任务单元抗原抗体的制备

任务六 抗原抗体的制备,主要内容,单元一 抗原的制备单元二 抗血清的制备单元三 单克隆抗体的制备单元四 基因工程抗体,学习目标,1.掌握抗血清的制备过程及鉴定方法，正确判定抗血清的质量，能正确处理抗血清制备中的干扰因素。2.掌握单克隆抗体技术的原理、制备流程和应用。3.正确理解多克隆抗体、单克隆抗体和佐剂的概念。4.知晓免疫原的制备方法及意义。5.了解基因工程抗体的优点、种类和应用。,单元一 抗原的制备,抗原（免疫原）：免疫原（immunogen)指用于制备抗体的抗原(antigen)或半抗原(hapten）。,抗原,颗粒性抗原,可溶性抗原,蛋白质抗原,多糖抗原,核酸抗原,一、颗粒性抗原的制备,颗粒性抗原细胞性抗原：血细胞和组织细胞病原体：细菌、病毒、支原体、寄生虫等,采集静脉血,玻璃珠脱纤维,离心、洗涤,调合适浓度,（一）绵羊红细胞的制备,(二)细菌抗原的制备,用途:(1)作为诊断菌液。(2)用于制备免疫血清或诊断血清。,1.制备方法,培养细菌,分离、鉴定,扩大培养,合适浓度,灭活处理,离心、洗涤,2.细菌抗原的检定,1.一般性状检定 菌种典型；抗原为乳白色悬液；盐水中不自凝。 2.无菌试验 甲醛处理后37培养2-3d无菌生长3.纯度检查 革兰氏染色镜检10个视野无杂菌。4.特异性试验 玻片凝集试验强阳性。5.定量凝集试验 凝集效价不低于原血清凝集效价的50%6.浓度测定。,二、可溶性抗原的制备,组织细胞粗抗原制备-组织、细胞清洗和去污处理,细胞裂解（捣碎方法）,匀浆物提取（初筛物）,可溶性抗原制备-匀浆物中目的抗原提取纯化 （不同纯化方法，多次纯化）,鉴定（定性、定量、特异性、理化性等）,分装、保存,可溶性抗原制备的一般流程,二、可溶性抗原的制备,（一）材料的选取与预处理,（二）细胞裂解,（三）纯化抗原的提取,（四）抗原的鉴定,（五）抗原的浓缩与保存,五步骤,（一）材料的选取与预处理,组织：新鲜或低温保存（-40）处理方法：（1）器官或组织剪去包膜、结缔组织及大血管，生理盐水或缓冲液洗去残留血液和污物，剪成小块，再捣碎。（2）细胞 缓冲液混悬后离心，再进行裂解或捣碎。,二、细胞裂解,1.细胞匀浆（1）高速组织匀浆器法（2）研磨法：玻璃匀浆器,2.超声波破碎法,适用范围：组织细胞和微生物细胞。机制：可能与强声波作用于溶液时，气泡产生、长大和破碎的空化现象有关，空化现象引起的冲击波和剪刀力使细胞裂解。超声破碎的效率取决于声频、声能、处理时间、细胞浓度和细胞的类型。特别注意：使用时注意降温、防止过热，避免产生气泡。,3.酶处理法,适用范围：多种微生物细胞机制：利用酶反应，破会细胞壁上特殊的键，从而达到破坏细胞壁的目的。优缺点：优点：专一性强，酶解条件温和。 缺点：费用较高。应用做多的是：溶菌酶（专一分解细胞壁上糖蛋白分子的-1，4-糖苷键）。,4.反复冻融法,适用范围：培养细胞、细胞壁较脆弱的菌体机制：突然冷冻时细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。优缺点：优点：简便 缺点：破碎率低 引起对冻融敏感的蛋白质变性,5.表面活性剂处理法,适用范围： 细菌和培养细胞机制：适当条件下（温度、pH、低离子强度），表面离子活性剂与脂蛋白形成微泡，使细胞膜通透性改变。优点：作用温和最常用的是：SDS，Tween,（三）可溶性抗原纯化,1.蛋白质抗原的纯化 纯化方法： （1）超速离心法 分离亚细胞成分和大分子蛋白质 （2）选择性沉淀法 盐析法最为经典 （3）凝胶过滤法 （4）离子交换层析法 （5）亲和层析法,（1）超速离心法,原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗原，极难将某一抗原成分分离出来。应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋白A、B等。,（2）选择性沉淀法,原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同）；常用3350饱和度的硫酸铵。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。,（3）凝胶过滤法,原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质， 经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。,（4）离子交换层析法,原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。,（5）亲和层析法,原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。,2.核酸抗原的制备,主要步骤,破碎细胞,蛋白质的去除,核酸的沉淀,酚和氯仿,乙醇,核酸的保存（1）温度 -70 长期保存 -20 4（5）最佳和最简单（2）介质 TE缓冲液（最常用）,3.