【毕业学位论文】（Word原稿）Pokemon 蛋白在肾癌中的表达及临床意义shRNA干扰Pokemon 基因对肾癌细胞增殖及凋亡的影响

前言 肾癌 （ 是常见的泌尿系恶性肿瘤 ， 其发病率在泌尿外科肿瘤中占第二位 ， 占成人恶性肿瘤的 （ 2%， 在泌尿系所有的肿瘤中是最致命的。流行病学资料显示，肾癌的病死率为 40%，而膀胱癌和前列腺癌的病死率仅为 20%1。早期发现、早期根治性肾癌切除手术是提高肾细胞癌生存率的关键 2，但是约 20%的病人首次就诊时就已经发生转移 3，其五年生存率低于10%。目前肾癌的主要治疗方法是外科手术，其对放、化疗不敏感，免疫疗法也成为手术治疗以外的重要方法。晚期肾癌主要 手段仍然是 其有效率低，没有延长存活时间 4， 独用于治疗转移性肾癌时，有效率约为 10%5。 因此，对肾癌的早期诊断、预后判断、探索新的治疗的方法势在必行。 目前观点认为肿瘤产生的本质 是 细胞增殖的调节失控 ,如何控制关键细胞调控路径可能为肿瘤的治疗提供新途径。肾癌的发展过程是为多基因参与，癌基因的激活与抑癌基因的失活是其发生、演进的重要机制。 于 族成员，研究表明在多种实体肿瘤中高表达，而缺乏该基因的细胞对致癌转化不应答 6。原癌基因 是抑癌基因 心调节因子，该基因参与细胞基因转录的调节，细胞分化及肿瘤细胞的周期调控过程 , 与肿瘤的增殖有关 7。目前已在人类多种肿瘤的研究中发现了 能控制其他癌基因的活性，促进癌瘤发生 6。近年来 于其具有高度的序列专一性和高效性，可以特异地使目的基因沉默，产生类似于基因敲除的效果 8 稳定性、可遗传性、快速性及浓度依赖性等特点，应用于基因功能研究，而应用 组质粒可在哺乳动物细胞内长期、稳定抑制目的基因的表达 11, 12。一般说来， 展中起重要作用的基因，因而可以达到治疗肿瘤的目的。 研究证实多种肿瘤例如肝癌、乳腺癌、恶性胶质瘤、胰腺癌中 因此，本实验运用免疫组织化学 良性肿瘤组织及肾癌肾组织中 讨 而为肾癌的诊 断、治疗以及预后评估提供临床参考。应用 转染 观测其对肾癌 深入探讨 而为肾癌的诊断、治疗以及预后评估提供临床参考。 第一章实验材料 床标本 本研究选用标本来源于 2009年 3月 月年兰州大学第二附属医院住院手术患者，经后 4例，其中男 34 例， 女 30 例，年龄范围 27，平均 55 岁。肾细胞癌病理分型为透明细胞癌 45例，乳头状腺癌 8例，嫌色细胞癌 11例，组织学分级： 0例， 9例， 5例，根据 期： +期 38例， +期 26例；有淋巴结转移的 29例，未发现淋巴结转移 35例；选取 10 例癌旁肾组织 (距肿瘤边缘 3 外 )，另20例为肾良性肿瘤组织。患者术前均未进行化学治疗、放射治疗或免疫治疗 。 要试剂 抗人多克隆抗体 （ 北京博奥森生物技术有限公司 疫组化通用试剂盒 北京中衫金桥公司 原修复液 北京中山公司 色剂 北京中衫金桥公司 磷酸盐缓冲液 (上海化学试剂公司 柠檬酸型抗原修复缓冲液 福州迈新生物技术开发公司 合酶、限制性内切酶、 接酶 司 质粒小量提取试剂盒 北京博大泰克公司 凝胶回收试剂盒 美国 司 胰酶 生工生物工程上海有限公司 胎牛血清 四季青生物公司 养液 四季青生物公司 州联创公司 国 司 剂 生工生物工程上海有限公司 逆转录试剂盒 司 2） 试剂盒 生工生物工程上海有限公司 兰州联创公司 染色试剂盒 深圳晶美公司 种、质粒、细胞株 (1) 是一种经诱变的菌株，其基本特性是： 可用于制作基因库、进行亚克隆， 由兰州大学第二附属医院泌尿外科研究所提供 。 (2) 粒：具有 切位点（图 1干扰序列加在 间（图 1 由兰州大学第二附属医院泌尿外科研究所提供 。 图 1体示意图 图 13) 胞株：人肾癌细胞，具有肿瘤恶性增殖的特点， 由兰州大学第二附属医院泌尿外科研究所提供 。 