【毕业学位论文】（Word原稿）少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究

兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 1 前言 随着人们生活水平的 提高，人们对生命质量和长寿的渴望日趋强烈， 而单纯依靠化学药品是难以满足人们的这些追求的。 中药是中国医药学宝库中的一颗明珠，为中华民族的健康和繁衍做出了巨大贡献。为了保证中药的安全性和有效性，数千年以来，中药一直处于不断标准化、规范化的进程中。 建立对中药的质量控制体系必须立足于中药的特色 ， 中药的质量控制方法 必须能对起效的全成分（有机成分、无机成分和络合物成分）进行控制 ， 只有这样，所建立的质量控制体系才能真正达到控制中药质量、保证中药用药安全有效的目的。 色谱指纹图谱分析是一种 可行的质量 控制模式，它可为中药材和中成药提供综合的、宏观的和可量化的质量评价。 目前在国际上，美国食品药品管理局、英国草药典、印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会均接受指纹图谱的质量控制方法，这表明指纹图谱己成为国际公认的控制中成药、天然药物质量的最有效的方 法 。 1 指纹图谱虽是目前能够为国内外广泛接受的一种中药质量评价模式，但单纯的化学成分指纹图谱还不能很准确地评价中药的成分与其药效之间存在的相关信息。所以，进 一步深入研究在此基础上探讨的新领域 “谱效关系学”成为必然。 2 前胡是一味已有 1500多年 药用历史的常用中药 , 少毛北前胡 为前胡的地方习用品种 。 主要分布于天水 (北道、清水、甘谷 )、 陇南 (徽县、两当、康县 )、定西 (岷县、漳县 )、临夏 (康乐 )、甘南 (卓尼 )、平凉 (平凉、华亭、庄浪、灵台 )及庆阳 ， 其中陇东、 陇南及天水有大量收购。该品种质地坚硬，柴性大，商品习称硬杆前胡 ， 甘谷 、漳县等地又称石防风 ， 庄浪、康县等地尚称前胡。少毛北前胡 在甘肃 作前胡使用，分布广泛，资源丰富，使用历史悠久 ， 事实上已成为 甘肃 省 前胡 商品 药材 的主流。在前期的研究中， 从化学成分 、 药物代谢动力学的角度 来看， 将其作为中药 “ 前胡 ”的代用品是可 能的。 本论文将通过少毛北前胡指纹图谱与药效关联性研究来确定发挥药效的特征色谱峰， 为将来 少毛北前胡的活性部位 或活性成分 开发为新药 提供 技术和理论支持，从而为其 作为中药 “ 前胡 ” 的代用品可 行性提供 支持。兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 2 第一章 综述 药指纹图谱 中药指纹图谱是借用 药材或中成药经过适当处 理后，利用现代信息采集技术和质量分析手段得到的能够显现中药材或中成药性质的图像、图形、光谱的图谱及其数据，即为中药指纹图谱 。 它是一种综合的、可量化的鉴别手段，用于鉴别中药材的真伪。 3中药指纹图谱可用于中药研 究、生产的各个阶段，因而根据应用的对象可分为中药材指纹图谱、中药原料药 (包括饮片、配伍颗粒 )指纹图谱和中药制剂指纹图谱，细分还可包括中药生产过程中间产物的指纹图谱。 4 药指纹图谱的特点 1 1 1 1 专属性、唯一性： 指纹图谱必须反映出该药材 (或成药 )有别于其他任何物质。对于中 药材，指纹特征能反映出产地和采收期不同而造成的差异；对于中成药， 则能反映出同产品不同批次问的质量差异。 1 1 种的唯一性和个体的相似性：利用色谱技术进行指 纹图谱分析的中药材因 生长年限、生长环境的变化而可 能产生个体间较为明显的差异但个体必然有群体共有的相似性 ， 应该既具有判断该药材真伪的“共性”，又 可能反映不同的产地、不同采收期、不同处理加工工艺的“特性”特征。 1 1 体性和模糊性 ：整体性是指中药化学成分的整体组成及特性，即图谱应能相对全面、系统地体现中药成分的整体面貌；模糊性是指个体样品本身就存在着未知因 素，难以对 所有 化学成分进行精确的定性 定量分析，故在解决实际问题时应采用模糊数学等手段 。 5 药指纹图谱研究方法 目前关于中药指纹图谱的研究方法有色谱法、光谱法、核磁共振谱、联 用技术 。色谱法包括薄层色谱 (、高效液相包谱 (，气相色谱 (和 毛细管电泳 (等 。 