【毕业学位论文】（Word原稿）利用AFLP标记与无毒基因构建小麦白粉菌的遗传图谱植物病理学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 利用 记 与无毒基因构建 小麦白粉菌的遗传图谱 A ap ap I 摘 要 本研究选 用小麦白粉菌（ 两个菌株 及它们的杂交后代作为实验材料，对其无毒性进行遗传分析，利用 记对杂交后代进行了分析，初步构建了小麦白粉菌的遗传图谱。 1：对小麦白粉菌 交所得的 95 个后代的无毒性进行了遗传分析。结果表明：小麦白粉菌杂交群体对应于抗病基因 无毒性 /毒性分离比为 1:1，表明无毒性受 1对基因控制；对应 无毒性 /毒性呈现 3:1 的分离比例，表明无毒性受 2 对基因控制；对应无毒性分离比为 15:1，表明无毒性受 3 对基因控制。其中与抗病基因 对应的无毒性遗传分析为首例报道。 2：在遗传分析的基础上，利用 记技术进行亲本与后代间的连锁分析，所筛选的 208对引物中有 105 对引物组合在亲本间存在差异。利用筛选出的 105 对在亲本间有明显差异的引物组合对杂交后代进行 析， 22 对引物组合共产生 51 个多态性位点。作图分析表明， 在 件下， 51 个位点分别连锁在 5 个连锁群上，每个连锁群上分别有 6 个， 5 个， 2 个， 2 个，2 个 记 位点 ，获得 总长 125 均距离为 遗传图谱。由于作图的标记数目较少，有 34 个标记未发现连锁关系。构建的连锁图有待于进一步饱和。 本文还就小麦白粉菌无毒基因的遗传分析， 记技术在小麦白粉菌研究中值得注意的问题等进行了讨论。 关键词 小麦白粉菌 无毒基因 遗传分析 遗传图谱 he of in a 17. is by is by of is by of m2 is A 08 to NA 05 of NA 22 of to 8 7 25 cM 4 to be be so be to A is 录 第一章 绪论 . 1 麦白粉病概况 . 1 谷类白粉菌无毒基因的遗传研究、分子标记与定位 . 2 谷类白粉菌无毒基因的遗传研究 . 2 谷类白粉菌无毒基因的分子标记与定位 . 3 位克隆法与 记技术 . 3 物致病真菌遗传图谱的构建 . 5 谷类白粉菌遗传图谱的构建 . 5 它致病真菌遗传图谱的构建 . 6 本研究的目的、内容和意义 . 9 第二章 小麦白粉菌无毒基因遗传分析 . 10 料与方法 . 10 验材料 . 10 验方法 . 10 果与分析 . 11 结 . 12 第三章 小麦白粉菌遗传图谱的构建 . 13 剂及仪器 . 13 剂 . 13 器设备 . 13 究方法 . 13 麦白粉菌基因组 提取 . 13 作程序 . 14 物的电泳检测 . 16 据分析 . 16 果分析 . 17 麦白粉菌基因组 提取 . 17 因组 切、连接、预扩 . 17 本菌株多态性引物筛选 . 18 代群体 析及遗传图谱的构建 . 20 第四章 结论与讨论 . 24 麦白粉菌无毒基因的遗传分析 . 24 记技术在小麦白粉菌研究中值得注意的问题 . 25 麦白粉菌基因组 取 . 25 因组 酶切及连接 . 25 丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色 . 25 麦白粉菌遗传图谱的构建 . 26 参考文献 . 27 致 谢 . 33 作者简历 . 34 附 表 . 35 第一章 绪论 1 第一章 绪论 麦白粉病概况 小麦白粉病是由布氏白粉菌（ 起的小麦生 产中的主要真菌病害之一，在全世界大多数小麦产区都有发生。 