【毕业学位论文】（Word原稿）钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究

兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 1 第一章 绪论 物医用金属材料 生物医用金属材料是指能够植入人体内，用于诊断、治疗，甚至替换组织、器官以增进其功能的金属与合金材料，属于生物惰性材料。目前，应用于临床的主要有不锈钢、钛基合金、钴基合金以及贵金属 1。在所有生物医用材料中，生物医用金属材料应用最早、最为广泛。目前，主要应用于临床骨、牙齿等硬组织的修复与替换，软组织的修复，心血管支架材料以及人工器官中的结构元件 2。与其他医用材料相比，医用金属材料具有 强度 高 、韧性 好、抗疲劳 、加工性能 优异等特点 。 生物医用金属材料必需严格满足以下要 求 3, 4： 1) 良好的生物相容性。包括无毒性，无致畸、致癌性，不破坏邻近组织，不干扰机体免疫机理。 2) 良好的理化稳定性。包括强度、尺寸稳定性，耐磨性，耐腐蚀性等。 3) 材料易于得到，便于加工、制造。 4) 用于心血管系统的植入材料除应满足以上要求外，还要求具有良好的血液相容性。包括不溶血，不破坏血小板，抗凝血性好，不扰乱电解质平衡。 及钛合金材料 钛，在地壳 中含量排第十位 ， 密度为 普通不锈钢的 56%，但强度是不锈钢的 3， 20 世纪 50 年代起逐渐得到发展 5。 因其具有优良的理化性能 ，良好的耐腐蚀性、生物相容性，现 广泛应用于航空航天、 化工、医疗 等 领域。 20 世纪 40 年代初， 钛因与骨组织没有任何不良反应而被首次引 入生物医学领域 6， 60 年代 钛合金引入口腔种植领域后，钛及钛合金作为外科植入材料才得到广泛的发展 7, 8。近年来， 金成为最常用的医用钛合金材料，每年世界上有近千吨钛合金用于制造人体植入材料， 金约占其中的 80%。 目前，钛及钛合金作为人体植入材料主要应用于以下几个方面： 1) 骨植入材料。 钛及钛合金目前 被 广泛用 于 骨固定材料 的钛板、钛 螺钉等。 2) 牙科植入材料。 钛合金因具有良好的理化性能、生物相容性，以及与骨组织接近的弹性模量 和 硬度，在 20 世纪 80 年代初就 开始 应用于口腔种植领域。现广泛应用于牙列缺损及牙列缺失等修复的种植治疗。 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 2 3) 介入性支架材料。心血管支架材料过去常采用 316L 奥氏体不锈钢制成，但其柔韧性差，现以镍钛合金制成的心血管支架具有与人体要求的纵向柔顺性，作为心血管植入材料更为适合。 及钛合金植入材料面临的问题 目前，临床上广泛应用的 易在 表面生成一种十分稳定的性，但在人体体液复杂环境中 能会被溶解甚至剥脱，导致钛合金中的有毒元素 发机体毒性、炎症、血栓等不良反应 9而且因其不具有生物活性，表面的理化性质及结构影响着细胞的黏附、生长、增殖及分化能力 13；其对骨组织愈合无明显的促进作用，因而会导致种植体与骨界面结合强度低、愈合时间长，甚至会出现种植体松动、脱落等不良后果。 因此，对 合金的表面改性 针对 料在实际 应用中存在的问题，近年来对其表面处理技术 已成为生物医用材料学科最引人注目和发展最为迅速的领域之一 。表面改性就是 通过物理、化学 等技术 方法 改 变 材料 的 表面性质 ，达到所预期的目的。目前对面改性方法主要有：阳极氧化，等离子喷涂，喷砂加酸蚀，离子注入，生物活性物质表面修饰等方法。以下对这些方法做简单介绍。 极氧化 阳极氧化法是将 以 银、铜片、石墨等材料作为阴极，电极放置于电解液中（硫酸、磷酸、草酸等）在一定条件下电解，而使阳极钛合金形成氧化物薄膜的方法 。研究表明，采用阳极氧化对钛合金表面进行处理所形成的氧化物薄膜比自然形成的更加稳定、耐腐蚀性更强 14。 离子喷涂 等离子喷涂是将高温状态下的生物瓷粉高速喷射到预处理后的钛合金表面快速凝固而形成涂层的一项技术。