【毕业学位论文】（Word原稿）细菌右旋糖苷蔗糖酶基因的克隆与表达微生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 细菌右旋糖苷蔗糖酶基因的克隆与表达 F I 摘 要 右旋糖酐 (是一种以 (1， 6) 糖苷键为主的葡聚糖，具水溶性，可作为代血浆 、金属离子载体和抗凝结剂等，在医药、食品、饲料工业中有广泛应用。右旋糖苷蔗糖酶 (是一种 葡萄糖蔗糖酶 (又叫 葡萄糖基转移酶 (，能催化蔗糖合成右旋糖酐。主要来源于乳酸菌属的 链球菌 (、 明串珠菌 (和一些烟草植物细胞。天然菌株产酶量低，酶与粘稠的产物形成混和物，不利于酶的分离纯化，制约了酶的结构 功能研究和产物的应用。本研究的目的是通过基因工程手段得到高表达 右旋糖苷蔗糖酶的基因工程菌株，从而用于右旋糖苷蔗糖酶结构与功能的研究，为右旋糖酐的生产和应用奠定基础。 本研究以 肠膜明串珠菌 因组为模板进行 增获得了编码右旋糖苷蔗糖酶的基因， 长约 并 将它 克隆 到表达载体 )中， 进行全基因序列测序 ，并 将重组表达载体 )化到表达菌株 。 析表明重组蛋白成功表达，蛋白质分子量约为 170件分析其占菌体总蛋白的 本研究优化了 重组蛋白的表达条件 和 泳条件 。 检测到重组酶活性为 液。对重组酶的酶学性质做了研究，其最适反应条件是 30 和底物蔗糖浓度为 10%。并将重组酶与天然酶的酶学性质做了比较， 虽然重组酶在 定性和热稳 定性方面要差一些，但在最适反应 、 最适反应温度 和 最适反应底物浓度方面几乎吻合 。 析表明重组酶所产右旋糖酐与天然右旋糖酐相同。最后对重组蛋白进行了初步的纯化 ， 并进行了免疫印迹鉴定 。 关键词 ：肠膜明串珠菌，右旋糖苷蔗糖酶，基因，克隆，表达 is of (1, 6) It is be as or in is of C to in in to to it is to or it is to of In CR of NA ), of as a of 70 of by of of up of 30C 0%. A of in of pH of a so of 一章 引言 . 1 旋糖酐简介 . 1 聚糖蔗糖酶研究 进展 . 2 介 . 2 因工程 . 4 旋糖苷蔗糖酶的研究进展 . 5 构特征 . 5 用机制 . 5 源表达研究 . 6 望 . 7 究目的与意义 . 8 验内容和技术路线 . 8 验内容 . 8 术路线 . 9 第二章 肠膜明串珠菌 然酶研究 . 10 料与方法 . 10 料 . 10 法 . 11 果 . 13 膜明串珠菌的菌落形态 . 13 白标准曲线 . 13 . 13 活性计算公式 . 13 体生长曲线及 化曲线 . 13 泌蛋白量和粗酶活变化曲线 . 14 酐产量 . 14 定性分析 . 16 稳定性分析 . 16 适反应 . 16 适反应温度 . 17 适反应底物浓度 . 17 目 录 3 金属离子及其 他因子的影响 . 18 论 . 18 然菌株生物学背景研究方法 . 18 然酶的获得方法 . 18 第三章 右旋糖苷蔗糖酶基因的克隆及表达 . 19 料和方法 . 19 料 . 19 法 . 23 果 . 31 旋糖苷蔗糖酶基因的获得及重组载体的构建 . 31 组子的 鉴定 . 33 的蛋白的表达 . 38 的蛋白的优化表达 . 39 组蛋白的获得 . 41 组蛋白活性的鉴定 . 43 组 蛋白酶学性质分析 . 44 组酶作用产物的鉴定 . 46 组蛋白的初步纯化 . 47 论 . 48 旋糖苷蔗糖酶基因和右旋糖苷蔗糖酶 . 