【毕业学位论文】（Word原稿）饲料中腐马毒素(Fumonisins)测定方法的研究及其污染状况调查 农产品中重要有机污染物的检测硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 饲料中腐马毒素 (定方法的研究及其污染状况调查 A a on a on I 摘 要 真菌的寄生和真菌 毒素的产生，严重影响 了 农作物的产量，降低 了 农产品和饲料品质，造成 了 巨大经济损失 ，并对人类健康形成严重的威胁 。 目前国际上对农产品中真菌毒素污染的日益关注，使得各国都纷纷制定控制标准，以维护自己的利益。相比之下，我国对农产品中真菌毒素污染的研究和控制还处于起步阶段。所以，开发一套适合国情的准确、快速、简便的检测主要农产品中腐马毒素的方法，对推进我国腐马毒素残留限量标准的出台，提高我国农产品在国际市场竞争能力和严防国外不合格农产品向我国市场倾销，以及保证我国人民的食品消费安全，合理调配我国的谷物、饲料资源，都具有 重要的意义。 本文的综述部分首先介绍了真菌毒素的起源、分类和对人类社会的危害，并对真菌毒素控制标准和分析技术的国内外发展现状进行了综述，然后还探讨了真菌毒素预防和脱毒领域的最新进展。 本论文的试验部分主要对饲料中腐马毒素的高效液相色谱测定方法进行了研究。借鉴发达国家在该领域的研究成果，并结合我国实际情况，考察了样品前处理过程中的提取、纯化和分离等步骤中许多重要参数对腐马毒素回收率和检出限的影响，在进大量试验的基础上得到了令人满意的结果：提取剂采用甲醇 +水（ 3： 1， V/V），纯化柱采用 ，衍生剂采用 3 倍于样品体积，且保证衍生时间 6流动相采用甲醇 + 磷酸二氢钠（ 3： 1， V/V， 荧光检测器激发波长和发射波长分别为 335 440均回收率为 出限分别为 40/100/80 g/ 本研究的创新之处包括，国内首次应用高效液相色谱法实现对腐马毒素 良好分离，并在纯化过程中采用微型柱代替了传统柱，降低了方法的分析成分。另外，实际应用本方法所得到得到的国内部分地区食品和饲料中腐马毒素的污染数据，对将来国内腐马毒素相关标 准的制定具有一定的参考价值。 关键词 ：腐马毒素 真菌毒素 检测 控制标准 预防 脱毒 n s is of of of in of of s At to on in in to of as as of In of by is it is to an of in to of in of on of of of of to as as to of in or in to or in of A of to in of A of is of of of 3+1), of AX by a of 75+25). 35/440 of on of 1/3 0/100/80 kg of of of of 3 in AX of of 1/3 in by 录 第一章 真菌毒素概述 1 菌毒素的起源和分类 1 菌毒素的危害 9 菌毒素的产生 9 菌毒素的毒性 11 菌毒素对饲料的影响 12 菌毒素对家畜、家禽的影响 12 菌毒素对人类的影响 13 真菌毒素的控制与相关标准 18 析技术 22 菌毒素对农产品污染的预防和脱毒 27 防 27 毒 28 第二章 高效液相色谱法测定饲料中的腐马毒素 30 马毒素物理化学性质和毒性 30 理化学性质 30 性 31 品和饲料中腐马毒素测定的相关标准方法 32 验设计 32 品采集技术与方法 3 2 验材料和方法 3 4 验结果与讨论 36 