等离子喷涂具有生产效率高，重复性好，涂层均匀，涂层与基底结合力强，可以提高材料表面的耐磨、耐热、耐腐蚀等优点，是近年来临床上研究较为成熟、应用较为广泛地钛合金改性方法。研究表明，采用等离子喷涂对钛合金表面改性可显著提高钛合金耐磨性、耐腐蚀性及生物活性15, 16。但该方法需要复杂的 设备，成本相对较高，而且常用于喷涂的 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 3 分和结构与自然骨中 能形成均匀、致密的涂层。有研究认为， 加了表面粗糙度和亲水性，易于菌斑的定居、生长，导致种植体周围炎的发生 17。这些问题限制了其在临床中的应用。 砂加酸蚀 喷砂加酸蚀处理是在一定的压力、时间控制下，使用高速气流将研磨材料喷射在钛合金种植体表面，再用酸性溶液处理，使种植体表面形成不规则的粗糙表面，喷砂的研磨材料目前应用较多的是 砂是目前使钛合金种植体形成粗糙表面的最 常用方法，可提高成骨细胞的黏附、增殖及分化能力 18。李德华 19等采用喷砂加酸蚀方法处理钛片表面后发现有利于种植体 0等研究指出，经酸蚀处理的粗糙表面 贴附的成骨细胞活性较好，而且这类种植体引起的炎性反应更小。 虽然粗糙表面促进成骨细胞的黏附，提高了种植体与骨的接触面积，但是粗糙的表面同样增加了菌斑的附着力， 从而 增大了发生种植体周围炎的机率。 子注入 离子注入是将某种需要的元素的原子或分子进行电离，高速射入固体材料表面，从而改变该材料表 面的物理或化学性能的一种方法。经过离子注入后，材料的生物相容性得到提高。目前，利用离子注入技术对种植体表面改性，以提高其耐腐蚀性、生物相容性已成为研究热点。研究表明 21, 22，将钙、磷离子注入钛合金种植体可增强耐腐蚀性，有利于成骨细胞的黏附、生长；将氟离子注入钛表面可促进成骨细胞的黏附、生长、增殖，并且提高了抗菌性能。 离子注入较其它表面处理技术相比优点有：膜与基体结合好；离子注入过程不要求高温，从而可保持材料的几何精度；可 重复性好。 物活性物质表面修饰 生物活性物质表面修饰是将具有特定 生物活性的蛋白、酶或多肽分子固定在其表面上，从而诱导成骨细胞分化和组织改造等生物学反应，可有效地控制骨整合的发生和发展。这些生物活性大分子常以化学键形式接枝在种植体表面上，因此结合牢固。目前，常用的生物活性大分子主要有：大分子蛋白、细胞黏附多肽、细胞活性因子、多糖及其类似物等。近年来，针对钛合金表面以生物大分子修饰促进成骨细胞 黏附 的处理方法早已引起业界研究者的广泛关注，其中，蛋白质或多肽对生物材料表面改性已成为生物材料的研究热点。 用高分子材料 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 4 自 20世纪以来， 高分子材料随着石油化工的发展而得到了极 大的发展。现如今，高分子材料已逐步拓展到通讯、光电、医用等方面。生物医用高分子材料是生物医用材料的一个重要组成部分，也是发展最早、应用最广、种类最多的，主要有：橡胶、塑料、纤维等。医用高分子材料作为高分子化学中一个新型的门类，随着医学的发展，其在医用材料领域的发展也越来越快、应用越来越广泛。如：硅橡胶植入材料、聚四氟乙烯人造血管、聚矾中空纤维人工肾脏等 23。 用高分子材料的分类 医用高分子材料根据来源、应用、能否降解等分为多个类型。 1) 按照材料来源分为：天然高分子材料，如明胶、甲壳素、纤维素 等；人工合成高分子材料，如聚碳酸酯、聚氨酯、硅橡胶等。 2) 按照应用目的分为：硬组织相容性高分子材料、软组织相容性高分子材料、血液相容性高分子材料等。 3) 按照能否降解分为：可降解型，如聚乳酸、胶原、甲壳素、纤维素等；非降解型，如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲脂等。 用高分子材料的发展方向 近 20年来，各发达国家都在积极开发新型高分子聚合物，未来发展方向主要有 24： 1) 人工脏器在材料本体及表面结构达到有序化，复合化，进一步提高材料生物相容性。 