48 旋糖苷蔗糖酶基因的表达 . 49 组酶与天然酶的酶学性质分析比较 . 51 组酶产物的鉴定 . 51 组蛋白的初步纯化及免疫印迹鉴定 . 52 第四章 结论和展望 . 53 参考文献 . 54 致谢 . 59 作者简历 . 60 V 插图和附表清单 1. 图 1旋糖酐结构式 . 1 2. 图 1克隆的葡聚糖蔗糖酶的一级结构示意图 . 2 3. 图 1 70 家族的葡聚糖蔗糖酶二级结构图 . 3 4. 图 2膜明串珠菌的菌落形态 . 13 5. 图 2白标准曲线 . 13 6. 图 2. 13 7. 图 2体生长曲线及 化曲线 . 14 8. 图 2泌蛋白量和粗酶活变化曲线 . 14 9. 图 2酐产量图 . 15 10. 图 2然粗酐 . 15 11. 图 2然酶 催化 产物 的 析 图 . 15 12. 图 2然酶的 定性 . 16 13. 图 2然酶的热稳定性 . 16 14. 图 2然酶 最适反应 . 17 15. 图 2然酶 最适反应温度 . 17 16. 图 2然酶 最适反应底物浓度 . 17 17. 图 3达载体 )图 谱 . 19 18. 图 3膜明串珠菌基因组 核酸凝胶电泳图 . 32 19. 图 3基因组 模版 果 的核酸凝胶电泳图 . 32 20. 图 3-4 )质粒 的凝胶电泳结果 . 33 21. 图 3的基因和 )质粒 双酶切结果 的 凝胶电泳图 . 33 22. 图 32 个转化子质粒电泳图 . 34 23. 图 3组质粒的 证 . 34 24. 图 3组质粒的双酶切 验证 . 35 25. 图 3种方法得到的目的基因 . 35 26. 图 3组子在三种培养基中的生长曲线 . 38 27. 图 3组蛋白诱导结果 的蛋白电泳图 . 38 28. 图 3A， B) 蛋白 电泳条件优化结果 . 39 29. 图 3组蛋白在不同培养基中表达 的蛋白电泳图 . 40 30. 图 3同 度对重组蛋白表达的影响 . 40 31. 图 3的蛋白随诱导时间的变化 . 41 32. 图 3的蛋白的可溶性鉴定 . 41 33. 图 3种裂解方式 比较的蛋白电泳图 . 42 34. 图 3体裂解沉淀在尿素梯度缓冲液中 可溶 部分的蛋白电泳结果 . 42 35. 图 3体裂解沉淀在尿素梯度缓冲液中不溶 部分的 蛋白电泳结果 . 43 36. 图 3组酶活力随菌体生长的变化曲线 . 43 7. 图 3解方法对酶活性的影响 . 44 38. 图 3组酶的 定性 . 44 39. 图 3组酶的热稳定性 . 44 40. 图 3组酶 最适反应 . 45 41. 图 3组酶 最适反应温度 . 45 42. 图 3组酶 最适反应底物浓度 . 46 43. 图 3层层析分析重组酶与天然酶的 催化 产物 . 47 44. 图 3组酶 与天然酶 催化 产物 的 析 图 . 47 45. 图 3A,B)目的蛋白的纯化结果 . 48 46. 图 3组酶作用产物 . 51 1. 表 1主要特点 . 4 2. 表 1源于 的右旋糖苷蔗糖酶基因及其表达 . 6 3. 表 2属离子及其他因子对 天然 酶活性影响比较 . 18 4. 表 3属离子及其他因子对重组酶活性影响比较 . 46 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 旋糖酐简介 右旋糖酐 (， 又名葡聚糖 ， 是若干葡萄糖脱水形成的聚合物，分子式为 (n。上世纪 现制糖中所产生的粘液真正组分为 由 葡萄糖基组成的多聚糖，因为它溶于水，且具有强烈的右旋性，故称为右旋糖酐。