品中腐马毒素的提取 36 品中腐马毒素的纯化和浓缩 46 马毒素的化学衍生 37 流动相的选择 39 加回收率和相对标准偏差 4 1 标法标准曲线和最低检出限 4 1 品和饲料中腐马毒素污染状况调查 4 2 第三章 结论 44 菌毒素综述 44 立了高效液相色谱法测定饲料中腐马毒素 44 天津、北京和湖北部分地区的饲用和食用玉米中腐马毒素污染状况进行调查 44 参考文献 46 致谢 51 作者简历 52 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 国官方分析化学师协会 国农业科研局 盟自由贸易区 联免疫吸附法 洲真菌毒素通告网络 盟 际粮农组织 美国食品和药品管理局 好农业实践规范 相色谱法 好卫生规范 好生产作业规范 好贮存规范 害分析临界控制点 效液相色谱 际癌症研究所 品添加剂联合专家委员会 方共同市场 时性最大允许日摄入量 相高效液相色谱法 阴离子交换柱 合国环境规划署 界卫生组织 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 真菌毒素概述 1 第一章 真菌毒素概述 菌毒素的起源和分类 真菌毒素（ 词来源于古希腊词汇 菌）和拉丁词汇 物）的组合。早在公元前七世纪，就存在一个祭祀 的节日（ 人们纷纷在 4月 25日这一天祈求 来保护他们的谷物和果树，因为在这段时间里农作物最 易受到霉菌的侵染。 关于人类真菌毒素中毒事件的最早记载是公元 8 16 世纪欧洲的麦角 碱 中毒 症 ， 其 症状曾在中世纪的圣像画中描述过。急性麦角中毒 会 产生 强烈的灼烧感、 幻觉和肌肉痉挛，进而发展为四肢动脉的持续性变窄 最终 发生坏死。由于麦角菌的菌核中会形成有毒的生物碱，所以这种疾病至今仍称为麦角中毒。 当时有许多患麦角中毒症的清教徒前往位于法国的圣安东尼神殿祈求神的治愈， 这一广泛流行的中毒现象， 因而也 被称为 “ 圣安东尼之火 ”或“灵火” 。 1942至 1948年间，前苏联至少有 10万人死于一种神秘的流行病。主要症状包括发烧、鼻喉 齿龈处流血、急性白血球缺乏症、脓血症和骨髓耗尽等，现在人们把这种病称为食物中毒性贫血（ 简称 与常见的微生物中毒相比，这些症状更像是放射性污染所致 1,3。后来的研究发现，由于战争时期劳动力十分缺乏，人们只好任由来不及收割的小麦在田间雪下越冬，这导致镰刀菌（主要为 . 量繁殖，并在自然的冻融循环过程中分泌出剧毒的 们食用后导致大规模的食物中毒。在靠近里海的 ，甚至有超过 60的居民受到了毒素侵害，死亡人数高达 10 1。这种疾病在上世纪较早期的 1932年和 1913年，甚至在欧洲的其它地区，也曾经爆发过 2。 1960年英国 爆发了造成 10万多只火鸡死亡的 “ 火鸡 ， 主要症状为 嗜睡 ， 翅膀下垂，凄叫，贫血，冠色苍白，腹泻，粪中带血，雏鸭脱羽，脚趾发紫，跛行，颈肌痉挛 ，死 亡 时角弓反张 。 经 解剖可见 有 肝出血、 胆管增生和 肾 脏 肿大 等病理现象 。 最终调查结果发现霉变鸡 饲料中的黄曲霉毒素 为罪魁祸首，这一事件首次引起了人们对黄曲霉毒素以及其它天然真菌毒素的广泛关注 。 许多国家政 府和国际组织，如 设有专门的科研机构对真菌毒素污染进行监测与研究。 真菌（ 指有细胞壁，无叶绿素，以寄生或腐生方式生存，少数为单细胞，多数为多细胞，能进行无性或有性繁殖的一类真核细胞型微生物 。其特点包括， 不能进行光合作用 ， 以生产大量孢子进行繁殖 ， 一般具有发达的菌丝体 ， 营养方式为异养吸收型 。 