具有很高的分离度，可把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图，这些色谱峰的高度和峰面积分别代表了各种不同化学成分和其含量 ,整个色谱图表征了该样品所含化学成分的多少和量的大小 ； 提供信息量有限，很适于非挥发性成分； 兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 3 别是生物大分子 肽和蛋白的分离，但其重现性有待提高 ；光谱法包括红外光谱和 紫外光谱； 联用技术是最有效的建立指纹图谱的方法，如 合解决中药复杂体系的要求，但仪器价格昂贵，不易推广使用。 6 药谱效关系 中药谱效关系是指建立在中药指纹图谱的研究基础上，最大限度地获取有用的化学信息，将标示物质群特征峰的指纹图谱与药效结果联系起来，为确立中药药效物质基础、制定反映产品内在质量的控制标准而进行的研究 。 2 如何将指纹图谱的“谱”和中药的药“效”关联起来是谱效关系研究必须解决的关键问题之一。一般的谱效关系研究过程包括采用适合的 分析方法构建中药指纹图谱，并对图谱标示的成分进行分析；建立适合的药效评价模型，获取药理学数据；采用数据 处理技术将指纹图谱数据和药理学数据进行关联，结合中医药专业知识，建立有意义的谱 12 比较常用的处理指纹图谱数据与药理数据的方法有：回归分析、相关分析、灰关联度分析、聚类分析、主成分分析、典型相关分析等多种分析方法，采用这些方法将其指纹图谱数据与药效活性 数据相结合建立数学模型，以此研究二者的相关性，即得到谱效关系。 2 尽管中药谱效学在中药质量控制上的指导理论及思路是科学的，并且有现代科技的支 持，但依然面临多方面的技术难关。首先，成分生物活性的测定与中药的“功能主治”只能部分相关而不能完全一致，而且，现有的生物活性测定方法只能对中药的某种或某些主要功效进行验证研究，或在现有相对成熟的药效学实验中选取一种或几种方法和指标进行，难以完全真实地反映药物所有的功效。其次，生物测定方法存在因生物个体差异而引起的误差，重复性和精密度较差，因而对实验方法、观察指标、限值剂量的设计要求较高，这是最重要也是最难克服的一点。另外，对于检验部门来说，中药质量控制标准及方法力求准确、简便，而谱效法相对来说比较复杂，在一 般的实验条件下难以进行，因此，中药谱效学的研究方法及思路还有待于深入探讨。 13 胡 中药前胡 ( 为伞形科植物白花前胡 ( 干燥根 , 主要分布于浙江、江西、安徽、江苏等省 , 是一味已有 1500兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 4 多年药用历史的常用中药 。 14 胡化学成分研究 多种类型的香豆素类化合物是前胡的主要成分和生理活性成分 , 此外尚含有挥发油、色原酮、黄酮、聚炔、木脂素、简单苯丙素衍生物等。 17孔令义 18对白花前胡根的石油醚提取物进行了系统的分离纯化 , 共得到并鉴定香豆素类化合物 42个 , 其他类化合物 4个 , 其中新化合物 10个。 张 村等 19对河南产白花前胡的水溶性部位进行了化学成分研究，采用色谱法分离化学成分，利用质谱、核磁共振等波谱技术鉴定结构，分离鉴定了 7个化合物，其中 5个化合物为首次从该植物中分离得到， 2个化合物为首次从伞形科植物中分离得到。 陈二林等 20采用硅胶柱色谱法及制备薄层色谱法对少毛北前胡甲醇提取物进行分离纯化，根据理化性质和波谱分析 鉴定其化学结构， 结果从少毛北前胡中分离鉴定了 9个化合物， 均为首次从该植物中分离得到。 胡药理活性研究 前胡可降气化痰 ,宣风散热，是治疗呼吸系统、消化系统疾病和心胸痛的良药。现代药理研究证明，前胡对支气管炎、高血压、冠心病等有一定的疗效 ,同时 ,前胡及其有效成分在治疗心血管疾病方面有广阔的应用前景 。 21白花前胡在 改善心衰进程，提高患者生活质量方面有较好效果，具有较高的实用价值及开发前景，涂乾等 22用腹主动脉缩窄法建立慢性超负荷大鼠心衰模型， 比较白花前胡提取液对心衰大鼠心脏系数 、血压、心肌细胞凋亡率及凋亡相关基因的影响，并与依拉普利比 较，结果 白花前胡提取液可抑制心肌重 塑， 对心衰发挥生物学治疗作用 。 现代研究表明，白花前胡有效成分主要为香豆素类，具有扩血管、降血脂等多种药理活性 . 王德才等 23采用大鼠酵母致热法、小鼠扭体法和热板法、小鼠耳廓肿胀法和大鼠蛋清足跖肿胀法观察白花前胡总香豆素组分 (解热镇痛抗炎作用，结果 吴 皓等 24分别用氨水及组胺与乙酰胆碱吸人造成小鼠咳嗽与哮喘的模型，给予前胡咳痰汤及阳性对照药进行治疗，利用 酚量腹腔注射观察其祛痰作用， 以流感病毒滴鼻法造成模型，观察了 前胡咳痰汤 的 抗病毒作用，结果 前胡咳痰汤有明显的止咳、化痰、 平喘及抗病毒作用 。 胡 含量测定研究 香豆素类成分是前胡的主要有效成分， 白花前胡中指标性成分为角型二氢吡喃香豆素，而紫花前胡中的指标性成分为线型二氢吡喃香豆素，潘文灏等 25采用高效液相色谱法测定白花前胡干燥根中白花前胡丙素的含量，同时，对紫花前胡干燥根也进行了分析，结果紫花前胡不含白花前胡丙素 实验不仅为前胡不同品种的鉴别提供实验依据，而且为控制白花前胡的内在质量提供可靠的方法。 