敲除小鼠研究计划

dld hierarch 2013.06.22,Lrp5/6在高血脂所致损伤时所扮演的角色的探究计划,01、用高脂饲料喂养ApoE基因敲除小鼠建立高脂损伤模型,ApoE基因敲除小鼠模拟高血脂损伤模型的机理/ ApoE基因的作用,用何种指标或手段确认高血脂损伤模型的建立,02、Lrp5/6在高脂损伤时表达水平的探索,体外用Ox-LDL刺激huv-ec细胞，看膜上的Lrp5/Lrp6水平的表达,取小鼠的血管内皮细胞体外培养，重复OX-LDL刺激实验,03、Lrp5/6在高脂损伤时所起作用的探索,取已建立好ApoE基因敲除小鼠高脂损伤模型的小鼠各脏器观察Lrp5/6及Catenin的表达水平的变化,如Lrp5/6在其中扮演角色，则研究其内在机制（何种通路等）,体内探索Lrp5/6在高血脂损伤时所扮演的角色,ApoE（apolipoprotein E / 载脂蛋白E）,载脂蛋白是血浆脂蛋白（脂-蛋白复合物）中的蛋白部分。载脂蛋白是构成血浆脂蛋白的蛋白质组分，主要在肝脏（部分在小肠）合成，主要分类由A、B、C、D、E五类。基本功能是运载脂类物质及稳定脂蛋白的结构，某些载脂蛋白还有激活脂蛋白代谢酶、识别受体等功能。ApoE结构及功能简介,血浆脂蛋白是哺乳动物血浆中的脂蛋白复合物，能够和脂类（甘油三酯、磷脂、胆固醇等）结合从而实现在血浆中运输脂类（跨器官运输）（1）脂蛋白的结合机制脂蛋白中脂质与蛋白质之间没有共价键结合，多数是通过脂质的非极性部分与蛋白质组分之间以疏水性相互作用而结合在一起。一般认为血浆脂蛋白都具有类似的结构，呈球状，在颗粒表面是极性分子，如蛋白质、磷脂，故具有亲水性；非极性分子如甘油三酯、胆固醇酯则藏于其内部。磷脂的极性部分可与蛋白质结合，非极性部分可与其它脂类结合，作为连接蛋白质和脂类的桥梁，使非水溶性的脂类固系在脂蛋白中。（2）脂蛋白的分类及功能,dld hierarch,脂蛋白的分类及功能：01、乳糜微粒（chylomicron，CM）颗粒最大，密度最低约为500nm大小，脂类含量高达98%，蛋白质含量少于2%，因此密度极低。主要功能为运输外源性甘油三酯。02、极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）VLDL中脂类占85%-90%，其中甘油三酯（TG）占55%，其密度也很低；VLDL的功能为运输内源性甘油三酯（肝脏中由脂肪酸和葡萄糖合成）。03、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）04、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）,dld hierarch,03、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）主要功能是把胆固醇（是携带胆固醇最多的脂蛋白）从肝脏运输到全身各处细胞，经代谢进行清除。（1）受体介导途径清除（主要是Apo蛋白配体+LDL受体）约2/3体内2/3的LDL是通过受体介导途径吸收入肝和肝外组织，经代谢而清除的。在血管运输过程中，当LDL，尤其是OX-LDL（氧化修饰的低密度脂蛋白）过量时，它携带的胆固醇便积存在动脉壁上，长期积累容易引起动脉硬化。因此LDL被称为“坏的胆固醇”。（2）非受体通路（巨噬细胞吞噬LDL）约1/3巨噬细胞与LDL结合，吸收LDL中的胆固醇，这样胆固醇就留在细胞内，变成“泡沫”细胞。因此，LDL能够进人的动脉壁细胞，并带入胆固醇。所以LDL水平过高能够导致动脉粥样硬化的发生。,dld hierarch,04、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL） 颗粒最小密度最高的血浆脂蛋白，其直径为7.510 nm，密度为1.21 g/cm3，含有6%胆固醇、13% 胆固醇酯与50% 蛋白质，其载脂蛋白大多为ApoA（载脂蛋白A）。生理功能和意义主要功能为将内源性胆固醇从组织向肝脏进行逆向转运，在肝脏内转化为胆汁酸或直接转化为胆汁从肠道中排出。降低了胆固醇在血管中沉积的风险。因此HDL能够抵抗血管粥样硬化的形成，是“好的胆固醇”被誉为“血管清道夫”。同时HDL具有逆转内皮功能不良、刺激PIG2（前列环素，具有扩血管和抗血栓形成作用）生成，抑制血管内皮细胞凋亡、减少血小板聚集、抑制LDL氧化（即减少OX-LDL生成）等许多功能。1985年诺贝尔生理学奖成果胆固醇代谢调节机制美国德克萨斯大学的MichaelSBrown和JosephLGoldstein,dld hierarch,ApoE蛋白结构及功能简介ApoE主要由肝脏合成，近年来发现脑，肾，骨骼，肾上腺及巨噬细胞也能合成。 