自然界中大约有 150 万种真菌，而目前已知的真菌还不到 7 万种。 按其形态 可将真菌分为 霉菌 丝状真菌 和 酵母 球状真菌 。其中一小部分霉菌不仅能寄生在生 长期的农作物上，中国农业科学院硕士学位论文 第一章 真菌毒素概述 2 而且还能感染收获后贮存中 的农产品。这些霉菌能够分泌出多种酶以便分解结构复杂、分子量大的有机物并利用它们为自己生长代谢之用。与此同时，许多霉菌还能分泌出一些分子量相对较小，与霉菌生长和主要代谢过程没有明显联系的次要代谢产物，这些物质主要来源于真菌初级代谢过程产生的一些化学物质，如多肽、氨基酸、苯酚和萜类化合物等。虽然这种次级代谢产物对真菌细胞的生长过程没有直接影响，却可以给真菌带来某些竞争优势，比如能够帮助寄生真菌入侵寄主组织，或者有助于清除生境中的竞争物种 4。 这些次要代谢产物的大多数对形形色色的生物的确能显示出生物活性。例如 ，对微生物和植物能显示出毒性的分别称之谓抗生素和植物毒素；而对动物显示毒性的则称之谓真菌毒素。根据宿主的范围，又可以将其分为非专化性毒素 (寄主专化性毒素 ( 根据真菌毒素作用的靶器官，还可将真菌毒素分为肝脏毒、肾脏毒、心脏毒、神经毒和造血器官等。 目前已知能产生致病毒素的霉菌主要有顶孢霉属（ ， 链格孢属（ ， 曲霉菌（ ， 毛壳属（ ， 芽枝霉属（ ，镰刀菌（ ， 拟青霉属（ ， 青霉菌（ ， 葡萄穗霉属（ ， 和木霉菌（ 5。其中，由镰刀菌产生的毒素就有 80 多种，如玉米赤霉烯酮，串珠毒素，腐马毒素，以及各种单端孢霉烯族类毒素等，由于种类多，毒性大，对农产品污染范围广，而且受其污染的食品和饲料造成人畜中毒甚至死亡的事件时有发生，所以被认为是最危险的污染物。 现已查明自然界 中 存在的真菌毒素 有 300 多 种 ，下表 1 中列出了常见的真菌毒素 和主要产毒真菌及其半致死剂量（ 表 1 常见真菌毒素和主要产毒真菌及其半致死剂量（ 菌毒素 中文名称 主要产毒真菌 (mg 实验动物 （给药方式） 酰 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 9 小鼠 （ 腹腔注射 ） 国农业科学院硕士学位论文 第一章 真菌毒素概述 3 真菌毒素 中文名称 主要产毒真菌 (mg 实验动物 （给药方式） -2 酰 素 绿菌素；铜锈微囊藻素 ； 曲霉毒素 白鼠（口服） 雌白鼠（口服） 链孢霉毒素 交链孢霉酚 交链孢霉甲基醚 1 2 烯酸内酯 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 真菌毒素概述 4 真菌毒素 中文名称 主要产毒真菌 (mg 实验动物 （给药方式） 壳毒素 毛壳菌素 黄绿青霉素 曲霉素 5 白鼠（腹腔注射） 氯素 匹阿尼酸 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 0 白鼠（口服） 小鼠（口服） 氧雪腐镰刀菌烯醇双乙酸酯 氧雪腐镰刀菌烯醇单乙酸酯 腐败菌素 B 蛇形菌素；二乙酸鹿草镰刀菌烯醇； （静注） 乙酰雪腐镰刀菌烯醇 鼠（腹腔注射） 香豆素 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 真菌毒素概述 5 真菌毒素 中文名称 主要产毒真菌 (mg 实验动物 （给药方式） 角胺 角毒素 角缬氨酸 1 果镰刀菌素 马菌素 1 腐马毒素 刀菌酸 镰孢毒素 镰刀菌烯酮鼠（腹腔注射） 刀菌素 氏菌素 薯宁 青霉毒素 酸 黑麦震颤素B 1 黄醌茜素；黄变米霉素；黄天精； 1 番茄菌肽 形素 珠毒素 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 真菌毒素概述 6 真菌毒素 中文名称 主要产毒真菌 (mg 实验动物 （给药方式） 端孢霉烯族类 病镰刀菌烯醇 雪腐镰刀菌烯醇 鼠 （ 腹腔注射 ） F.