2000年以前 ， 紫花兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 5 前胡和白花前胡 （ 均作为前胡被收入 中国药典 ，但研究表明， 这两类成分的药理作用有明显区别， 2010年白花前胡和紫花前胡被分列为前胡和紫花前胡两个品种载入药典 。 周婵等 26首次建立了两相系统 该方法准确 ， 可靠 ， 对紫花前胡药材及其制剂的质量控制有较重要意义 ， 已被 2010 版 中国药典 采纳 。 少毛北前胡(aT 商品习称硬杆前胡，主产于甘肃省的陇南、天水、陇东等地区 。 陈二林等 27用 种香豆素 含量的分析方法， 建立的该方法简便、快速、准确。兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 6 第 二章 少毛北前胡 指纹图谱的构建 验材 料 仪器 ： 美国 效液相色谱仪， 元泵， 2996 二极管阵列检测器 ；717自动进样器； 色谱柱（ 天津琛行 ： 5m ， 50 ； 山市超声仪器有限公司）； 旋转蒸发仪（ 十万分之一电子分析天平（ 电热恒温干燥箱（ 海精宏实验设备有限公司）。 试药 ： 对照品 ： 蝉翼素 、 花椒毒素 、 异紫花前胡苷元 、 补骨脂素 、 由实验室自制 ， 以 积归一化法分析 ， 纯度均 98 %； 氯仿 （ 天津市 星月化工 有限公司，分析纯 ） 乙酸乙酯（ 天津市 凯通化学试剂 有限公司，分析纯 ） 95%乙醇 （ 杭州高晶精细化工有限公司 ， 分析纯 ） 甲醇（山东禹王化学试剂开发中心 ， 色谱纯） 乙腈 （德国默克， 色谱纯） 水为超纯水； 药材 ： 本研究所用药材来源见“表 2，药材 经兰州大学药学院生药研究所周印锁教授鉴定 。 表 2 实验用样品来源 样品号 样品名称 样品来源 白花前胡 浙江省 1 少毛北前胡 甘肃省 天水市 甘谷县 2 少毛北前胡 甘肃省 天水市 甘谷县 3 少毛北前胡 甘肃省天水市 清水县 4 少毛北前胡 甘肃省天水市 清水县 兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 7 5 少毛北前胡 甘肃省陇南市 文县 6 少毛北前胡 甘肃省陇南市 文县 7 少毛北前胡 甘肃省平凉市 华亭县 8 少毛北前胡 甘肃省平凉市 华亭县 9 少毛北前胡 甘肃省陇南市 徽县 10 少毛北前胡 甘肃省陇南市 徽县 数据处理软件 ： 中药色谱指纹图谱计算机辅助相似性评价系统软件（版本 南大学提供） ； 分别精密称取异紫花前胡苷元、补骨脂素、花椒毒素、 翼素、甲醇溶解定容至 分浸膏的制备 分别取 十 批干燥的 少毛北前胡药材 ， 粉碎后过 60目筛，然后称取过筛粉末 400g，（按以下流程图） 用 10倍、 8倍、 8倍量 溶剂 超声提取 30滤后合并滤液 ， 弃去残渣。将四部分的滤液回收溶剂后进行干燥 。 将分别得到氯仿部浸膏、乙酸乙酯部浸膏、 95%乙醇部浸膏、水部浸膏。 粉碎 过筛 药材 粉末 氯仿超声提取 残渣 滤液 乙酸乙酯超声提取 滤液 残渣 乙醇超声提取 滤液 残渣 水超声提取 滤液 残渣 兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 8 药材提取 流程图 仿 部分指纹图谱的 建立 试液的制备 精密称取 氯仿 部分浸膏 甲醇溶解，定容至 5声 10 孔滤膜过滤，备用。 纹图谱 的建立 腈 表 1）；温度 25；进样量 20l ；检测波长 320 表 1 氯仿 部分指纹图谱 流动相 时间 速 mL/腈 （ A） 水 （ B） 0 0 60 30 0 60 35 0 50 55 0 40 70 5 35 80 5 25 85 0 20 定 按上述色谱条件测定 10批少毛北前胡的指纹图谱 ，对各个峰紫外光谱图进行对比分析，找到 20个共有峰。 采用夹角余弦法的原理，以共有峰的峰面积计算相似度，10个样品的相似度结果见表 2. 在 320 表 1的流动相测定参照物 异紫花前胡苷元、补骨脂素、花椒毒素、 翼素、 其保留时间分别 ,与样品指纹图谱中相应色谱峰进行比较，发现少毛北前胡样品指纹图谱中的 1 号 、 3 号、 4 号、 10 号、 13 号、 16 号峰的保留时间及紫外光谱图分别与 异紫花前胡苷元、补骨脂素、花椒毒素、 翼素、 故少毛北前胡样品指纹图谱中 1号、 3号、 4号、 10号、 13号、16 号特征峰鉴定为 异紫花前胡苷元、 补骨脂素、花椒毒素、 翼素、见图 1。 