2) 药物载体高分子材料的应用将继续扩大。 3) 可降解生物医用高分 子材料的应用前景将更加广阔。 4) 生物医用高分子材料发展的重点方向是，复制具有与人体各部天然组织相近的生物学性质和力学性质的生物医用材料，达到生物医用材料功能化与智能化。 入体生物相容性评价 物相容性概念及意义 生物相容性 是生物医用材料与生物体组织之间相互作用产生的复杂的物理化学、生物力学、生物电学等反应的一种概念。一般来说，是指生物材料植入体内后能够耐受宿主各系统影响而保持相对稳定，不受排斥和破坏的生物学性能。生物相容性 又称生物适应性。生物相容性包含两个原则：一是生物安全性原则，二是生 物功能性原则。植入人体的各类替代材料、辅助装置必须满足对机体无毒、兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 5 无致敏性、无致畸致癌性、 不破坏邻近组织，不干扰机体免疫机理。对于牙科种植材料而言，植入体的生物相容性更多的是指骨组织对于种植体的反应以及种植体对于周围成骨的影响。 物相容性评价方法 一种新的生物医用金属材料在用于临床之前，必须经过一系列严格的生物学性能评价。主要考察材料与人体的相互作用，包括材料反应与宿主反应 25。生物医用材料的用途不同，其评价生物相容性的项目也不同，目前对生物医用金属植入材料的评价根据体外、体内及相互之间的 位置，分为短期评价和长期评价 26。 医用金属植入材料评价方法较为复杂。其短期评价方法有细胞毒性试验、致敏试验、刺激试验、全身毒性试验、血液相容性试验等，长期评价方法包括致癌试验、慢性毒性试验，遗传毒性试验、生殖与发育毒性试验、生物降解试验等 27。生物相容性评价所采用的试验方法应保证灵敏、精确、可靠，试验结果可重复性强 28, 29。 生物材料评价又可分为体内和体外试验两种，细胞培养法是体外评价生物材料生物相容性公认的实验方法之一 30, 31，该方法具有灵敏度高、操作简单、重复性强、费用低廉等优 点，已成为评价医用材料生物相容性的一项重要内容，为筛选新材料、评价材料安全性提供科学的依据。 一种新型医用植入材料若要应用于临床，必须要进行体内的动物实验进行评价，这是体外细胞实验无法替代的。将评价的植入材料制成合适的形状，植入动物体内并与骨组织接触，观察新材料对成骨早期及长期的影响，也是评价医用植入材料安全性的一个重要手段。 题依据 和 研究思路 目前， 牙科种植材料 广泛应用的 在人体体液复杂环境中 定性差，可能会被溶解甚至剥脱，导致钛合金中的有毒元素 发机体毒性、炎症、血栓等不良反应 9而且因其不具有生物活性，表面的理化性质及结构影响着细胞的黏附、生长、增殖及分化能力 13；其对骨组织愈合无明显的促进作用，因而会导致种植体与骨界面结合强度低、愈合时间长，甚至会出现种植体松动、脱落等不良后果。 随着人们对高分子材料的不断深入研究，各种高分子聚合物材料 应运而生 ，并且其 在生物 医学方面的 应用也受到越来越广泛的关注。 本课题组自行合成了一种含氟聚合物材料 32, 33， 即 4并环丁烯和 2,3,4,5,6 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 6 物。该聚合物是一种具有特殊性能的高分子 材料， 研究证明，其具有良好的稳定性和耐腐蚀 34。并且， 氟元素是机体所必需的微量元素之一，可促进成骨细胞活性增加，使碱性磷酸酶的表达、胶原合成和骨钙素合成增加，对骨骼成长发育和维持生理功能具有十分重要的作用 35因此，我们探索采用含氟聚合物对植材料进行表面改性，以提高其耐腐蚀性和生物活性。 基于以上分析，本实验研究与中国科学院兰州化学物理研究所固体润滑国家重点实验室合作，对表面制备有含 氟聚合物薄膜的 性能进行评价，讨论一种新型改性方法的可能性。 