1900 年以前，欧洲就有报道 。 我国 1927 年首先发现于江苏省。小麦白粉病过去主要发生在冷凉、潮湿、多雨的地区。近些年来 由于小麦生 产中水肥 条件及 种植密度水平的提高以及感病品种尤其是单基因抗病品种大面积推广等原因，小麦产量问步提高的同时也为白粉病的发生流行提供了良好的田间环境，导致小 麦白粉病的发生面积日益扩大、危害程度也日趋严重。以我国为例，过去小麦白粉病主要分布在云、贵、川及沿海气候湿润、肥水条件较好的地区，现在我国各小麦产区均有发生。 1981 年全国小麦 白粉病大流行，发生面积达 287 万公顷。 1990间，因 性的丧失白粉病又连续在全国大发生，发生面积约占我国小麦种植面积的 40，造成小麦损失约 210 万吨（刘万才等， 1995）。近年来由于春季干旱，病害虽未再大流行，但年发病面积仍一直维持在 400 800 万公顷之间，目前仍是我国小麦生产的主要病害之一。 小麦白粉病可籍气流作高空远距离传播，流行性强，分布范围广，危害严重。对该病的防治主要采用“以推广种植抗病品种为主，化学防治和栽培防治为辅”的综合防治措施。化学防治具有立竿见影的效果，能在短期内对 大面积发生的病害进行有效的控制。但化学防治白粉病也存在着一些问题 (刘君丽， 2002)。例如白粉菌抗药性问题， 1981年英国首次报道了大麦白粉菌对三唑类药剂的抗药性（ T.， 1981），此时三唑类杀菌剂在欧洲仅使用了 5年。我国 1987年 开始对小麦白粉菌 进行抗性监测， 1991年 在山东发现三唑酮的抗 性菌，随之在四川也有报道 （ 刘君丽等， 1999） 。此外防治白粉病的药剂单一，苯并咪唑类杀菌剂由于抗性问题对小麦白粉病已失去防治作用，只有部份硫磺及复配剂在生产中应用。目前用于防治小麦白粉病的药剂主要是 甾醇生物合成抑制剂，而且 90%以上是脱甲基抑制剂的三唑类。三唑类杀菌剂不仅存在着抗药性问题而且还一直存在着药害问题，它所具有的植物生长调节作用在使用不当时也会出现影响产量的现象。 培育推广抗病品种是防治小麦白粉病最为经济有效的措施，但由于病菌的基因重 组、变异、基因迁移、外源毒性基因的渗入 , 基因的搭载及寄主的选择作用等对该菌群体遗传多样性产生很大的 影响。当病菌产生能克服小麦抗白粉基因的毒性小 种 后，新小种便得以良好 地 哺育而迅速发展，引起生产品种丧失抗性，并在环境条件适合时造成病害的大流行。 小麦白粉菌的毒性进化 是导致品种抗性丧失的主要原因之一，如 向齐君 , 1996),以及农科院植保所白粉病组近年来毒性监测结果都证实了这一点 (段霞瑜 , 1998)。为此我们必须寻找新的途径，获得持久抗性的品种来解决这个问题。 早在 20世纪 40年代， 因对基因”假说。此假说的核心内容是对于寄主中的每一个显性抗性基因， 第一章 绪论 2 基因 ( 病菌的无毒基因是病原物遗传因子， 其功能是直接或间接地编码激发子；而植物抗病基因 (则编码激发子的受体。当激发子与受体结合即 与 性互作时，诱发寄主防卫反应的表达，寄主才表现出抗性。其它情况下寄主均表现为感病。上世纪 60年代，包括大、小麦白粉病在内的其它一些病害的基因对基因互作关系就已得到了阐述 (et 1959； 1960)。因此， 用小麦品种抗性来防治白粉病时，寄主特异抗性的表达不仅取决于该品种本身的抗病基因型，还取决于小麦白粉菌的无毒基 因型。研究病原菌无毒基因的结构及功能，有助于了解病原物与植物的识别机制，对认识植物的抗病性及病害的防治都具有重要意义。 谷类白粉菌无毒基因的遗传 研究 、分子标记与定位 谷类白粉菌无毒基因的遗传研究 国外利用 分子遗传学对很多大麦品种与白粉菌分离物的互作 进行 研究 ，结果 表明 它们的互作符合基因对基因互作的模型。 