它是世界上最早发现的并较早作为血浆代用品的微生物多糖。其结构式如图 1示 ， 主要由葡萄糖 (1糖 苷键连接而成 ， 同时还杂有 (1和 (1糖 苷键连接形成的分支结构。 图 1右旋糖酐结构式 he of 旋糖酐为白色的无定形粉末固体 ， 无臭无味 ， 易溶于水 ， 不溶于乙醇。在常温下或中性溶液中可稳定存在 ， 遇强酸可分解 ， 在碱性溶液中 端基易被氧化 ， 受热时可逐渐变色或分解。右旋糖酐溶于水中能形成具有一定粘度的胶体液 ， 在生理盐水中 ， 6%的右旋糖酐液体与血浆的渗透压及粘度均相同 ； 中分子右旋糖酐 平均 分子 量 约为 40与血浆蛋白及球蛋白分子的大小相近 ，在人体内会水解生成葡萄糖而具有营养作用。 医药上右旋糖酐的应用很普遍。右旋糖酐胶体液具有扩充血容量、维持血压的功效 ， 供出血及外伤休克时急救用。右旋糖酐在人体内水解后会转变成较低分子量的化合物 ， 与血浆具有相同的胶体特性 ， 会迅速代 谢成葡萄糖 ， 可作为血浆代用品。中分子量右旋糖酐的排出较慢 ， 作用时间可达 6h， 是外伤、大量失血时急救用药 ； 小分子及低分子右旋糖酐还能改善微循环 ， 消除血管内红细胞聚集 ， 防止血栓形成及渗透利尿的作用 ， 可用于治疗急性失血性休克、心肌梗塞、脑血栓、脑供血不足、周围血管病及防止弥散性血管内凝血和肾功能衰竭等功效。中国药典 2000 年版收载了 70， 40 和 20 三个规格的右旋糖酐 (王其宇 ， 2001)。右旋糖酐可以作为抗癌药物载体溶液具有很好的疗效 (邢文阁等， 2000)。右旋糖酐加入到生物玻璃中 还 可作为骨移植的代替物。 用高 碘酸活化后的右旋糖酐与 超氧化物岐化酶 ) 分子的氨基共价结合，使 酶活力显著提高，增加了稳定性，降低 了抗原性 (罗瑶 ，古志平， 1998)。用高碘酸活化后的右旋糖酐对大肠杆菌 修饰后 的酶 ，对底物的亲和力 虽然 未发生变化，但抗胰蛋白酶水解能力明显提高，抗原性显著减弱 (吴梧桐等， 1997)。 低分子量右旋糖酐 (0007000) 与氢氧化铁经一系列化学反应形成的络合物称右旋糖酐铁，又叫葡聚糖铁。是治疗缺铁性贫血的有效制剂。曾有报道，妊娠中后期每日服用右旋糖酐铁对防 治孕妇和婴儿贫血有重要作用，它既能改善孕妇 量等指标 ，并降低孕妇妊娠后期的中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 贫血患病率，也能提高婴儿 量和降低婴儿贫血患病率。 右旋糖酐在食品工业上主要作饮料和糕点制作中的稳定、保湿、增稠剂和增量剂。 聚糖蔗糖酶研究进展 人们发现葡聚糖蔗糖酶是因为其产物是粘稠的多糖物质， 这种 多糖物质 是成龋因子。然而，随着人们对其深入研究发现， 来源不同的 葡聚糖蔗糖酶 在结构和功能上 具有 一些 差别， 它们 催化生成 含有 不同 糖苷键的 葡聚糖，这些葡聚糖在工业、食品、医药等行业有广阔的应用前景。葡聚糖蔗糖酶 ( 英文名 名葡萄糖基转移酶， 催化部分葡萄糖 糖基分子从活性供体分子到特定的受体分子的转移，形成糖苷键，主要来源于链球菌属和肠膜明串珠菌。 介 类 链球菌生产的两种不同的葡聚糖蔗糖酶 (简称 (1) 6要生成可溶于水的 ， 以 (1糖苷键为主的葡聚糖，叫做 1， 6 于 也叫做右旋糖苷蔗糖酶。 (2) 3要生成不溶于水的以 (1糖苷键为主的葡聚糖，叫做 1， 3 也 属于 肠膜明串珠菌生产的葡聚糖蔗糖酶 (一般叫做右旋糖苷蔗糖酶， 称 于 生成 1， 6 或含有 (1糖苷键，有时还有 (1和 (1糖苷键的 1， 6做右旋糖酐。 