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 7 第二章 钛合金表面含氟聚合物薄膜的制备及表征 以 主的钛合金因具有良好的理化性能、机械加工性能 和生物相容性等特点，而作为牙科及外科植入材料被广泛应用于临床 38。多项研究指出，金在人体体液复杂环境中表面自发形成的 膜稳定性差，甚至可能会剥脱以及被溶解，导致合金中的有毒元素 V 析出，诱发机体炎症、毒性、血栓等反应 9 而且因 其不具有生物活性，表面的理化性质及结构影响着细胞的黏附、生长、增殖及分化能力 13；其对骨组织愈合无明显的促进作用，因而会导致种植体与骨界面结合强度低、愈合时间长，甚至会出现种植体松动、脱落等不良后果。 因此对钛合金进行表面改性处理以提高其耐蚀性具有重要意义。 目前， 对钛合金表面改性的方法主要有：阳极氧化、微弧氧化、喷砂加酸蚀处理、等离子喷涂、离子注入等。但是， 这些方法都不同程度 的增大 了材料表面的粗糙度 与亲水性， 弱化了基 底材料表面的强度。 作为植入材料，表面粗糙度和亲水性的增大势必会增加菌斑附着、生长和繁殖的 机率，从而增大了发生种植体周围炎及骨吸收的机率 。因此，一种既能使钛合金表面得到有效保护，又能提高与成骨细胞相容性的改性方法显得尤为主要。 随着人们对高分子材料的不断深入研究，各种高分子聚合物材料应运而生，并且其在生物医学方面的应用也受到越来越广泛的关注。 本 课题组自行合成了一种含氟聚合物材料 33（即 4,3,4,5,6该聚合物是一种具有特殊性能的高分子材料，研究证明，其具有良好的稳定性和耐腐蚀 34。氟元素是机体所必需的微量元素之一，可促进成骨细胞活性增加， 使碱性磷酸酶的表达、胶原合成和骨钙素合成增加，对骨骼成长发育和维持生理功能具有十分重要的作用 35 基于以上原因，我们 采用该含氟聚合物对钛合金表面进行改性， 并对其结构及相关性能进行分析、讨论，寻求一种钛合金新型改性方法。 料与方法 料、试剂与仪器 实验材料： 金片 （ 1 1 0.1 西北有色金属有限公司 ） ；含氟聚合物： 2, 3, 4, 5, 64兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 8 （ P( ，即 4,3,4,5,6本课题组自制）。 实验试剂： 无水甲苯 溶液 、丙酮 溶液 、无水乙醇 溶液等， 所有试剂均为分析纯 ， 超纯水（ 18 实验仪器： 78 恒温磁力搅拌器 （ 洛阳恒辉化验器材有限公司 ）； 金相式样打磨抛光机（中国莱州市蔚仪试验器械制造有限公司）； 超声波清洗器 （ 济宁科源超声波设备有限公司 ） ； 旋涂仪 （ 美国 司）； 学接触角测试仪（ 德国 ） ； 美国 射线光电子能谱仪（ 英国 司 ）； 原子力显微镜（德国 司）。 氟聚合物溶液的配制 称取一定质量含氟聚合物 2, 3, 4, 5, 64（ P( ，即 4,3,4,5,6溶解于无 水甲苯 溶液中，用磁力搅拌器搅拌， 配制成质量百分比浓度为 1的含氟聚合物溶液以备用。 合金表面含氟聚合物薄膜的制备 1) 钛合金样品制备： 合金片单面经 600 100015002000目的金相砂纸逐级打磨 ，在 金相抛光机上抛光 ，依次在去离子水、丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗 10气吹干后备用， 该样品简记为 2) 钛合金表面制备含氟聚合物薄膜：将打磨、抛光好的 合金片 放置于旋涂仪中，用注射器将 50l 配制好的含氟聚合物溶液滴加到高速旋转的钛合金样品 上 （ 2000 r/m， 20s） ，然后将旋涂好的样品放于有氩气保护的烧结炉中， 250 退火 30含氟聚合物表面发生热交联 ，待温度降至室温后，经丙酮、蒸馏水清洗，自然干燥，得到表面制备有含氟聚合物薄膜的钛合金样品组，该样品简记为 氟聚合物薄膜 的表征 1) 将 和 样品表面喷金，用 多功能 析样品表面的主要元素 成分 ，采用 激发源，通过能量 试室真空度小于 110a，用 的电子结合能 内标。 