循环。 （ 2）引物浓度优化 引物共设置 3 个浓度梯度，每梯度 3 个重复，反应体系如下。 中国农业科学院博士学位论文 附录 74 组分 样体积 l) 2 物 F（ 10M/L） 物 R（ 10M/L） .3 .0 2O 体积 15 15 15 反应参数： 50 2 95 1095 15s， 60 140 个循环。 准曲线的建立 （ 1） 用步骤 取的质粒 按 10 倍的差距作 68 个梯度稀释，作为标准模板，在 300 实时定量仪上反应。每梯度 3 重复。同时，做 3 个无模板空白对照，体系如下： 组分 样体积 l) A B C D E F G H 2 物 F（ 10M/L） 物 R（ 10M/L） .2 .0 2O 体积 15 15 15 15 15 15 15 15 反应参数： 50 2 95 1095 15s， 60 140 个循环。 （ 2）利用 司 7300 的 件建立标准曲线。 3 结果 取的完整性 附 图 1 下 丘脑总 琼脂糖凝胶电泳图 增产物特异性的鉴定 M M M N M 图 2 因的 物 脂糖凝胶电泳图 （ 注： M 代表 标记物 N 代表阴性对照 ） 28S 18S 5S 20050000005000500000050000国农业科学院博士学位论文 附录 75 准曲线 附图 3 标准曲线图 附图 4 融解曲线图 序结果 附图 5 因扩增片段的反向测序结果 中国农业科学院博士学位论文 附录 76 附图 6 因扩增片段的反向测序结果 附图 7 因扩增片段的反向测序结果 中国农业科学院博士学位论文 附录 77 附图 8 因扩增片段的正向测序结果 附图 9 因扩增片段的正向测序结果 中国农业科学院博士学位论文 附录 78 附录二 肉仔鸡下丘脑 性 的 测定方法 1 原理 根据 特异性肽底物 酸化的原理，以 为磷供体检测酶的活性。按照 2005） 提供的方法进行。 2 试剂 自 司； 司； 牛血清白蛋白购自 司。 纸购自 司，其他试剂为进口分装或国产分析纯试剂。 3 溶液的配制 品缓冲液 250 50 10 1 5 1 10 调 存 备用。 使用前加酶： 0， 0， 0，摇匀使用。 应缓冲液 40 0.2 ： 0.2 80 油 ： 8%（ w/v） 0.8 0.8 2 0.2 5 4 保存备用。 注： 32P二天测之前加入 中国农业科学院博士学位论文 附录 79 1l 2.5 32P后加入，因为之前需要做本底对照 1% 磷酸（ 85%） 11.9 酸 + 988.1 2O 定容至 1000 4 操作步骤 分离 称取约 0.1 g 下丘脑，加入预冷样品缓冲液 500 l ，低温匀浆后， 于 4 离心机中 12 000 集上清液置于 保存， 用以 性 及酶液蛋白质含量的测定 。 性测定 取 5 l 下丘脑提取液， 加 应缓冲液 20 l ，在 37 恒温水浴锅中预热 10 应结束时，迅速 吸取 20 l 反应 产物溶液， 滴加在 22 酸纤维离子交换滤纸（ 81） ， 晾干后放入 500 %磷酸中振荡洗涤。用磷酸洗液洗 3 次（ 漂洗时间： 5 ）后 ，用 200 酮洗涤一次（ 漂洗时间： 5 风干后放入闪烁瓶，加入 3 烁液立刻用000液闪计数仪测定。 与此同时，做两种对照：即不加酶源对照（ 品酶液替换为样品缓冲液）和不加 照（不加 合液替换为不含 液），操作同上。 5 结果计算 力单位： 37 条件下，每分钟将 1催化转入 酶量即 1 个单位酶活。 （ V：测定反应液体积， 应液总机体） 测定管 c p m - 本底 比活性 * 反 应 时 间 * 蛋 白 含 量 *V/A M P K 活性 （ n m o l / m i n / g p r o t e i n ） = 反 应 时 间 蛋 白 含 量（ ）比活性 （ c p m / n m o l ） = 样品 c i 数 * 每 c i 3 2 P 的 c p m A T P 的 浓度 * 体积 （ ） 数 每 的的中国农业科学院博士学位论文 致谢 80 致谢 在此论文撰写完成之际，首先我衷心地感谢导师 罗绪刚研究员 在 博士 研究生 四年学习 期间对我无私的关怀和热情的帮助。 本 论文 的 选题、设计、论证 、实施 及成文中倾注了 导师的 大量心血。 罗老师 高深的学术造诣，严谨的治学态度，精益求精的科研精神，锲而不舍的奋斗精神，将永远铭刻于学生心中，并将伴随我以后的人生事业。 本研究为国家 973 项目课题“畜禽摄食调节与营养吸收的生理与分子机理研究”（项目号2004 部分内容，在此特别感谢国家 973 项目的经费支持。 在论文的设计和论证中得到了 南京农业大学 陈杰教授 、 赵茹茜教授 以及本所 苏 琪 副 研究员、 余顺祥研究员和美国北卡罗莱纳州立大学 锡林教授 的指导 ； 中国 农业科学院 食品加工 研究所王斌老师和张元老师在激素放免法测定上 给予了 大力支持和 热情帮助 ； 中国农业大学动物科技学院杨宁教授、中国农业大学农业部饲料工业中心尹靖东老师在分子指标测试上给予大力支持和帮助； 中国农业大学生物技术学院乔惠理教授、中国农业大学动物医学院陈耀星教授在 寻找鸡下丘脑解剖结构上提供了热心帮助 ； 科研处刘素琴老师在论文 开题、答辩 及日常管理方面提供了大力支持。在此对以上各位老师和前辈表示诚挚 敬意和衷心感谢。 在试验执行过程中得到了 课题组的吕林 博士 、刘彬老师、 张铁鹰副研究员、 张丽阳 实研 、刘 洋 实研 以及 家禽遗传育种室陈继兰 副研究员 、李小华老师 的全力支持和帮助。在 动物饲养和屠宰试验中得到 了 微量元素营养室所 有研究生 和凌师傅 的协助。在此对参与试验的各位老师与同学表示诚挚谢意。 在论文的实施 和写作 过程中也得到了同窗好友 黄艳玲博士 生 、 高艳霞博士、 赵峰博士、谢明博士 生 、 李大刚博士、王宗庆博士、张广民博士 的热心帮助，在此向他们表示真心感谢。 论文的完成也离不开我的家人的理解、支持、鼓励与关爱，在此向他们表示诚挚敬意。 感谢所有爱护、关心、帮助和鞭策我的人。在今后的工作中，我也将为更多人提供真诚的帮助，让友爱之情传播！ 中国农业科学院博士学位论文 个人简历 81 个人简历 姓 名： 黄金秀 性 别： 女 出生年月： 1977 年 9 月 出生籍贯： 江西 省 进贤 县 学 历：研究生 教育简历： 1996 年 9 月 2000 年 6 月： 江西 农业大学动物科技学院学习 ,获学士学位 2000 年 9 月 2003 年 6 月： 四川 农 业大学动物 营研究所 学习 ,获硕士学位 2003 年 9 月至今：中国农业科学院研究生院攻读博士学位 发表论著情况： 1. J. X., X. G. L. . ge 2007.（已投稿） 2. 黄金 秀，吕林，张亿一，罗绪刚 . 禽类采食量生理调节因子的研究进展 报 ， 2006，18(: 3533. 黄金秀，罗绪刚，吕林，刘彬 . 不同基因型初生肉仔鸡血清和下丘脑中摄食调节激素的研究