2。 兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 9 图 1 十 批 少毛北前胡氯仿 部分的 320 图 2 少毛北前胡氯仿 部分 纹图谱共有模式 表 2 十批少毛北前胡 氯仿部分 有峰的保留时间（ 相似度 共有峰 样 1 样 2 样 3 样 4 样 5 样 6 样 7 样 8 样 9 样 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 10 13 49,979 14 15 16 17 18 19 20 相似度 相似度的精密度与重现性 取 1 号 少毛北前胡 供试液，进样 5 次，每次进样量为 20 L， 测定指纹图谱相似度的日内精密度， 计算得图谱的 相似度 . 65)，说明 少毛北前胡氯仿 部分的 祛 痰 作用是其内 “ 化学成分群 ” 共同作用的结果 ，其中 12号、13号、 16号、 18号峰所代表的化学成分与化痰 作用具有高度关联（关联度 0. 80）。依据关联度的大小，确定各成分对 “ 祛 痰 作用 ” 贡献的大小顺序为： 中 1号、 3号、 4号、 10号、 13号、 16号峰分别为 异紫花前胡苷元、补骨脂素、 0 i 1N k 1N L 0 i(k )兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 27 花椒毒素、 翼素、 表 5批少毛北前胡氯仿 部分指纹图谱共有峰面积及 共有峰 样 1 样 2 样 3 样 4 样 5 样 6 样 7 样 8 样 9 样 10 1 483443 50673 174667 23203 44784 59083 150081 180927 150684 266717 2 380508 39045 140728 37329 28470 22915 59034 115890 86125 219719 3 773069 12431 221437 67066 74863 395 136502 94245 199048 465226 4 402661 67890 308693 48495 22352 678473 305050 360817 86011 274743 5 1222127 35608 912301 2459 226318 44248 989402 777410 475240 766070 6 626943 142359 385824 128392 101248 282 265554 278569 220935 293837 7 2388454 85009 1998064 6601 979179 254132 929310 924914 688750 1072959 8 4995019 1428502 1639641 553251 1047098 446616 2032703 1296799 3369017 5143092 9 334401 472304 50722 150731 270345 251776 73974 22503 47666 30040 10 1916458 2015782 1678246 1420490 1232001 2188324 2531690 1133213 1082004 1824015 11 2794823 641559 1191017 428211 381164 883989 863118 958251 1457113 2193324 12 1669410 844541 1498420 521593 517272 898746 898399 1303425 865771 1330770 13 58805478 65598565 64690400 42260647 40563875 68331512 59917501 51806377 65586390 94200969 14 2796845 1909432 4749455 989159 1092125 1734236 3186276 4018668 843049 2291826 15 16756081 20765103 20101763 5366721 12382951 21892168 18643642 16123533 10697527 5165188 16 6038783 5497603 8860106 3756267 3337936 4903369 6305562 5052209 3233741 4751800 17 16534091 8992509 528259 5552075 5275177 7611553 11314863 7095000 8085663 