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 9 2) 水接触角测量： 采用 接触角测量仪 对 品表面 进行静态水接触角 测量。 测试条件，温度 20、相对湿度 40%每个样品测量 5 个点，取其平均值。 3) 含氟聚合物薄膜厚度测量：采用 椭圆偏振光测量仪 测量薄膜厚度，以 光源，波长 为 射角 为 50 ，样品至少测量三个不同区域，结果取平均值。 4) 表面形貌观察：采用 原子力显微镜在接触模式下，观察 品表面形貌，并测量粗糙度值，数据采用 计软件 进行统计学分析。 实验所用探针相同，室温 22 ，相对湿度 15% 果与讨论 氟聚合物薄膜表面化学组成分析 0 200 400 600 800 1000F 1ng (e V )图 谱图 金表面制备含氟聚合物薄膜的 谱图（图 可见明显的 C、 F 元素谱峰，在 的 号和位于 出现 号较强，归属于含氟聚合物薄膜中的碳、氟元素，未见 素及 素的谱峰，表明含氟聚合物已成功制备在钛合金表面 。 氟聚合物薄膜表面润湿性分析 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 10 图 a)和 b)的水静态接触角 照片 表 样品组别 接触角（ ） F 的静态接触角结果显示（图 金接触角为 ，表面制备有含氟聚合物薄膜的 金表面接触角 增大至 ， 表现为疏水性。 这与文献报道的 含氟聚合物薄膜具有疏 水性结果一致 32, 34，表明钛合金表面已成功制备含氟聚合 物薄膜。 根据文献报道，钛及钛合金种植材料的表面润湿性要求对水的接触角在 0到 140的范围内 39, 40，且疏水性的增加可以减少种植体表面细菌黏附，对降低种植体周围炎的发生起到一定的效果，故经含氟聚合物薄膜改性后的 合植入材料对水接触角的要求，可应用于外科植入领域 40, 41。 氟聚合物薄膜厚度 表 含氟聚合物薄膜厚度 样品组别 厚度 （ 圆偏振光测量仪测量 金 明钛合金表面制备的含氟聚合物薄膜厚度为纳米级，属超薄膜。. 究了聚合物薄膜的最小有效厚度，指出聚合物薄膜厚度小于兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 11 ，其在界面反应中将失效 42。界面在复合材料中起着重要的作用，增强与基底金属的界面反应对复合材料起着决定性作用 43，并且通过热交联含氟聚合物薄膜与钛合金基底以化学键结合 32，也有研究证实 含氟聚合 物 较 原子氟和短链含氟有机化合物 对 固体 基底的 表面 改性结合 更为持久 44， 因此，含氟聚合物薄膜与 金 表面 具有较强的结合力与稳定性。 氟聚合物薄膜表面形貌分析 图 a,b)和 c,d)的 原子力显微镜照片 表 样品组别 表面粗糙度 值 （ F 制备有含氟聚合物薄膜的 见到钛合金基底明显的打磨痕迹，并且在薄膜表面可见大小、分布均匀的团粒状突起。通过原子力显微镜测得两组样品的粗糙兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 12 度值（表 经 行 两样本 结果无统计学意义（ P 表明含氟聚合物薄膜对钛合金表面改性并不改变钛合金表面的粗糙度。表面粗糙度增大势必会增加表面菌斑的定居，或导致种植体周围炎的发生 17，因此，采用含氟聚合物薄膜改性钛 合金表面，较表面喷砂、等离子喷涂、酸蚀处理等方法具有明显的优势。 结 采用 旋涂、热交联的方法在 金表面制备含氟聚合物薄膜，通过样品进行表征、润湿角分析表面亲疏水性，结果证明含氟聚合物薄膜已制备成功；通过椭圆偏振光测量仪测量薄膜厚度、原子力显微镜进行表面形貌分析，结果表明含氟聚合物薄膜对 金 改性后并不改变表面粗糙度 。 因此，有必要对表面改性后的钛合金相关生物学性能做进一步的综合评价。 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 13 第三章 钛合金 表面 含氟聚合物薄膜的 耐腐蚀性及细胞毒性研究 人体的生理环境十分复杂，金属植入材料长期存在于人体体液环境如 唾液 、体液 、生理 盐溶液 ，会使植入材料发生电化学腐蚀。