ApoE生理功能：是LDL受体的配体，也是肝细胞CM残粒受体的配体，它与脂蛋白代谢有密切相关性；ApoE具有多态性，多态性是决定个体血脂水平与动脉粥样硬化发生发展密切相关；参与激活水解脂肪的酶类，参与免疫调节及神经组织的再生。ApoE基因敲除小鼠构建AS（动脉粥样硬化）的模型的机制,ApoE基因敲除小鼠构建AS（动脉粥样硬化）的模型的机制ApoE蛋白能够是通过不同机制对动脉粥样硬化起到一定的抑制作用。模拟机理ApoE是构成CM (乳糜微粒)、VLDL (极低密度脂蛋白)及HDL (高密度脂蛋白)的重要成分，它作为一种清除配体，参与受体介导的载脂蛋白清理过程，主要介导血浆脂蛋白特别是乳糜微粒和低密度脂蛋白的代谢与清除，在脂蛋白代谢巾发挥重要作用。因此当ApoE基因敲除后，可导致TC（总胆固醇）、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）升高，诱发动脉内膜损伤及脂质沉积，最终发展成动脉粥样硬化。 Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science, 1992Oct 16;258(5081):468-71.模型优点以往的As动物模型大多以高脂肪、高胆固醇膳食负荷喂养，其As病理变化机制与人类As的形成有较大的差异。,dld hierarch,高血脂损伤模型建立确认的指标,脂质代谢异常与动脉粥样硬化的发生和发展具有密切的关系。载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠可出现高脂血症并形成动脉粥样硬化，因而成为理想的动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)模型。Severe hypercholesterolernica and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homoIogous recombination in ES cells. Cell,Volume 71, Issue 2, 343-353, 16 October 1992,血脂生化分析指标血管超声检查病理切片指标血管内皮细胞凋亡指标CT血管造影检查,dld hierarch,总胆固醇（TC）甘油三酯（TG）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）,血脂生化分析指标,dld hierarch,ApoE-/-小鼠As病变通常是从主动脉根部、升主动脉开始形成，并在冠状动脉、主动脉弓及其分叉处、颈总动脉及其分叉处、胸主动脉、腹主动脉、双肾动脉等处均可形成斑块，与人类As好发处相近。由于ApoE-/-小鼠As病变是从主动脉根部开始发生，为了观测早期As的病变特征，可以采用UBM（超声生物显微镜，ultrasound biomicroscopy）成像观察ApoE-/-小鼠主动脉根部的形态学和IMT（主动脉后壁内-中膜厚度）变化。Non-invasive real-time imaging of atherosclerosis in mice using ultrasound biomicroscopy.Atherosclerosis.2007.190(2) Ultrasound biomicroscopy noninvasive assessment of atherosclerosis in apolipoprotein-E knockout mice. Ultrasound in Med & Bio,2011,dld hierarch,血管超声检查,dld hierarch,用Ox-LDL刺激huv-ec细胞和体外培养的小鼠血管内皮细胞以探究细胞膜上的Lrp5/6的表达水平,huv-ec cell（人脐静脉内皮细胞，Human Umbilical Vein Endothelial Cells）HUV-EC-C (ATCCCRL-1730)OX-LDL（ Oxidized low-density lipoprotein, 氧化型低密度脂蛋白）OX-LDL喜好在血管内皮受损部位即血管斑块部位聚集，它能够诱导血管壁内巨噬细胞泡沫化，并在其局部引发一连串的多种细胞参与的炎症反应，从而导致不同程度的动脉粥样硬化。,dld hierarch,ApoE基因敲除小鼠模型的建立及对照组的设置,看时间梯度结合高血脂损伤的诸项指标观察Lrp5/6表达水平的变化及差异,dld hierarch,Lrp5/6在高脂损伤时所扮演角色的的探索,用Lrp5/6基因敲