【毕业学位论文】（Word原稿）固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运基因的功能鉴定及表达调控研究生物化学与分子生物学博士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 博士 学位论文 固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运基因的 功能 鉴定 及表达调控研究 on of on of A i 摘 要 斯氏假单胞菌（ 一株分离自我国南方水稻根际土壤的联合固氮菌，具有固氮和分泌植物激素等优良特 性，但由于其碳源供应不足，联合固氮效率不稳定，在农业生 产中的应用潜力受到极大的限制。本研究采用生物信息学、分子生物学 等技术手段，以斯氏假单胞菌 碳二羧酸转运（ 统为研究对象，构建了四碳二羧酸转运调节基因 构基因 突变株和融合表达载体、开展了较为系统的生物学功能和表达调控研究，为通过基因工程途径改造四碳二羧酸转运系统，提高联合固氮效率奠定理论基础。 为研究四碳二羧酸转运相关基因的 生物学功能，首先 构建了 携带功能完整的 因片段、可互补 点突变的广宿主质粒 分恢复了突变株的四碳二羧酸转运和固氮能力。在琥珀酸、延胡索酸或苹果酸为唯一碳源的培养基上， 携带功能完整 质粒 提高野生型菌株固氮活性 采用自杀性质粒 建了 斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运结构基因 极性突变株与非极性突变株， 极性突变株使得其下游的 因失活，突变株均不能利用琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等四碳二羧酸进行生长和固氮作用。 采用插入突变技术构建了斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运结构基因 变 株，在以苹果酸，延胡索酸，琥珀酸等四碳二羧酸为唯一碳源的培养基上突变株不能生长，而野生型生长良好 。固氮酶的结构基因 合表达载体在 极性突变株与非极性突变株 、变株中较野生型菌株中的表达量大大降低，在以琥珀酸、苹果酸或延胡索酸为唯一碳源的培养基上测定的半乳糖苷酶活力最高仅为野生型菌株中的 表明斯氏假单胞菌的 因在四碳二羧酸转运和高效固氮均具有重要作用。 通过功能互补、 融合基因表达等，开展了固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运 建了 因启动区 合基因表达载体，将其分别转入 变株、 54 因子突变株或 变株中，通过测定半乳糖苷酶活性，检测 动子的表达活性，结果表明： 动子为 54 依赖型启动子，其表达需要 因子。葡萄糖抑制 因表达水平，四碳二羧酸诱导 因的表达，苹果酸的诱导水平高于琥珀酸、延胡索酸，表明 因启动子为诱导型启动子。 包含 动子区及完整的 片段的质粒可以互补 突变，而不包含 动子区仅包含 片段，不能互补 突变，表明 用一个启动子。 验结果发现， 变株 1501，仅为野生型表达量的 ，进一步验证了 动子表达需要调节因子 建了 因启动区 合基因表达载体，诱导实验结果表明 低水平组成型表达。 实验结果结合生物信息学分析表明，固氮斯氏假单胞菌的四碳二羧酸转运（ 统 由 两个操纵子构成， 调节基 因， 结构基因。 四碳二羧酸转移酶系由 因编码， 含跨膜区， 跨膜区， 负责四碳二羧酸的跨膜转运 。 跨膜蛋白，感应外界 四碳二羧酸 信号，激活 化的 白与 54 协同 启动 因的表达。 关键词 ：斯氏假单胞菌 因，突变，表达，调控 1501980, on of or of In of to of is In of of of in or as of in of as of of of of of on as of of in in 1501. on as It is to in of of in as to of of 54 of a 54of of of of of of of of a of in is of ct of a 4 4is by 1501. as a 4of 54 of 44of 1501， 录 摘 要 . i . 一章 引言 . 1 碳二羧酸转运载体的研究进展 . 2 菌四碳二羧酸转运载体的分类 . 2 转运载体 . 3 转运载体 . 5 体 . 7 体 . 8 碳二羧酸转运系统在生物固氮过程中的重要作用 . 9 生固氮菌中四碳二羧酸转运系统研究进展 . 10 合固氮菌中 统研究进展 . 