因此，金属植入材料必需具有良好的耐腐蚀性， 植入材料的耐腐蚀性 也 是 研究 材料生物 相容性的有效 指标之一 45。研究表明， 金表面自发形成的 膜虽在 正常条件下具有较好的 耐腐蚀性 ，但 在人体体液复杂环境中 膜稳定性差，可能会被溶解甚至剥脱，导致钛合金中的有毒元素 V 的 析出，诱发机体毒性、炎症、血栓等不良反应 946。 因此 ，我们 采用经典 的 三电极体系的电化学测试方法， 对比评价经含 氟聚合物 薄膜改性前、后 金 表面分别 在 模拟人体体液（ 人工唾液 (生理盐水（ 的电化学腐蚀情况。 一种新型生物医用材料应用于临床之前，其安全性考察是重要的环节。 47, 48，具有简便、敏感、重复性强等优点。小鼠成纤维细胞（ 国际标准化组织确定的检测细胞毒性的标准细胞株 49, 50，其遗传学性状与体内正常细胞接近，对于外界作用较敏感。因此，我们采用体 外培养 用 料与方法 料、试剂及仪器 实验 材料： 金 样品预备同第二章，样品简记为 ；钛合金表面含氟聚合物薄膜的制备同第二章，样品简记为 ； 鼠成纤维细胞（上海细胞生物研究所）。 实验试剂： 模拟人体体液 制） ；人工唾液 制）； 安双鹤药业） ； 1640培养基（美国 ；无噬菌体标准小牛血清（杭州四季青）；胰蛋白酶（ 美国 ； 美国 ； 京中杉金桥）； 美国 。 实验仪器： 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 14 精密电子天平（美国 磁力搅拌器（上海振荣）；移液器（德国 型 电化学工作站（ 瑞士 细胞培养箱（日本 生物安全柜（上海力康）；倒置相差显微镜（日本 冰箱（青岛海尔）；高压灭菌锅（日本 台式高速离心机（湖南赫西仪器）； 80型酶标仪（美国 ）； 25 胞培养瓶（美国 24孔细胞培养板（美国 96孔细胞培养板（美国 实验试剂准备： 1) 人工唾液的配制 按照文献 51依次称取 .4 g /L、 .4 g /L、g /L、 g /L、 g /L、 尿素 ) 1.0 g /L， 加入 蒸馏水 1000 2) 模拟人体体液的配制 依次称取 入蒸馏水 1000 3) 1640培养液 的配制 取 1袋 1640粉剂加入到 800磁力 搅拌使其充分 溶解，加入分析纯 用 1 三蒸水定容至 1000采用 分装于无菌玻璃瓶中， 4冰箱保存备用。 4) 液配制 取一袋 解于 1000 磁力搅拌，使其充分溶解， 分装 于无菌玻璃瓶中，采用高温高压蒸汽 灭菌 30待温度降至室温，在超净工作台中封口， 4冰箱保存备用。 5) 依次称取 g、 .0 g、 红 入 800 磁力搅拌使其充分溶解， 用 1 装于无菌玻璃瓶中，高温高压蒸汽 灭菌 后， 4冰箱保存备用 。 6) 酶溶液配制 称取胰蛋白酶粉 剂 于 80s 溶液中 ，调节 至 定容至 100器过滤除菌 后 ，分装 于无菌玻璃瓶中 ， 置于 箱保存 。 7) 液的配制 称取 50于 10 中 ， 磁力搅拌混匀，用 器除菌， 配制过程 避光 操作 ， 4 避光 保存， 1 周内使用。 化学腐蚀研究 采用三电极体 系：铂电极为辅助电极，银 测样品为工作电极，电解液为模拟人体体液（ 人工唾液（ 含 10%胎牛血清的生理盐水（ 初始扫描电位 ，终止扫描电位 0 V，扫描兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 15 速率 ，样品暴露于电解液中的面积 利用电化学工作站测量及 样品 的 塔菲尔 曲线 ， 计算 样品的 腐蚀电位 和 腐蚀电流 ， 利 用公式：自腐蚀电流密度 =自腐蚀电流 /腐蚀面积 ，算出样品 的 腐蚀电流密度。 929 细胞 培养 胞 复苏于 25胞培养瓶中， 在 含 10%小牛血清、 100 U/霉素和 100 U/霉素的 1640 培养液中， 置于 37 ， 5% 细胞培养箱中培养，待细胞 生长 密度约占 培养瓶 底面积 80%，用 酶充分消化 、 传代，选择传代 3 代以上、处于对数生长期并生长状态良好的细胞 用于实验。 