994)对大麦白粉菌两个菌株 交得到的 166 个后代菌株进行无毒基因遗传分析，得到对 毒性 /毒性的 分离比为 1:1，菌株的无毒性受 1 对基因控制；对 无毒性 /毒性为 3:1 的分离比例，表明菌株的无毒性受 2 对基因控制。 995)对大麦白粉菌两个菌株 交得到的 57 个后代，以及 交得到的 140 个后代群体一同进行了无毒基因的遗传分析。结果表明对 无毒性 /毒性分离比为 1:1，菌株的无毒性受 1 对基因控制；而与抗病基因 应的菌株的无毒性是由2 对基因 同控制的。 国内向齐君等 (1995)采用卡宝品红染色对小麦白粉菌的染色体数目进行了研究，认为小麦白粉菌具有 n=8 条染色体。 (2004)将获得的大麦白粉菌的遗传连锁数据与我国小麦白粉菌细胞遗传学显微照片结合起来分析，推断大、小麦白粉菌很有可能存在相同的染色体数，都具有n=11 条染色体。 1999 年，本小组通过室内人工杂交，获得了小麦白粉菌 6 个杂交组合的有性世代，并对其中的一个组合 交 后代的无毒性遗传进行了研究，发现对应于小麦抗白粉病基因 无毒性分别由一对基 因控制， 对应于无毒位点之间完全连锁，在杂交群体中共分离；罗琼 (2002)进一步结合 法对这两个菌株的 89 个后代菌株进行了无毒基因遗传分析 ， 发现对应于抗病基因 无毒性分别由 1 对基因控制，并且对应的无毒基因 重组率为 对应于 无毒性分别由 2 对基因控制， 对应于 对基因控制； 李志英 (2003)对 小麦白粉菌两个菌株 交 所得的74 个 后代进行毒性鉴定得到： 无毒性 /毒性 分离比为 1:1，符合 1 对基因控制；对 无毒性 /毒性为 3:1 的分离比例 ， 无 毒性受 2 对基因控制，对应的 无毒性 /毒性为 15:1 的分离比例，表明受 3 对基因控制。 这种对传统的“基因对基因”假说中一一对应关系的偏离与国外在大麦白粉菌中的研究结果是一致的。 第一章 绪论 3 谷类白粉菌无毒基因的分子标记与定位 国外从 80 年代后期起，对大麦白粉菌的 行了分子标记的研究，并取得了积极的结果。990)、 994)，先后利用 毒性无毒性构建了 2 个遗传图谱，其中 连锁图中有 7 个无毒基因即 人用两个 含有 8 个无毒基因 差异 的菌株杂交 ，对 获得的 84 个后代菌株进行 记，建立了有 11 个连锁群，总长为 1205 遗传图谱，并推断出白粉菌的染色体为 n=9 或 n=10，将 8 个无毒基因定位到三个连锁群中，并获得 2 个距 4 标记，发现 距 6 得 1 个距 2 个距 为 1 标记 （ 2002年，个人交流）， 目前他们 已完成 对 毒基因 的 克隆（ 2005 年，个人交流）。 990 年工作的基础上，于 1994 年构建了 库。 2002 年， 人选用两个含有 7 个无毒基因差异的大麦白粉菌菌株杂交，对获得的 81 个 交后代进行了遗传连锁分析，建立了具有共 34 个连锁群、总长为 2114 遗传图谱，定位了 7 个无毒基因即 国内利用分子标记对小麦白粉菌无毒基因进行研究开始地比较晚。段霞瑜（ 1998）首次利用记对白粉菌群体的进化进行了初步 地 探讨，结果表明 增产生的多态性位点可以遗传到子代中，并可产生重组子。这一结果为小麦白粉菌连锁图的产生和无毒基因的分离奠定了基础。罗琼 （ 2002） 在遗传分析基础上，使用 法寻找和无毒基因连锁的 记。用随机引物 行 析时，对 毒性亲本 产物中有一条分 子量约为 带，而毒性亲本 扩增产物中没有此带。