要仪器 温冰柜 青岛海尔公司 温冰箱 青岛海尔公司 子分析天平 司 超净工作台 北京长城工程公司 美国 司 泳仪 北京六一公司 00 电泳凝胶定量分析系统 美国 司 光倒置显微镜 日本奥林巴斯公司 恒温培养箱 美国 司 水平摇床 常州市华普达仪器有限公司 高速电动离心机 珠海黑马有限公司 冷冻离心机 德国 司 细胞培养瓶和培养皿 兰州联创公司 温培养箱 美国 司 光定量 司 流式细胞仪 剂配制方法 疫组织化学试剂配制 (1) 冲液 ： 8g 馏水定容至 1L， 调节溶液 高压灭菌 30常温保存。 (2)5 10 0 (3)4多聚甲醛固定液： 250 聚甲醛 10g 1255 75 混合后加热至 60，搅拌并滴加 5 清亮为止，冷却后加 50固定时间 24小时 ） 。 (4)木素染液 ： 500 苏木素 入 25水乙醇 中 搅拌溶解 （ A 液），将 22g 硫酸铝 加入 500离子水加热煮沸熔化后 （ B 液）， 液混合 ， 去火 后搅拌溶液，只91 时，缓慢 加入氧化汞 继续搅拌至看不见黄色，将烧瓶迅速置于冰水中，用纱布盖住瓶口，次日将溶液过滤，加入柠檬酸 2g。 (5)1 闭液 ： 50 50 质粒构建试剂的配制 (1)3琼脂糖凝胶： 琼脂糖， 3g 10 100波炉加热至溶化，冷却至 55左右加入 5 L 酸染料 )，轻轻摇匀，铺胶。 (2)体培养基： 150化钠 蛋白胨 母菌提取物 于 120中，搅拌使其完全溶解，用 1 去离子水定容至 150温湿热灭菌， 4保存。 (3)体培养基 体培养基 150脂粉 温湿热灭菌 , 4保存。 (4)氨苄青霉素 （ 50 g/ 10 苄青霉素 菌水 10 用 装 ,保存备用。 胞培养试剂配制 (1) 青 青霉素 100万单位 链霉素 1g 溶于 100瓶分装，最终浓度为青霉素 霉素100g /存。 (2) s 液： 红 离子水 定溶至 1000调 74， 盐水瓶分装 ， 高压灭菌 304保存。 (3)10%胎牛血清 全培养基 养液 89牛血清 10 1用前配制， 4保存。 (3) 蛋白酶 胰蛋白酶 s 液 100拌均匀，室温或 4过夜，用 2 4保存。 (5) 液 100拌 20滤器过滤除菌，分装，密封后置 4冰箱避光保存备用。 第二章实验方法 肾癌组织中的表达 所有 标本均经 4%甲醛固定，石蜡包埋常规脱水， 4 m 连续切片连续切片 2 张，一张行常规 色，另一张行 疫组化染色。免疫组化按 阳性对照和阴性对照，以试剂盒 自带的阳性片免疫组化染色结果为阳性对照，以 代第一抗体的肾癌组织免疫组化染色结果为阴性对照。 备蜡块 (1) 标本固定：手术 标本浸入 4%多聚甲醛固定 （ 12； (2) 冲洗脱水：流水冲洗，放入酒精中， 经梯度酒精（ 75%、 85%、 95%、无水乙醇 ）脱水； (3) 透明：标本放入纯酒精和二甲苯的混合液中浸泡（ 1转入纯二甲苯中（根据取材大小而定具体时间）； (4) 浸蜡包埋：将材料放入融化的石蜡和二甲苯混合液中 (2h)，再依次放入 2个融化的石蜡液中 (3h),浸蜡后的材料放进装有蜡液的容器中，表层凝固后即 迅速放入冷水中冷却。 片 腊块修剪呈 长方块，夹入切片机的蜡块钳内，固定、旋紧以 4 60烘烤过夜，室温干燥，无尘处保存。 E 染色 (1) 切片放入二甲苯中脱蜡（ 5 (2) 放入 1： 1二甲苯和纯酒精混合液中（ 5 (3) 分别放入 100、 95、 85、 70%的酒精（各 2过蒸馏水后转入染液； (4) 苏木素精染液染色（ 5 (5) 玻片上多余的染用 过蒸馏水 去除 ， 酸酒精分色，显微镜检查控制， 到细胞核及核内染色质清晰为止； (6) 流水冲洗 15者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或篮化，即细胞核呈现蓝色 ,再次通过蒸馏水冲洗； (7) 红染液染色约 5 (8) 顺序通过 70%、 85、 95、 100酒精脱水，分别约 2 (9) 二甲苯透明 (两次 )，共约 10 (10) 擦去切片周围多余的二甲苯，快速滴加适量中性树胶，加盖玻片封固； (11) 光镜观察染色玻片切片组织的病理学改变。 