肠膜明串珠菌 成一种交替酶， 属于 催化生成由 (1和 (1糖苷键交替连接的葡聚糖，叫做 实际上，无论哪种葡聚糖蔗糖酶，都会生成可溶性的和不溶性的葡聚糖链。目前对可溶性葡聚糖的研究 相对较多 ， 而 对不溶性的葡聚糖的研究却 较 少。其实，不溶性葡聚糖与可溶性葡聚糖一样，具有很高的工业应用价值。 构与功能分析 目前， 很多 关于 构和功能的研究 表明 ，虽然每种蛋白有其各自的特点，但是它们的总体结构是相同的。 图 1克隆的葡聚糖蔗糖酶的一级结构示意图 A，信号肽； B，可变域； C， D， of A, B, C, D, 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 3 图 1 70 家族的葡聚糖蔗糖酶二级结构图 变区， 聚糖结合域 he of 0 级结构中， 有催化水解蔗糖的功能； (不同的酶，重复单元的个数不同 )，具有转移酶活性， 其 将切割下来的葡萄糖残基转移到葡聚糖上 。 分之二属于 (含信号肽 )；三分之一属于 葡萄糖基转移酶都具有 ( /)8 折叠 桶的二级结构。其特点是位于蛋白质核心位置的 8 个 (能够 与位于蛋白表面的 8 个 活性机制 葡萄糖基转移酶催化部分糖基从活性供体分子到特定的受体分子，形成糖苷键。糖的供体分子可以被转到天然，如双、多糖类， 1磷酸核苷酸 ( 生成 含有大于50%的 (1糖苷键和 (1 (1或 (1其它糖苷键 的葡聚糖。 无论葡萄糖残基单元的目的地是哪里，它们的转移首先都要构成一个共价的葡萄糖基 糖 是此反应唯一的天然基质 ， 可以激活催化位点来诱导酶反应。蔗糖被切割成葡萄糖残基的能量完全用于催化各种反应。葡聚糖是自动聚合成一条单链，其延长是由唯一一种酶催化的。有许多假说推断葡聚糖的合成机制，最近十几年动力学方面的研究表明葡萄糖基转移酶与葡聚糖的结合位点和葡萄糖基转移酶与蔗糖的结合位点是分离的。这一假说同时也被葡萄糖基转移酶序列和结构与功能关系的研究所证实。假说中葡聚糖的合成分为三个步骤：起始、延伸和终止。最后一步即葡聚糖与酶的脱离。 开始：现已证实外源葡聚糖可以引发反应的开始。 延伸：自动聚合链的延伸机制 仍然没有被研究清楚。现有两种假说，一种是延伸发生在葡聚糖链的非还原末端 (Sn 1994)；一种是延伸发生在葡聚糖链的还原末端 (1968)。两种假说的共同点是都要发生亲核攻击反应并形成葡萄糖基 终止：上面的反应重复发生，葡聚糖链就延伸下去。果糖是作为连到酶上的葡萄糖基的受体，并引导链的终止。 1974) 的动力学研究表明，反应有两个 底 物结合位点， 酶反应也证实了这一点。但是还有许多机制仍然未知。虽然为阐明葡萄糖基转移酶反应的机制已经进行了二十多年的细致透彻的研究，但 至今还 没有 令人 十分满意并 广为接受的理论 。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 4 因工程 被发现 70 多年，许多葡萄糖基转移酶的基因 已经被 克隆 得到，部分基因 已经进行了表达 和产物分析 工作。 表 1株 基因 葡聚糖 分子量 (作者 ，年代 55 et , 1983 S5 et , 1986 7% (113% (1150 et , 1986 6% (18% (17% (1) 140 et , 1988 0% (170% (1155 et , 1989 M7 1986 150 et , 1987 8% (112% (1160 et , 1987 0% (190% (1147 et , 1990 et , 1985 et , 1985 7% (17