进一步分析发现 该标记与无毒基因 密连锁，遗传图距仅为 李志英（ 2003）在遗传分析的基础上，利用 记技术进行白粉病菌亲本与后代之间的连锁分析。这些研究为白粉菌的基因组研究奠定了基础。 位克隆法与 记技术 绝大多数病原菌无毒基因的生化性质及功能目前尚未确定，克隆这类无毒基因的主要途径是通过图位法和插入突变法。 图位克隆 (称定位克隆 ( 1986年首先由剑桥大学 基本工作思路为：首先将目的基因精确定位在分子标记连锁图上。利用与目的基 因紧密连锁的标记筛选大片段 如 并构建含目的基因区域的精细物理图谱， 利用该物理图谱采用染色体步行 (方法逐步逼近目的基因。若筛选的标记与目的基因连锁十分紧密或共分离，无需步移就可直接着陆，获得含目的基因的大片段克隆，再将大片段克隆作亚克隆分析或用大片段克隆作探针筛选 而将目的基因确定于 一个较小的 段上，进一步作序列分析和目的基因功能鉴定。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的 也无需预先知道其表达产物的有关信息，这一特点恰恰适合于小麦白粉菌基因组的研究。 第一章 绪论 4 实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。实质上，分子标记是一个特异的 其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。迄今为止，已 有几十种技术可用于分子标记的筛选。这些技术有别于最初的形态标记、细胞学标记和生化标记， 一般表现出稳定、可靠的特点，有 的使用成本也相对较低，特别适用于筛选与目标基因紧密连锁的标记，尤其是与目标基因共分离的标记。 本研究所选用的分子标记是 子标记。 析是 人在 1994 年发明的，荷兰 司拥有该项技术的专利。 析是 结合的一种技术。其原理是基因组 过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为 板。接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为 应引物的结合位点。引物由三部分组成 ： (1)核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；（ 2）特异性酶切序列；（ 3）引物 3 了达到选择性扩增的目的，专用引物在酶切位点序列的 3 数量不等的碱基，这些延伸的碱基组成是随机的，因此，通过调整引物 3 可调节 物的特异性和数量。 基本反应程序包括： (1)模板 制备； (2)两个不同的限制性内切酶 对 模板行酶切 ； (3)限制性酶切片段末端连接双链接头； (4)用与接头限制性酶切位点序列互补的引物对连接产物进行扩增； (5)预扩增产物再次用选择性引物扩增； (6)扩增产物的凝胶电泳分析。 测的是分布于某种生物全基因组上的 段，它综合了 术的优点，具有自身独特的魅力。其独特的优点在于： (1)理论上可产生无限多的 记。由于 此理论上 产生无限多的标记数，并可覆盖整个基因组。 (2)多态性高。 记具有比 记可靠、 经济、有效的揭示物种多态性水平的能力。每个反应产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到的 标记数为 50，能够在遗传关系十分相近的材料间产生多态性，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。 (3)量少，检测效率高。 (4)可靠性好 , 重复性高。 析采用特定引物扩增 , 退火温度高 ,使假阳性降低，可靠性增高。 (5)对 板质量要求高 , 对其浓度变化不敏感。 应对模板浓度要求不高，在浓度相差 1000 倍的范围内仍可得到基本一致的结果。目前， 记已广泛应用于 植物的 抗病基因 、病菌的无毒基因 的分子标记、遗传作图及遗传多样性检测等领域。 目前已经克隆到植物病原真 菌的无毒基因包括：番茄叶霉菌 (的无毒基因 an et 1992)、 et 1994)、 et 1999)、et 2002b)、 et 1997)、 et 1998)、 et 2000)、 et 2000)，大麦云纹菌（ 的 et 1995)，致病疫霉菌 (的 et 1998)，稻瘟菌 (et , 2000)、 et 1998)、 et 1995)、et 1995)、 et 2004)等无毒基因，大麦白粉菌 (中的 2个无毒基因也已完成克隆。其中稻瘟菌的 麦白粉菌的 2005， 个人交流 ） 都是通过图位法克隆的。 第一章 绪论 5 物致病真菌遗传图谱的构建 最初构建遗传图谱时主要是利用蛋白质或免疫学多态性位点作为标记来研究这些标记位点与所研究性状之间的相互关系，从而建立标记系统与性状之间的连锁关系。但由于已知多态性蛋白 位点较 少，等位基因的数目有限，无法获得足够的信息量，准确性差和检测技术的繁琐等因素， 促使人们设法从 寻找可靠的标记系统。用于作图的 征称为 记，它至少应具备以下几个条件： （ 1） 任何一种构建遗传图谱时所使用的标记，一个重要的属性就是多态 性的存在。 （ 2） 信息量大，基因组内密度大。 （ 3） 遗传共显性，即可以在群体中区分 3种基因型。 （ 4） 成本低，操作简便，适合作大规模的基因型分析，特别适合于自动化分析 (赵志辉， 2005)。随着分子生物学的发展先后出现 三种序列特征 满足此要求 ( 2002)。一是20 世纪 70 年代中后期建立起来的限制性片段长度多态性 (二是简单序列长度多态性 (它有两种类型：小卫星 (微卫星 (随后其它标记系统如扩增片段长度多态性 (酶切扩增多态性序列 (也相继建立。这些标记位点在基因组内不但含量丰富，多态性较好，且符合孟德尔遗传规律 ,因而可以为连锁分析提供足够多的遗传信息。加之由于 大降低了检测成本并提高了检测过程的自动化程度；三是单核苷酸多态性(这种标记的开发和应用为 片技术应用于遗传作图提供了基础，在基因定位的 研究中就有着其它标记系统不可比拟的优越性和潜力。 遗传图谱是根据遗传重组试验设计的表示同一染色体 子上不同基因之间的排列顺序及相对距离，这样的一种线性图称为遗传图谱。 遗传图距的单位，表示 1%的重组率。遗传图谱现已成为所研究的目标生物传统遗传学、群体遗传学及分子遗传学研究的基 础。从上世纪 80年代人们便开始了植物致病真菌遗传图谱的构建工作，经历了 20 多年的时间目前已有 包括小麦白粉菌在内的 12 种植物致病真菌构建了遗传图谱。 谷类白粉菌遗传图谱的构建 麦白粉病菌 (传图谱的构建 大麦白粉菌的遗传图谱分别由英国和丹麦的两个研究小组完成。 1990年丹麦的 步地构建大麦白粉菌 (遗传图谱。共有 31个 个毒性位点被定位在 7个连锁群中，其中 2个连锁群既包括 此，在 性位点及大麦白粉菌自身的研究。 1994年英国的 用 大麦白粉菌基因组 构建了大麦白粉菌 (遗传图谱。该图谱有 7个连锁群，共包括 22个位点。 1999年 第一届国际白粉病研讨会上公布了大麦白粉菌 (遗传图谱。该图谱由 7个无毒基因、 1个交配型位点和 304个 第一章 绪论 6 2002年 构 建了一个大麦白粉菌 (遗传图谱（个人交流）。