胞毒性实验 1) 样品准备 实验前先将 、 样品高温高压灭菌，在生物安全柜中用灭菌的镊子将样品放置于 24 孔培养板中备用， 打磨、抛光面向上， 含氟聚合物薄膜表面向上，每组样品做 3 个平行孔。 2) 细胞接种 将处于对数生长 期的 胞用 酶消化，细胞悬液吹打混匀，用血球计数板对细胞进行计数、稀释，使细胞接种密度为 2 104/稀释、混匀好的细胞悬液用移液器加到 24 孔板已放置样品的孔中，每孔 1 性对照孔加 1 胞悬液 ，轻轻晃动 24 孔板，使细胞分布均匀。其余孔每孔加入 1 3) 色实验 材料与细胞共 培养 ，分别在 1、 2、 4 天 时 ， 在避光条件下 每孔加入 100 l 液， 放入细胞培养箱孵育 4h 后，用注射器小心将孔中液体吸弃，每孔加入 750l 的 于摇床上振 荡 10结晶物充分溶解，然后用移液器将 24 孔板中液体以每孔 150l 移到 96 孔培养板中，在自动 酶标 分析 仪 490长下检测各孔吸光度值， 记录结果， 根据公式：细胞相对增殖率（ =（实验组 A 值 /阴性对照组 A 值） 100%，计算相对增殖率。 4) 样品与细胞共培养观察 在材料与细胞共培养 2 天时，加入 前，将放有样品的 24 孔培养板置于倒置相差显微镜下观察材料与细胞共培养的情况，并拍照。 计学分析 数据结果采用 计分析软件进行独立样本 t 检验分析， 检验水准为 = 果与讨论 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 16 氟聚合物薄膜 的 耐腐蚀性 图 菲尔 曲线 表 化学腐蚀的腐蚀电位和腐蚀电流密度 样品组别 腐蚀电位 （ V） 腐蚀电流密度 （ A 10F 10 菲尔 曲线 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 17 表 化学腐蚀的腐蚀电位和腐蚀电流密度 样品组别 腐蚀电位 （ V） 腐蚀电流密度 （ A 10F 10 菲尔 曲线 表 电化学腐蚀的腐蚀电位和腐蚀电流密度 样品组别 腐蚀电位 （ V） 腐蚀电流密度 （ A 10F 10 和 样品 在在不同电解液中 测得的电化学腐蚀的 塔菲尔曲线（得到样品的腐蚀电位和腐蚀电流密度，结果表明 在不同电解液中的 腐蚀电位均大于 ，腐蚀电流密度均小于 （表 说明含氟聚合物薄膜相对于钛合金具有较好的耐腐蚀性。作为植入材料，除了要求必需具有 良好的力学性能外，还应有良好的化学性能和生物相容性。在复杂的 人体生理环境 中对植入 材料 的 要求 极为 苛刻 ，植入材料的耐腐蚀性能也是探讨材料生物相容性的一个有效指标。 人体内复杂的电解质环境成为种植材料腐蚀的重要因素52，我们 采用经典三电极体系的电化学测试方法，对比检测经含氟聚合物薄膜兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 18 改性前、后的 金在 三种不同电解液中的腐蚀电位和腐蚀电流密度。根据电 化学 腐蚀 理论 ， 腐蚀电位越 大 ， 材料的耐腐蚀性能越好；腐蚀电流密度越小，材料的耐腐蚀性越好。由结果 我们可以得出，表面制备有含氟聚合物薄膜的金（ 在模拟人体体液、人工唾液及 液中 其腐蚀倾向小于 金（ 且腐蚀速率也小于 金，表明含氟聚合物薄膜在 三种不同生理电解液 中其耐腐蚀性能明显优于未改性的 金，具有较好的耐腐蚀性。 色实验 图 表 各组不同时间点的平均 n=9） 时间 组别 平均 %） 1d F d F d F 州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 19 图 示在 1 天时 低于 （ 因钛合金已是公认的具有良好细胞相容性的材料，由此可说明含氟聚合物薄膜与钛合金一样具有良好的细胞相容性； 根据相对增殖率结果显示，不同时间点 均大于 90%，根据 16175用有机硅材料生物学评价试验方法中的毒性评分标准56， 1 天时的细胞毒性等级为 1 级， 2、 4 天时 高于 100%，细胞毒性等级为 0 级，无细胞毒性。 