， （ 棕曲霉素 8 白鼠（口服） 卵孢毒素；卵泡霉素； 酸 曲霉素；展青霉素 5 白鼠（口服） 霉酸 霉震颤素 鼠（腹腔注射） 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 真菌毒素概述 7 真菌毒素 中文名称 主要产毒真菌 (mg 实验动物 （给药方式） 莫新；拟茎点霉毒素 杆孢毒素 ，青霉毒素 20 白鼠（口服） 褶青霉素 1 F， G， H 葡萄穗霉毒素 类丝核菌素 000 12于单个初样的大小 ,应该根据谷物籽粒的大小而定。如果谷物的种子较小 ,果谷物种子较大 (例如玉米 ),可以采集 1千克。 品的制备 采集到的初样，经过合并即形成整样（ 对于整样，一般采用四分法来逐步减小其数量，制备成终样（ 对于终样的数量要求，根据不同目的，可以保持在数千克至 1千克左右。而实验室样一般保留 1千克左右即可满足常规检测要求。 对于分析样品的制备，一般是将实验室样品用植物粉碎机碾碎处理成粒度在 20细混均匀后，用精密度不小于 0处理。 品的储藏与运输 对于采集好的样品，应该尽可能迅速地运送到实验室，存放入到温度 下冰箱中冰冻保存，以防样品变质、霉变，特别是防止霉菌滋生而导致待测毒素含量变化。 另外一个需要特别注意的问题是，在 样品的采集、合并、缩分、处理、储藏、运输和保存过程中，应采取措施尽可能的防止待检测样品发生变质或样品之间产生交叉污染。为了防止交叉污染，对于样品的包装材料要加以优选，最好使用内衬有铝箔的纸质袋子。塑料袋，特别是某些聚氯乙烯塑料袋尽量避免使用。 验材料和方法 验仪器与装置： 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 高效液相色谱法测定饲料中的腐马毒素 35 超声波清洗器： ，天津市恒奥科技发展有限公司。 往返式震荡提取机： ，南京土壤仪器厂。 植物样本粉碎机： ，农业部扶沟科学仪器厂。 旋转蒸发器： ，天津玻璃仪器厂。 循环水式多用真空泵， ，郑州长城科工贸有限公司。 固相萃取柱： 离子型， 100 国 品。 高效液相色谱仪组合：液相色谱泵， 00B 型，德国产；进样装置： 125 型 20 L 固定体积样品注入器，美国产；色谱柱：长 150 径 4.6 填粒度 5 m 谱柱前附加一长度 20 料为 、粒度 10 荧光分光光度检测器：日本岛津 ，激励光波长： 335射光波长： 440 验试剂： 除特别说明，本实验中所有使用的试剂均为分析纯。 甲醇： ，江苏淮阴塑料制品厂精细化工研究所。 标准溶液的配制： 1 马毒素（美国 司） 别溶于 25 醇，该标准溶液每 L 含有 40马毒素。 巯基乙醇、邻苯二甲醛：美国 司产品。 衍生液配制：秤取 16 确到 .4 醇，加入 2 先配制好的 硼酸钠溶液，摇匀；再加入 20 L 巯基乙醇，摇匀。该衍生液置于棕色瓶中，避免阳光直射，存放时间不超过一周。 高效液相分离用流动相： 甲醇加 3:1， V/V），逐滴加入磷酸，直至溶液声波清洗器脱气处理后使用。 验流程和方法设计 样品 用甲醇 +水混合液提取，对提取液用小型强酸型阴离子固相萃取柱（ 化60,61,69,77。