该图谱由 8个无毒基因与 333个 12个连锁群 , 总长为 1205 发现 获得了 1个距 2 个距 2002年 建了一个内容较丰富的大麦白粉菌 (传图谱。共创立了 34个连锁群，其中包括 182个 168个 (包含 42个反转录转座子位点， 99个 ， 7个无毒基因， 1个交配型位点。在 7个无毒基因中 定位在 34号连锁群中； 位在 29号连锁群中； 5和 25连锁群中。在无毒基因与分子标记之间位于 15号连锁群的 个 个 有利于 大麦白粉菌遗传图谱与其它真菌遗传图谱的构建有着明显的不同，它并不像其它真菌那 样有一定的继承性。两个小组对大麦白粉菌的研究成果很不吻合。 2个连锁群而4个连锁群。他们的结果又不能彼此说服对方，因此大麦白粉菌的连锁群数至今仍无定论，随之而来的是大麦白粉菌基因组的大小也不能得到一个定论。 麦白粉病菌 (传图谱的构建 小麦白粉菌 (大麦白粉菌 (同种不同专化型的植物病原真菌。通过对小麦白粉菌遗传图谱的构建而得出的结论可以与大麦白粉菌进行比较基因组学的研究，并可作为探讨生理专化现象的基础。目前国外还未见构建小麦白粉菌遗传图谱的报道，国内对小麦白粉菌遗传图谱的研究仍处于起步阶段，李志英于 2003年初步构建了该菌的遗传图谱。 2003年李志英在遗传分析的基础上利用 筛选的 200对随机引物中共有 25对引物组合在亲本间存在差异。其中一对引物 连锁，其遗传距离为 28.2 用筛选出来的 25对引物对杂交后代进行 3对引物组合共产生 39个标记。通过作图，将 22个位点分别定位在 7个连锁群中。 它 致病 真菌遗传图谱的构建 稻瘟菌 (是人们研究较深入的一种植物致病真菌， 于 1983 年便初步构建了该菌的遗传图谱。随着研究的不断深入， 全序列也已公布 最新的 稻瘟菌 遗传图谱中已包括 4 个 无毒基因 位点 在内的 262 个标记位点。 稻恶苗病菌 (以引起玉米恶苗病，其遗传图谱的构建中除包括一些常见的分子标记外也包括 身独有的一些基因的位点，如 雌性不育位点(孢子致死位点 (控制产生串珠镰刀菌毒素的 位点 (共计 634个位点。而一些特殊位点在遗传图谱中的定位有利于人们今后对其进行克隆。 麦类赤霉病菌 (目前为止已构建了两个 二者的连锁群数相同，遗传图谱的长度也 相似。没有出现其它真菌构建遗传图谱时不同图谱之间存在的连锁群数及图谱长度存在较大差异的现象。因此所构建出的遗传图谱具有较高的可信度。最新的遗传图谱中包括 35个位点。 致病疫霉病菌 （ 遗传图谱的构建是由 完成的。继 第一章 绪论 7 年构建第一个 致病疫霉遗 传图谱后又分别于 2001 年 和 2004 年对 1997 年构建的遗传图谱进行改进，完成了 6 个无毒基因的定位及连锁群的重新划分，最新的遗传图谱中包括 6 个无毒基因 位点在内的共计 508 个标记位点 。 大豆疫霉病菌 (新 的遗传图谱是 2002 年 建立 的， 共计 386 个位点， 包括 10 个无毒基因 位点 的较为饱和的遗传图谱，通过该图谱所提供的信息可以对某些无毒基因进行图位克隆。 莴苣霜霉病菌 (遗传图谱与 遗传图谱构建非常相似，在图谱中都定位了一定数量的无毒基因，并且所构建出的遗传图谱内容也非常丰富，都可以用来对无毒基因进行克隆。 油菜黑胫病菌 (引起油菜 黑胫病，该菌的遗传图谱中除一般常见的分子标记外还包括寄主特异性位点 (决定病斑的形成 )。该位点的定位将为今后对 病过程的研究奠定基础。 玉米小斑病菌 (迄今为止只构建了一个 且该图谱也不像其它菌的遗传图谱那样饱和 ， 共有 125个标记位点，在图谱中仍存在一些长度较大的缺口。 小麦根腐病菌 (遗传图谱中包含其它 菌遗传图谱中所没有的位点，即毒性基因位点 (该位点的定位有利于今后