929 细胞与材料共培养的形态学观察 图 细胞与材料共培养照片 (100) (a):阴性对照组 ; (b): (c):细胞与材料共培养 2 天时，在倒置相差显微镜下观察照片显示（图 c)材料周围有细胞生长，且生长状态良好，形态正常，与对照组 (a)、（ b）无明显区别，表明含氟聚合物薄膜对 胞无毒性，具有良好的细胞相容性。 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 20 结 电化学腐蚀结果表明，含氟聚合物薄膜对比钛合金具有较好的耐腐蚀性能； 氟聚合物薄膜无细胞毒性。故含氟聚合物薄膜对且无细胞毒性，其在种植体改性方面具有潜在应用价值。 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 21 第 四 章 钛合金 表面 含氟聚合物薄膜 对成骨细胞的生物学性能影响 目前，钛合金表面的修饰主要分为粗化和涂层两大类。粗化可增加表面张力，对于细胞的黏附、生长、增殖及分化具有积极作用 57；表面涂层目前研究较多的是羟基磷灰石涂层，其具有良好的骨传导特性，可提高种植体的生物活性，加速种植体与骨组织的整合过程，提高种植体与骨界 面的结合强度。但是这些方法都不同程度的弱化了基底材料表面的强度，增大了材料表面的粗糙度和亲水性。作为植入材料，表面粗糙度和亲水性的增大势必会增加菌斑附着、生长和繁殖的机率，从而增大了发生种植体周围炎及骨吸收的机率 58。因此，一种使钛合金表面既能增加细胞黏附又能避免增大粗糙度的改性方法显得尤为 重 要。 成骨细胞 是骨组织形成的主要细胞，其 与植入材料之间的相 互作用一直都是研究的重要问题 59。所以，用成骨细胞来评价种植体材料的相容性更为可靠、科学 60, 61。 骨细胞 是体外研究成骨过程的典 型细胞株 62，对比原代成骨细胞具有易于培养、细胞稳定性好、低血清需要等特点，其广泛应用于骨组织材料的研究领域 63。 料和方法 料、试剂及仪器 实验材料： 金 样品预备同第二章，样品简记为 ；钛合金表面含氟聚合物薄膜的制备同第二章，样品简记为 ； 骨细胞（第四军医大学） 实验试剂： 养基（美国 司 ）；胎牛血清（美国 司）； 国 司）； 国 司）； 二醛溶液（美国 司）；吖啶橙（美国 司）；碱性磷酸酶 剂盒（美国 司）；骨钙素 剂盒（美国 司）。 实验仪器： 荧光显微镜 （日本 司 ）；其它 同第三章。 实验溶液准备： 兰州大学硕士学位论文 钛合金表面含氟聚合物薄膜的细胞相容性研究 22 1) 养液的配制 取 1 袋 剂加入到 800蒸水中，磁力搅拌使其充分溶解，加入分析纯 右搅拌溶解，用 1 整溶液 在 间，三蒸水定容至 1000器过滤除菌，分装 于无菌玻璃瓶中， 4冰箱保存备用。 2) 啶橙磷酸缓冲液配制 64 吖啶橙原液配制，取 啶橙，溶于100蒸水中，置于 4 冰箱避光保存； 磷酸缓冲液配制 ， 称取三蒸水 1000 a 液，称取 三蒸水 1000b 液，取 a 液 70ml b 液 430制成 磷酸缓冲液 ；取吖啶橙原液1 份加 9 份 磷酸缓冲液 配制成 啶橙磷酸缓冲液。 3) 液配制 称取 15I、 橼酸钠，加入 解液 三蒸水至 1004冰箱 避光保存。 骨细胞的培养 骨 细胞 复苏于 含 10%胎 牛血清、 100 U/霉素和 100 U/养液的细胞培养瓶中 ， 置于 37 ， 5% 细胞培养箱中培养， 待细胞 生长 密度约占 培养瓶 底面积 80%，用 酶充分消化 、传代， 选择传代 3 代以上、处于对数生长期并生长状态良好的细胞 用于实验。 骨细胞增殖检测 1) 样品准备 同第三章。 2) 细胞接种 将处于对数生长期的 胞用 酶消化，细胞悬液吹打混匀，用血球计数板对细胞进行计数、稀释，