用旋转蒸发器浓缩纯化后的样品，并经化学衍生处理后，用反相高效液相色谱分离，并以荧光分光光度检测器定量测定。 71,73,74,75 通常，人们都认为一个痕量分析方法的检出限越低越好，但实际上在许多情况下并无必要。一般应根据官方设置的该毒物的最大残留限量来确定最低检出限。根据表 4 可知，目前国际上多数国家将腐马毒素的最大残留限量设为 1 mg 此所要开发的分析方法的最低检出限应设置在低于这个最大限量 一个数量级的水平，即 国农业科学院硕士学位论文 第二章 高效液相色谱法测定饲料中的腐马毒素 36 为了达到这一目标，首先必须挖掘检测器资源，使所用的检测器达到最敏感而同时又处在稳定的状态。本试验所用的荧光监测器对腐马毒素 以达到 0.5 右的灵敏度，这样我们仅仅用一支小型固相萃取柱就可以承担 0.5 g 玉米提取物，最终玉米提取物注入到仪器中的量仅为 12.5 可以满足分析要求。由于对这种小型固相萃取柱的负载轻，使得试验中所用的固相萃取柱至少可以重复使用 2 次，同时也降低了分析成本。 验结果与讨论 品中腐马 毒素的提取 作为一种痕量分析测定，首先考虑的是要使用哪一种提取溶剂能有效地把目标物质从样品中提取出来。对提取用的溶剂选择的原则是：提取效率要高，所提取的共萃杂质要少，使用的提取溶液要经济而且毒性低。最常见的提取剂为乙腈 :水（ 1 1， V/V）或甲醇 :水（ 31， V/V）混合溶液。研究表明用不同的溶剂 /样品比例（ 2 1 10 1）进行毒素提取时，其添加回收率没有显著差别。尽管有报道指出，使用乙腈 +水所得到的提取效率要稍微优于甲醇 +水，但是本实验仍然选用甲醇 +水（ 3:1， V/V）为提取剂，主要的原因就是考虑到使 用甲醇所得到的共萃杂质少，而且使用该溶液既经济，毒性又低。 分别将 50（ 3： 1， V/V），加入到 4份 25 40目筛）中，在振荡提取机上分别提取 2030450果表明，振荡提取的持续时间在 20收率没有显著变化。故最终振荡提取时间取 30 607080901001101200 10 20 30 40 50 60 70提 取 时 间 m i 3 不同提取时间对 of of on of 1 by 3+1) 品中腐马毒素的纯化和浓缩 中国农业科学院硕士学位论文 第二章 高效液相色谱法测定饲料中的腐马毒素 37 样品在 析之前，提取液必须经过纯化以除去样品中的共萃物并浓缩腐马毒素。强阴离子交换柱 化效果较好，应用十分普遍，但样品过柱时要求 在 且严格控制流速不能大于 1ml/点是不适于纯化水解的腐马毒素。 在保证固相柱处于湿润条件下，定量取 1米提取液（若 过低，用 添加 到固相柱上，在重力作用下过滤之，如果需要，可以用橡皮吸耳球稍加压力，但要保证流速不超过 0.2 mL/约 4 滴）。待全部玉米提取液过柱后，依次用 2 醇 +水（ 3:1， V/V）， 2 醇，预洗固相柱，并弃去所有予洗液。再分别用 42222甲醇 +乙酸（ 100:1， V/V）作为淋洗液对保留在固相柱上的腐马毒素进行淋洗，将淋洗液换成甲醇 +乙酸（ 100:V/V）重复上述过程。在此操作中，要保持流速在大约为 0.2 mL/ 结果如下图所示，用 甲醇 +乙酸（ 100:V/V）淋洗 ，第一次 4以洗脱出 90的 完全洗脱需要 12上淋洗液；而用甲醇 +乙酸（ 100:1， V/V）淋洗 10将 脱完全，并且前 8洗液可以获得 99的 一步提高淋洗液的乙酸浓度，则有可能使过多的玉米共萃