疫组化染色步骤 (1) 常规脱腊、水化组织切片 。 (2) 柠檬酸高压修复 20却， 洗， 23次。 (3) 3 断内源 性过氧化物酶， 洗 3次，每次2 (4) 滴加一抗（ 1： 100），湿盒 4度冰箱过夜， 洗， 3次，每次 2 (5) 滴加 体 聚体）， 37度孵育 30洗 3次，每次 2 (6) 滴加新配制 色液，显色 2来水充分冲洗。 (7) 复染，脱水，透明。 (8) 取出片子，滴加中性树胶，封片，干燥，镜检。 果判断 性表达的判断：采用半定量计分法判定 13,按阳性细胞比例及染色深浅 度 分别记 0 - 4 分：在 5个高倍视野下，中阳性细胞 75 %记 4 分；按染色深浅分别记 0色深度以多数细胞为准，无阳性细胞记 0 分，黄色记 1 分，棕黄色记 2 分，棕褐色记 3 分；免疫反应的得分为阳性细胞的百分率得分与免疫染色的强度得分的乘积 ,再按这两项指标的总积分将结果分成 4级： 0 分为 ( - ) ， 1为 ( + ) ， 3为 ( + + ) ， 5 12分为 ( + + + ) 。其中 ( - ) 和 ( + ) 为低表达、 ( + + ) 和 ( + + + ) 为高表达。 计学方法 所得数据采用 件进行统计分析，计数资料以率表示，进行 2检验，检验水准 = 组质粒的构建 扰序列设计 选择 公布的 因序列 (序列号 : 15898) , 遵循 计原则 ，通过在线专业软件，分析并选取为干扰序列 ,用 分析对比所选择的序列，证明该序列与人类其它基因序列没有同源性。同时实验中阴性对照序 （图 2构建阴性对照质粒。 图 2阴性对照序 列合成 根据 扰序列 成两条链，由英潍捷基（上海）贸易有限公司引物合成。 将上述序列与 粒 重组，转染细胞后可以形成发夹结构 （图 2 图 2夹结构示意图 链目的基因磷酸化和退火 1l 1l 100 10 2l 10 2l 去离子水 50l 37 水浴 3095 2缓慢冷却至室温 ， 储存于 。 粒酶切及回收 粒 10 L 1 5 L 10u/L ） 2 L 10u/L ） 2 L 无菌水 31 L 50 L 混匀， 37水浴 3h,进行 脂糖凝胶 电泳 鉴定。紫外灯下 用小刀 切取 目的 胶条进行回收并纯化，具体操作步骤如下： (1) 用 1 制 脂糖凝胶，制胶； (2) 将扩增产物 进行 电泳 40将凝胶小心放到紫外灯下 ， 用刀片从琼脂糖凝胶中切取目的 段，将胶块 放入 的无菌 中，称重； (3) 切碎胶块， 加入胶块融化液 匀混合后 75 加热融化（期间间断振荡混合，约 6 (4) 加入 的 1/2体积量的 匀； (5) 将上述溶液移到吸附柱内， 12000 心 1 废液（如将滤液重新离心 1次，可提高 (6) 将 500 L 加入吸附柱内， 12000 心 30s,弃废液； (7) 将 700 L 加入吸附柱内， 12000 心 30s,弃废液； (8) 重复上一步； (9) 空管 12000 心 1 (10) 将吸附柱置于新的 25 L 的灭菌蒸馏水或 温静置 112000 心 1把蒸馏水或 热至 60，有助于提高洗脱效率） ， 保存。 性质粒 退火片段的连接 线性质粒 稀释退火片段 10 1L 接酶 2L 去离子 2 L 10 16水浴，反应 2h， 保存。 