【毕业学位论文】（Word原稿）小麦及其近缘植物NPR1类似基因和反转录转座子基因片段的分离和特性分析作物遗传育种博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 小麦及其近缘 植物 似 基因和反转录转座子基因片段的分离和特性分析 I 摘 要 小麦白粉病、小麦纹枯病是小麦生产中最严重的病害之一，常造成巨大 的经济损失。白粉病菌生理小种变异快，使用少数几个抗病基因进行抗性育种易引起寄主较快丧失抗性。而易于利用的小麦纹枯病抗源匮乏，抗性为多基因控制的数量性状，使其抗性育种进展缓慢。因此，研究寄主抗病反应分子机制，分离具有广谱作用的抗病信号传导 调控 基因，是目前抗病遗传育种发展方向之一。 仅对 系统获得抗性 ( 诱导系统抗性 (核心调控作用，而且也是基础抗性以及由抗病基因 (R)决定的抗性 反应中 的重要调控因子 ，其过量表达可提高寄主对多种病害的抗性 。 已发现一些重要作物中都存在 其类似基因， 其类似基因介导的抗性可能是多种植物共同的保守途径。因此，克隆小麦及其近缘属 其类似基因对小麦白粉病和纹枯病抗性具有重大意义；由于小麦基因组庞大 、 重复序列多，使小麦基因的分离相当困难。研究发现防御相关的胁迫如水杨酸 (茉莉酮酸 (病原菌等，可以激活反转录转座子的活性，活性的反转录 转座子可以用来改良作物品种和作为基因标签分离基因和功能鉴定。本研究从白粉病菌诱导的小麦中分离到具有活性的反转录转座子，可为植物基因分离和功能鉴定提供有力的工具。 本研究取得以下研究进展： 1. 根据已克隆的其它植物的 因的保守序列设计引物， 从白粉病菌诱导的中间偃麦草和粗山羊草中获得了 似基因片段，具有 构保守序列，这两个基因分别命名为 根据获得的 因 片段的序列设计 物，通过 获得了全长基因 列，同时从 粗山羊草和普通小麦分别 获得了 似基因的全长序列，分别命名为 序列比较发现： 码蛋白的氨基酸之间的同源性在 98以上，它们存在垂直同源的关系；而它们与 同源性仅 84，说明 不同类型的 似基因。由此，推测 中间偃麦草和粗山羊草里可能还存在其它 似序列。 2. 通过序列分析发现： 导的蛋白质 都具有已知 白的典型保守 结构域 已报道的拟南芥、烟草、小麦、玉米的 氨基酸序列进行分析，结果表明：对 能起关键作用的氨基酸在不同物种不同基因产物间均具有保守性，如 )、 ) 和 )。 端 量高达 70以上。进化树分析表明： 水稻 系密切，与美国专利报道的小麦 源序列（ 系较远，说明小麦中可能存在多个 类似基因序列。 3. 以 为探针 ， 与不同病原处理的中间偃麦草总 行 交分析 ， 结果表明 ： 常情况下有微量表达 ， 但在小麦白粉病菌 （ 诱导下表达增强， 白粉病菌诱导 10 小时到 24 小时表达量最高。在小麦纹枯病菌（ 导情况下 因表达量也增加，纹枯病菌诱导 5 小时 达水平最高，然后表达量又降低，这些结果说明： 导对白粉病、纹枯病的抗性调控反应， 表达模式有所不同。 4. 为了解 中间偃麦草基因组中的存在形式 ， 以 探针与 制内切酶消化的中间偃麦草基因组 行 交分析。结果表明： 单拷贝的形式存在于中间偃麦草基因组中。 5. 利用瞬间表达技术初步分析了 因的功能：首先 构建了 因的高效表达载体，然后使用基因枪将 因和 因的载体共轰击导入到感白粉病小麦品种中 8601 离体叶片表皮细胞中，用 因标记阳性转化细胞。转化后 4h 接种白粉菌孢子， 44 h 后观察转化阳性表皮细胞，研究 因表达对白粉菌入侵及吸器形成产生的影响。结果表明，中 8601 叶片表皮细胞中能够瞬间表达，对白粉病菌的侵入和吸器形成均有部分抑制作用，在一定程度上增强了对白粉菌的抗性。 6. 本研究探讨了小麦反转录转座子的活化模式，发现 小麦白粉病菌防御相关的胁迫可以激活小麦反转录转座子。利用接种白粉病菌的抗病易位系小麦 总 过 增，克隆了 51 反转录转座子的反转录酶片段，发现 3 个新的小麦反转录转座子家族 1996）推测小麦及其近缘属中的 反转录转座子具有活性。为了明确 否具有转录活性，从 中随意选择 为探针，与用防御相关胁迫如 病原菌处理过的 总 交。结果表明，正常情况下有低水平的表达，但在 病原菌诱导下，表达水平明显增强， 2448 h 后恢复到正常的水平。说明 的反转录转座子具有转录活性 。析结果表明 高拷贝的形式存在于小麦及其近缘属基因组中。 表明了这种转录激活方式可能是小麦反转录转座子家族的共同特征。 综合上述，本研究从白粉病菌诱导的小麦及其近缘植物中分离克隆出的 似基因和小麦反转录转座子保守片段，并对它们的生物学特性和功能进行了分析。 一定程度上增强了表达细胞对白粉病菌的抗性。