13 过对四碳二羧酸转运系统的改造提高固氮菌的固氮水平 . 13 工作的立题依据与研究内容 . 14 第二章 四碳二羧酸转运调控基因 能研究 . 16 验材料 . 16 株和质粒 . 16 . 17 用缓冲溶液 . 18 用溶液 . 18 白电泳溶液 . 19 剂 . 20 验方法 . 20 裂解法提取质粒 . 20 段的回收与纯化 . 21 体和目标片段的连接 . 21 受态细胞的制备 . 21 接产物转化感受态细胞 . 22 粒的接合转移 . 22 组质粒的 测 . 23 株生长曲线的测定 . 23 株固氮活性测定 . 24 白含量的测定 . 24 核表达载体的构建及诱导表达 . 24 白质 丙烯酰胺凝胶电泳 . 26 果与讨论 . 27 结构域分析 . 27 因表达载体的构建 . 27 建携带固氮斯 氏假单胞菌 因的质粒 . 28 变对 用四碳二羧酸能力的影响 . 30 因对菌株固氮活性的影响 . 32 v 第三章 四碳二羧酸转运结构基因 功能研究 . 34 料与方法 . 34 株和质粒 . 34 入突变株的构建方法 . 34 性与非极性突变株的构建 . 35 提取 . 37 增反应 . 37 克隆 . 39 性突变体 段与非极性突变体 段的克隆 . 40 构建 . 40 . 41 接产物转化感受态细胞 . 41 变株对四碳二羧酸利用的测定 . 41 果与分析 . 42 入突变株的构建 . 42 变株 生长特性的测定 . 44 变株的构建 . 46 变株对四碳二羧酸的利用情况 . 50 变株固氮酶活性的测定 . 51 论 . 52 第四章 因的表达调控的研究 . 54 料和方法 . 54 株和质粒 . 54 菌培养 . 54 剂 . 54 物 . 55 性的测定 . 56 提 . 56 一链合成 . 57 的基因扩增 . 57 果与分析 . 58 变株的互补实验 . 61 氮斯氏假单胞菌 合基因的构建 . 66 氮斯氏假单胞菌 合基因的构建 . 69 论 . 72 第五章 结论 . 75 参考文献 . 76 附录 . 85 致谢 . 89 中国农业科学院博士学位论文 引言 1 第一章 引言 氮素是限制农业生产的最重要的营养元素之一。世界农业对氮的需求平均每年增加 2%。化肥的施用虽然对农业生产的提高做出了巨大的贡献，但其过量施用产生硝酸盐和亚硝酸 盐，污染地下水，进而对人体健康造成威胁，同时还造成土壤板结，肥力下降。尽管自然界中只有部分原核生物能够固氮，但生物固氮有效地维持了生物圈内的氮素平衡。地球上结合态氮总量的 70%来源于生物固氮作用，据国际权威机构估计（ 1995），每年全球通过微生物固定的氮素总量可达 2 亿吨，约占全球作物需氮量的四分之三，相当于工业生产氮肥的三倍多，可见其在减少化肥施用、缓解环境污染、提高农作物产量等方面具有极大的潜力。 根据固氮菌与植物之间的关系，通常可以将生物固氮分为自生固氮、共生固氮和联合固氮三种类型。研究最深入的 是自生固氮菌，迄今为止，有多种自生固氮菌的固氮基因组成已基本清楚，其中包括 固氮分子调控方面的研究，以 K. 为深入，该菌早在二十世纪七十年代就已经成为生物固氮调控研究的模式菌株 (S. 1971)。对共生固氮菌的研究自荷兰的 1988）从豆科植物分离出根瘤菌以来已有 100 多年的历史，在根瘤菌的形态学、生理学、生态学、生物化学、遗传学取得了重要进展，近年来在共生固氮基因的定位、调控及与豆科植物的相互作用等方面取得了许多新的进展（黄大昉等， 2001）。在共生固氮菌中， 苜蓿根瘤菌） 生型大豆根瘤菌）和 菁固氮根瘤菌）等三种 共生固氮菌的固氮基因组成及固氮调节机制研究得较多（ 994）。联合固氮菌存在于禾本科作物和牧草等植物的根际，并定植于植物的根际，但不与植物形成类似根瘤的特异化结构，其中包括杆菌属）、 氮弧菌属）、 氮螺菌属）、 氮菌属）、 杆菌属）、 螺菌属）、 氏杆菌属）单胞菌属）等（ 989， et 1987， et 1990，et 999）。在众多的联合固氮菌中，目前国内外以巴西固氮螺菌（ 斯氏假单胞菌（ 原命名粪产碱菌）、阴沟肠杆菌（ 研究的较为深入（黄大昉等， 2001，林敏等， 1989，平淑珍等， 2000，陈明等， 1999，江群益等， 1990）。涉及的基因有 固氮酶结构基因和氮代谢调控基因，四碳二羧酸运输基因 氢酶基因 。 近年来，以联合固氮为主的非共生固氮研究越来越受到各国政府和科学家的重视。联合固氮菌广泛分布于粮食作物如水稻、小麦、玉米以及各种水果蔬菜植物的根际，作为一种潜在的生物肥源具有固氮和分泌植物激素等诸多重要的生物学特性。