备感受态细菌 (1) 用接种针挑取 种，划线于 养平板上（不含抗生素）， 37过夜培养； (2) 恒温培养 2，挑取单克隆菌落于 5B 培养基中 (不含抗生素 )， 37、250 (3) 将 100 B 培养基中 (不含抗生素 )，培养过夜； (4) 4000上清 ，回收细胞 ； (5) 将 10），从新悬浮菌体，冰浴 30 (6) 菌液 4000心 104 ，弃上清 ； (7) 放置于 4 冰箱过夜，可用于转化，多余菌体 存备用。 化感受态 (1) 融化 1 支 受态细胞（ 100 L），冰浴 10净台上缓慢将质粒溶液（ 10 L）加入，轻轻混匀， 4冰浴 30 (2) (2)42水浴中热激 2止），迅速冰浴 1 (3) 将细胞冷却 1 入 体培养基， 37混匀， 200荡培养 1 2 h； (4) (4)4000 适量 (5) 取 50L 转化 菌液涂布于 板（含抗生素）上， 37 恒温箱培养过夜。 组质粒的筛选及提取 (1) 挑取每个培养皿单克隆菌落接种于 20B 培养液 (含抗生素 )中， 37恒温摇床（ 250 r/h）培养过夜； (2) 收集 28000上清； (3) 加入 250 L ），彻底悬浮沉淀； (4) 加入 250 L 和颠倒 5，使菌体充分裂解； (5) 加入 350 L 即颠倒 5混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000 心 6上清转移至吸附柱中，室温放置 1120000 (6) 弃废液，像吸附柱中加入 500 90000s； (7) 空管 9000心 1将速度加大，并延长时间 ） ； (8) 将吸附柱置于新的 上，加入 100 L 洗脱液 ，室温静置 1-2 2000 存备用。 列测定 将 质粒菌液送 英潍捷基（上海）贸易有限公司 进行测序， 用 析测序结果， 验证质粒是否重组正确。测序正确的质粒菌液存储 于 用。 2.3 组质粒对 胞中 作用 胞培养 胞采用含 10%灭活胎牛血清的 全培养液培养，细胞为贴壁生长细胞。按 l:3传代 ， 传代时用 蛋白酶消化细胞 ， 消化完全的细胞，弃去多余部分，在培养瓶中 加入培养液后在 37、 5%和湿度的恒温培养箱中培养。 胞转染 根据需要将 胞分为重组质粒组 、 阴性对照组 和 空白对照组 ，对各组细胞分别相应的处理，进行细胞转染。 (1) 在转染前一天，取处于对数生长期细胞 ，以 洗涤细胞， 酶消化使培养瓶内细胞离壁，将细胞重悬至 全培养基中，接种6孔板中（ 2 105/个）。待细胞生长状态稳定，融合度达 80% 90%时，更换 无血清 无抗生素的 养液继续培养 2 (2) A 液： 50 L 养液、 4 匀、静置 5 (3) B 液： 50 L 养液、 0 L，室温避光 5 (4) A、 B 两液混合，轻轻混匀，室 温放置 20 用； (5) 弃原培养基，用无血清无抗生素的培养基孵育细胞 2h，后弃培养液，加入 37、 5%和湿度条件下培养 6小时后 , 弃去 无血清培养基 ，加入 全 培养基， 24 胞形态的变化 。 胞形态学观察 在培养状态下 组质粒 转染 胞 48 h 后，倒置显微镜 下观察细胞生长状态及形态学改变， 同时可在荧光镜下观察 到转染成功的细胞呈 绿色荧光 并计算转染效率。首先在普 通显微镜 下计数视野中的细胞总数，然后转换至 荧光镜下计数绿色荧光细胞数。随机抽取 5个视野，计算转染效率（ 转染效率 =荧光细胞数 /细胞总数 100%），根据转染效率以确定质粒的最佳转染时间及质粒与脂质体最佳用量比例 。 胞总 提取 (1) 胞转染后 48 小时，将六孔板中的 养液吸去，加入 1剂，反复吹打液体几次，室温放置 5 (2) 将液体全部吸入无 的离心管中，加入 仿，剧烈摇动 30s，室温放置 5 (3) 4、 12000心 15取上层水相至另一离心管中，加入 匀，室温放置 10 (4) 4、 12000心 10上清； (5) 加入 75%的乙醇 1匀， 4， 7500心 5上清，室温放置5底有白色沉淀，即为总 总 去 水中 (溶解 )； (6) 用 量仪测定 浓度和纯度，一般 80在 示 存备用。 