脂多糖抗原的制备,4.Ig片段的制备,（1）非共价键解离法 肽链亚单位之间以氢键、静电引力等非共价键结合，这些键结合力较弱，可经2种方法将其断开制备片段。 改变pH：蛋白质解离的临界值为pH 34(羧基滴定范围)和pH 910(赖氨酸酪氨酸滴定范围)，当加入酸或碱使pH低于，3或高于10时，肽链亚单位就会解离； 利用强变性剂：多数蛋白在8molL脲或6moI儿盐酸胍中会发生变性，使肽链亚单位解离，此法也可用于载脂蛋白抗原的解离和胶原肽的提取。,（2）共价键解离法 二硫键是连接免疫球蛋白肽链的共价键，解离二硫键可将轻链与重链分开。解离的方法多采用氧化法和还原法。氧化法的优点是切开二硫键后，肽链不能重新形成二硫键，便于肽链纯化，缺点是蛋氨酸(甲硫氨酸)被氧化成亚砜，色氨酸侧链被破坏。 还原法目前常用，其原理是将二硫键还原成巯基，但还原的琉基极不稳定，易再重新结合成二硫键，必须及时用碘乙酸或碘代乙酰胺进行羧甲基化以封闭巯基。,（3）酶解法 酶解法的专一性极好，不同的片段可用不同的酶进行裂解。如木瓜酶水解IgG可获得1个Fc段和2个Fab段；胃蛋白酶水解IgG可获得F(ab)：和数个小片段。用木瓜酶水解得到的Fc段常作为抗原来制备抗重链血清，胃蛋白酶水解得到的F(ab)；常作为抗体试剂应用。,（四）纯化抗原的鉴定、浓缩与保存,1.定量测定 生化技术 如 UV法、双缩脲、酚试剂等蛋白检测方法。常用的是紫外光吸收法，该法测定280nm和260nm的吸光度(A)值，并根据公式计算蛋白含量。蛋白含量(mgm1)A280nm1.45-A260nm0.742.纯度鉴定 PAGE、免疫电泳、双扩3.免疫活性鉴定 免疫电泳、双向免疫扩散法、ELISA4.浓缩与保存,三、半抗原的制备,半抗原：仅有抗原性的物质。半抗原+载体=完全抗原（一）载体 1.蛋白质 是结构复杂的大分子胶体物质，是一种良好的载体，常用的有牛血清白蛋白、人血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白等。其中牛血清白蛋白溶解度较高、免疫原性强且易获得，因此最为常用。蛋白质与半抗原的结合主要通过游离氨基、游离羧基、酚基、巯基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基团的缩合。,2.多肽聚合物 人工合成的载体。常用多聚赖氨酸(polylysine)，其分子量高达lOOkD以上，是良好的载体。这种多肽聚合物与半抗原结合后，可诱导产生高效价、高亲合力的抗体。 3.大分子聚合物 羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidonc，PVP)等大分子聚合物均可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。,（二）半抗原与载体的连接方法 1.物理法 通过吸附作用。 2.化学法 通过交联实现。（三）半抗原的鉴定 1.目的：测定半抗原与载体的比例。 2.测定方法： （1）吸收光谱分析法 （2）放射性核素标记半抗原掺入法,（1）如果半抗原有适宜的吸收光谱，测定在一定波长下复合抗原和载体之间克分子吸光度的差别，然后把这个差别与同样波长下半抗原的克分子吸光度数相比较，就可以准确地计算出所结合的半抗原分子数。（2）在偶联反应液中加入一定量的放射性核素标记的半抗原，偶联反应后经充分透析，测量透析袋中的放射性含量，计算结合到载体上的半抗原分子数。,四、免疫佐剂,免疫佐剂（佐剂）：先于抗原或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质被称为免疫佐剂，简称佐剂。本质：佐剂可视为一种非特异性免疫增强剂，可增强体液免疫和细胞免疫应答。,（一）佐剂的种类与制备,1.种类,具备免疫原性的佐剂：如卡介苗、枯草分枝杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、脂多糖、细胞因子等。 不具备免疫原性的佐剂：如氢氧化铝佐剂、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸、胞壁肽等。 应用最多的是福氏佐剂、细胞因子佐剂。,（1）福氏佐剂：分完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂+卡介苗）、不完全福氏佐剂（石蜡油+羊毛脂）两种。福氏完全佐剂可提高佐剂效能，但注射后易产生局部持久性溃疡和肉芽肿，宜注意。 （2）细胞因子佐剂：细胞因子佐剂与抗原合用，可有效激发机体的免疫功能。IL-2、IL-1、IFN、IL-12、GM-CSF皆较常应用；细胞因子佐剂还被广泛应用于肿瘤基因治疗中。,用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly IC、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂(Freunds adjuvant) 。,2.制备,制备方法（1）研磨法（2）搅拌混合法（注射器