联合固氮菌主要结合于植物根表，不形成类似根瘤的特异化结构，与共生固氮体系相比，其固氮活性受外界环境因素影响较大，联合固氮效率普遍较低，实际接种效果不稳定，极大 地限制其在农业生产中的推广应用。 众所周知，生物固氮是一个非常耗能的过程，在最理想的条件下固氮酶将 原为 要 16 个 在自然条件下则更高。生物固氮过程极其复杂多样，涉及到能量物质转运系统、固氮酶合成和表达调节等分子机制，特别是对于生态分布广泛而固氮效率低下的联合固氮微中国农业科学院博士学位论文 引言 2 生物，研究其生物固氮机制，提高其联合固氮效率，既具有实际应用价值，同时又具有重大的理论意义。 碳二羧酸转运载体的研究进展 四碳二羧酸是细菌重要的碳源与能源物质，四碳二羧酸包括琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和天门冬氨酸（四 碳二羧基氨基酸）等，它们可以在有氧和无氧条件下被细菌代谢产能。在有氧条件下，这些基质作为碳源与能源通过柠檬酸循环被氧化为二氧化碳。这一代谢过程需要四碳二羧酸向内转运系统的参与。在某些代谢过程中，作为代谢终产物的四碳二羧酸必须被排出胞外，这一过程同样需要四碳二羧酸转运载体的参与（ , . 1997）。 在厌氧条件下的能量代谢过程中，由于缺少柠檬酸循环，琥珀酸不能参与能量代谢，仅有其它的几种四碳二羧酸能够参与能量代谢。延胡索酸在延胡索酸呼吸产生能量的过程中作为电子受体，而苹果酸 与天门冬氨酸可以通过脱水和脱氨基等途径转化为延胡索酸 ,然后在延胡索酸呼吸产生能量的过程中作为电子受体（ et 2002 ； R et 2002 ）。延胡索酸呼吸过程中产生的代谢终产物琥珀酸则需要通过与延胡索酸、苹果酸、天门冬氨酸的反向运输排泄至胞外。 其它一些细菌可以通过细胞间质中的一些酶将延胡索酸还原，而不需要延胡索酸的由膜外向膜内的转运系统（ J et 1994）。在很多发酵过程中，琥珀酸来源于糖类。琥珀酸不 能进一步代谢而被排出胞外（ A, et 1990），在肠杆菌的混合酸发酵过程中每摩尔的葡萄糖可以产生 尔的琥珀酸，在 柠檬酸发酵过程中琥珀酸作为最终产物而被柠檬酸与琥珀酸的反向运输排出胞外（ , et 1980； , 1997）。 大量厌氧细菌的生长以四碳二羧酸的脱羧基作为能量来源， 生长需要以琥珀酸脱羧转变为丙酸盐的过程提供能量，并且需要琥珀酸与丙酸盐的反向运输系统。在苹果酸乳酸发酵过 程中，乳酸细菌脱去苹果酸的羧基，并通过乳酸与苹果酸反向运输系统，将乳酸排出胞外（ , 1998, ,et 1991）。 在真核细胞的叶绿体与线粒体中发现了不同的四碳二羧酸载体蛋白，由于其可以作为碳和氢的转运载体而将线粒体的三羧酸循环和细胞质的糖酵解、糖的异生、乙醛酸循环联系了起来，例如酵母在乙醇和乙酸上生长需要琥珀酸和柠檬酸的反向运输（ , 1994）。 细菌中存在大量不同的四碳二羧酸载体蛋白，这些不同的四碳二羧酸载体需要完成大量不同的功能，并且 催化四碳二羧酸与 H ， 的同向转运和同质、异质逆转运，许多细菌具有一种以上的四碳二羧酸转运载体。 菌四碳二羧酸转运载体的分类 细菌的四碳二羧酸载体可以依据蛋白序列的相似性分为五类，四碳二羧酸转运蛋白 膜外向膜内转运四碳二羧酸的载体 不依赖 三组分周质转运载体蛋白（ 大部分载体可以以四碳二羧酸（琥珀酸，延胡索酸，苹果酸）和天门冬氨酸作为转运基质，但是由于四碳二羧酸的种类不同，其 也不尽相同。 好氧与兼性厌氧细菌中存在大量的 白家族的成员，它们是在有氧情况下催化向内转运四碳二羧酸的载体。 族是四碳二羧酸与离子同向转运载体蛋白家族，在细菌，古菌和中国农业科学院博士学位论文 引言 3 真核细胞中都有发现，它可以催化 H 和 与四碳二羧酸的同向转运。革兰氏阴性菌中与高 的 体，构成了 白家族的几个亚类（ T, et 998 1998）。从低 量的革兰氏阳性细菌 得到 革兰氏阴性细菌中的 K.,2000）， 的 其他细菌的 缘关系很远（ S. J. et 999, O. K, 1989, C. W., 1984）。 体仅存在于进行延胡索酸呼吸的厌氧与兼性厌氧细菌中，他们组成了一类独立的蛋白家族（ et 1996,S et 1994, et 999, et 2000 ）。 同源蛋白，其相似性为 36， 体蛋白具有进行膜内外交换，向内转运四碳二羧酸的功能，具推测也具有由膜内向膜外运输四碳二羧酸的功能。 白家族被分为 个亚类。根据 变株的研究推测 转运功能相似（ .,et 994）。 相似性仅有 22 24（ 998）， 具有的功能与 体类似，即在厌氧条件下具有进行膜内外交换，向膜内