成 反应体系 1 l 8 1 l 0 l 2 l 混匀，稍离心， 65 5即冰水浴 1离心，收集管底。 反应体系 2 冰上操作 4 l 20u/l） 1 l 10mM l 200u) 1 l 0 l 混匀，稍离心， 42 6070 5存。 物设计 引物的设计与合成：用 件设计设计出内参基因 目的基因 引物序列，由生工生物工程上海有限公司合成。 上游 : 5 下游 : 5 3 上游 : 5 3 下 游 : 5 3 应 2） 10 l 10 l 上游引物 (2001 l 1 l 下游引物 (2001 l 1 l 板 2 l 2 l 2O 6 l 6 l 0 l 20 l 混匀，瞬时离心。 反应条件： 95、 预变性 10 s； 95、 变性 15s； 60退火 30s, 60延伸 30s,共进行 40个循环。 存。 据分析设置 将 重组质粒组 、 阴性对照组 和 空白对照组 每组 设立 3个平行管 ,在 000荧光定量 进行 反应 ，各组 设置 扩增及 熔解曲线分析。反应完成后 ,根据 应曲线得到 t 值 （ 值循环数 ) ，采用 用转染阴性重组质粒的样品作为对照，比较各重组质粒 组样品目的基因的表达， 按照公式可计算出每组重组质粒 的抑制率 。 分析细胞增殖 取对数生长期的重组质粒组、阴性对照质粒组及脂质体空白对照组的三组 105个细胞 /孔接种于 96孔板内，每组 设 6个平行孔。分别于接种后 24h、 48h、 72h、 965mg/20l ， 37 孵 育 4弃上清 ,加入 甲基亚砜） 150l ,振荡 10结晶物充分溶解，然后用酶标仪测定 时间 (h)为横坐标绘制生长曲线，并计算细胞的生长抑制率。 细胞生长抑制率 = (阴性对照组 转染组 A 值 )/阴性对照组 A 值 100%。 式细胞仪分析细胞凋亡 集转染 48阴性对照质粒组及脂质体空白对照组的 2 105个细胞 /孔接种于 6孔板内 ，胰酶消化后收集细胞， 冷 次后 ,重悬于 分别加入 5 l 4避光孵育 5机进行检测，以各组中凋亡细胞占总计数细胞的百分比计算凋亡率。 计学分析 应用 计软件 对实验结果处理， 实验结果以（ x s）表示 , 采用检验进行统计学处理 ,多组样本比较用单因素方差分析，以 P 0. 05（表 3。 图 3白免疫组织化学染色结果 A：在肾良性肿瘤中的表达（ 200）； B： 1 级中的表达（ 200）； C： 2 级中的表达（ 400）； D： 3级中的表达（ 400）。 表 3不同组织 达情况 A B C D 组织类型 n 2 P 高表达（） 低表达（） 肾细胞癌 64 46（ 18（ 癌旁组织 10 3（ 30） 7（ 70） 良性肿瘤组织 20 7（ 35） 13（ 75） 白在肾癌中的表达与临床病理学指标的关系 组织 分级为低分化组 高于 高、 中分化组 ( P 0. 05 )，肾癌中 白高表达与 其它因素 无明显相关性（ P 0. 05 ） （表 3。 表 3肾癌 白高表达与临床病理学指标的关系 临床病理特征 n 高表达 率（） 2 P 高表达 低表达 性别 男 34 26 8 30 20 10 年龄（岁） 50（岁） 25 19 6 50 39 27 12 组织分级 高分化（ 20 13 7 分化（ 29 19 10 低分化（ 15 14 1 病理类型 透明细胞癌 45 32 13 头状腺癌 8 6 2 嫌色细胞癌 11 8 3 +期 38 25 13 +期 26 21 5 淋巴结转移 有 29 19 10 35 27 8 3.2 组质粒对 胞中 抑制作用 组质粒的鉴定 测序结果显示 , 所插入的重组质粒片段正确的连入 证实 3 图 3重组质粒测序图 染后细胞的镜下观察 转染后 24细胞呈绿色荧光阳性 ,通过计数同一视野普通光和荧光下的细胞个数 , 计算转染效率；图 3分别为转染 24转染效率为 42%。