13846854 18 13063858 16127129 14849196 11227867 9759394 16878931 13712876 12072165 8329271 11288597 19 6186338 6696503 5388659 4527776 4230999 7332528 5155232 4338561 3579868 5126862 20 1611622 1778345 1451073 1217326 1065219 1778709 1334077 693829 918022 1364178 5 少毛北前胡氯仿 部分指纹图谱共有峰面积 及 祛 痰效果 共有峰 样 1 样 2 样 3 样 4 样 5 样 6 样 7 样 8 样 9 样 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 28 17 18 19 20 A 值 表 5 批 少毛北前胡氯仿 部分指纹图谱共有峰 与其 祛 痰效果 之间 的关联系数和关联度值 共共有峰 样 1 样 2 样 3 样 4 样 5 样 6 样 7 样 8 样 9 样 10 关联度 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 少毛北前胡水 部分与 镇咳 药效学指标的灰关联度分析 选择相应序列 表 5 批 少毛北前胡水 部分指纹图谱共有峰面积及其 咳嗽潜伏期 与空白组 咳嗽潜伏期 的差值 R。 原始数据处理 子序列和母序列存在测度不统一的问题，因此需对原始数据进行规格化处理 ：中， 表 5 少毛北前胡水 部分指纹图谱共有峰面积 及 镇咳 效果 计算关联系数和关联度 按照方法介绍中的步骤 2和 3计算，结果见表 5 兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 29 排关联序 各个峰所 代表的化学成分与 镇咳 作用具有一定关联 (关联度 均 0. 70 )，说明 少毛北前胡水 部分的 镇咳 作用是其内 “ 化学成分群 ” 共同作用的结果 ，其中 10号峰所代表的化学成分与抗镇咳 作用具有高度关联（关联度 0. 80）。 依据关联度的大小，确定各成分对 “ 镇咳 作用 ” 贡献的大小顺序为： 表 5分指纹图谱共有峰面积及 共共有峰 样 1 样 2 样 3 样 4 样 5 样 6 样 7 样 8 样 9 样 10 1 52602 52359 97156 23981 751641 135448 339688 182629 224553 40182 2 238375 8264 96519 500 46737 1496 1056 38390 233471 180025 3 43394 444 1584 791 2482 1459 486 415 19739 14870 4 6841 694 12336 334 2778 216 993 793 14260 1870 5 898 451 586 267 534 252 373 239 5074 508 6 15371 300 375 428 3003 1109 693 482 19609 14920 7 4629 311 236 438 495 341 438 312 519 1010 8 401 295 343 220 574 501 302 169 4024 209 9 5121 236 15544 685 694 727 622 939 3222 6732 10 416 233 582 427 259 445 271 350 261 360 R 值 5 少毛北前胡水 部分指纹图谱共有峰面积 及 镇咳 效果 共共有峰 样 1 样 2 样 3 样 4 样 5 样 6 样 7 样 8 样 9 样 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 R 值 表 5 批 少毛北前胡 水 部分指纹图谱共有峰 与其 镇咳 效果之间 的关联系数和关联度值 共共有峰 样 1 样 2 样 3 样 4 样 5 样 6 样 7 样 8 样 9 样 10 关联度 1 2 3 4 5 6 兰州大学硕士研究生学位论文 少毛北前胡指纹图谱及谱效关系研究 30 7 8 9 10 讨论 本文在获得少毛北前胡氯仿部分和水部分指纹图谱与药效学量化数据的基础上，采用灰关联度分析技术，寻找指纹图谱特征所代表的化学成分对药效贡献的大小。 结果表明：少毛北前胡氯仿部分的化痰作用是其内“化学成分群”共同作用的结果。依据关联度的大小，确定各成分对“ 祛 痰作用”贡献的大小顺序为： 12 中 1号、 3号、 4号、