从小麦及其近缘属中克隆的 似基因对揭示抗病作用机制和进行抗白粉病、纹枯病广谱抗病育种具有重要意义；具有活性的反转录转座子可为基因标签法分离基因和功能分析提供一个有 力的工具。 关键词： 中间偃麦草； 粗山羊草； 小麦；小麦白粉病菌；小麦纹枯病菌； 似基因 控反应；瞬间表达系统；增强抗性； 反转录转座子；转录 in of As a to is is by is so it is of to of of is a an in (to Its in is in be in As of is by A, JA In as a to it an 1. to NK by of by of At of is 8%, 4% h. 2. of TB NK as ), ), ), GC is 0%. of IV in 3. in 0 h 4 h is by by is in 4. In to NA a 5. to A in by 601 by At to 0 , 4 of of in to of on to of of so 6. An of It by A, JA of of of to 0, 1996) of in In to of , A, JA . A, JA 4h to 8h of in of to be of In of V To It is to of as a be a on in R. 录 第一章 绪论 . 1 物的抗病机制 . 1 物防御反应中的信号分子 . 2 杨酸 . 3 莉酸和乙烯 . 3 物防御反应信号转导途径 . 4 赖于水杨酸的防御信号转导途径 . 4 赖于茉莉酸和乙烯的防御信号途径 . 5 物防御反应信号转导途径拮抗及协同作用 . 5 因的研究进展 . 6 因的发现 . 6 码蛋白质结构 . 7 物抗病性中的关键作用 . 7 抗病信号传导作用机制 . 7 调节和平衡不同抗病信号传导途径中的作用 . 9 植物广谱持久抗病的应用前景 . 10 间表达技术快速分析基因功能 . 10 源基因在植物 细胞内的瞬间表达 . 11 间表达方法 . 11 间表达技术应用 . 12 物抗病基因克隆 . 12 录元件和转录因子克隆与分析 . 12 因功能鉴定分析 . 12 因产物定位分析 . 13 物反转录转座子研究进展 . 14 转录转座子基本特性 . 14 转录转座子分类和结构 . 14 转录转座子转座过程 . 14 物反转录转座子是高等植物基因组重要组成成份 . 15 物反转录转座子高度异质性与进化 . 16 物反转录转座子的活性及其对基因组的影响 . 17 御相关的胁迫激活反转录转座子活性 . 18 物反转录转座子应用 . 19 物反转录转座子在功能基因组学中的应用 . 19 物反转录转座子在其他方面的应用 . 20 麦白粉病研究进展 . 20 麦抗白粉病基因研究背景 . 21 麦抗白粉病基因克隆研究现状 . 21 麦纹枯病研究进展 . 21 题意义及技术路线 . 23 立题意义 . 23 术路线 . 25 第二章 似基因的分离、特性和功能分析 . 26 材料与方法 . 26 材料 . 26 小麦材料 . . 26 菌种及载体 . . 26 酶及化学试剂 . 26 试剂盒 . 27 引物 . 27 法 . 27 实验材料 . 27 总 提取 . 27 合成 . 28 增 . 29 物的纯化 . 29 感受态细胞的制备 . 29 物的克隆测序： . 30 交 . 30 交 . 32 利用 5延伸基因 5端 . 33 利用 3延伸基因 3端 . 36 增 长 . 38 载体构建 . 39 离体叶片转化 . 40 接种 、互作及电镜检测 . 41 序列分析 . 41 果 . 41 似基因分离 . 41 总 品的质量检测 . 41 似基因保守片段分离 . 42 因全长获得 . 43 列及进化树分析 . 45 似基因保守区序列分析 . 45 因全长序列分析 . 47 性分析 . 52 因表达特性 . 52 贝数分析 . 54 利用瞬间表达对 能初步分析 . 54 表达载体构建 . 54 白粉病菌发育过程 . 55 报告基因在表皮细胞中表达过程 . 57 目标基因与白粉病菌互作效果分析 . 57 论 . 59 第三章 防御相关胁迫诱导的反转录转座子特性分析 . 62 料与方法 . 62 材料 . 62 小麦材料 . 62 菌种及载体 . 62 酶及化学试剂 . 62 试剂盒 . 62 引物 . 63 测序 . 63 方法 . 63 材料处理 . . 63 总 提取 . 63 合成和 增 . 63 物的纯化、连接及转化 . 63 测序、比 较和进化树分析 . 63 析 . . 64 果 . 64 分离小 麦中的反转录转座子 片段 . 64 反转录转座子