图 3分别为转染 48置显微镜下观察可见转染 与对照组的细胞在形态上具有显著差异。 图 3转染 24 小时后 200） A：对照组； B：重组质粒组 A B 图 3转染 48200） A：对照组 B：重组质粒组 组质粒对 达的抑制 实时荧光定量 8h 表达 ,图 9和图10分别为 可见每组样品的 熔解曲线也未见杂峰 ,表明引物的特异性较高。采用 按照公式可计算出每组重组质粒 的抑制率 。 相对定量分析结果显示 因表达有明显的抑制作用 ,转染后 485. 8%(图 3,与阴性对照组相比 ,差异有显著的统计学意义 (P 0. 05) 。 图 3实时荧光定量 增与溶解曲线 A:扩增曲线 B：溶解曲线 A B A B 组质粒对细胞生长活性的影响 阴性对照组及 空白对照组相比，重组质粒组比对照组细胞的生长速度明显降低，重组质粒组能够显著抑制 阴性对照组及空白组的细胞生长活性之间无明显差异 (图 3 小时（ h ）24 48 72 9690 . 0空白 对照 组阴 性 对 照 组重 组质 粒 组图 3转染 组质粒对细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测细胞结果显示：阴性对照质粒组和脂质体空白对照组早期凋亡率分别为： ；而重组质粒组 表 3。表明 促进细胞凋亡（ 图 3 表 3三组细胞的凋亡率 分组 早期凋亡率（ %） 空白对照组 阴性对照组 组质粒组 ：与重组质粒组相比较， P 0. 05。 图 3流式细胞仪检测细胞凋亡 A：空白对照组 B：阴性对照组 C：重组质粒组 A B C 第四章结论 要结论 (1) 且 与肿瘤组织分级有关 ； (2) 成功构建 转染 肾癌细胞株 (3) 促进 肾癌细胞株 殖及抑制 凋亡 的作用，对 肿瘤基因治疗以 论 原癌基因 13，定位于人类第 19号染色体短臂 1区 3带中的第 3亚带（ 为 括氨基末端的 蛋白作用域，介导异源或同源二聚体的形成，是蛋白招募联合抑制组蛋白乙酰酶复合物；羧基末端的锌指结构可以特异介导其与 通过后续染色体重构以及补充组蛋白脱乙酰酶起到强力转录阻遏作用 14, 15。由于 化和肿瘤形成中有着重要的作用。 肿瘤的发生密切相关。经研究证实，展与分化中起重要的作用。 过特异性抑制抑癌基因 肿瘤发生中发挥 作用 16。关键的抑癌基因。因此上调） 调） 强） 调 )肿瘤发生。 时抑制 类中与鼠 源蛋白）和细胞周期阻滞 因子 下简称为 转录。 为 过限制 节 表达从而影响到 因更强 17。 效抑制在细胞周期阻滞中起重要作用的肿瘤抑制 因子 因的转录 18。 1（ 相互作用， 肪酸合成酶 )的主要调节基因，而19,进而合成足够的磷脂，使肿瘤细胞的恶性扩增成为可能。 亡的能力，更重要的是它能够通过分子网络机制控制其他癌基因或抑癌基因的活性，这是其他癌基因所不具备的特性，也是 以 20。由于 肿瘤的发生、发展和转移是一个多基因参与的过程，癌基因的激活，蛋白的过表达等是肿瘤发生、发展、转移的重要机制，在体内外实验中已证实 然 它与肿瘤的临床病理学指标是否具有相关性？ 如果利用 能否有助于逆转肿瘤细胞的恶性转化或疾病的发生和发展进程 ? 研究发现， 乳腺、结肠、肺和肝组织的癌变过程密切相关，良 性与恶性组织中 因 蛋白的表达量有明显差异 21。同时， 22研究表明 其基因扩增并不显著， 23 对 55例非小细胞肺癌（ 肿瘤组织、癌旁组织和正常组织中 现 与癌旁组织和正常组织中的表达相比较差异有统计学意义， 和病人的性别、年龄、吸烟史、肿瘤分化程