【毕业学位论文】鸡贫血病毒结构蛋白抗原表位研究及感染性克隆构建博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 博士学位论文 鸡贫血病毒结构蛋白抗原表位研究 及感染性克隆构建 士研究生:王晓艳 指导教师 :王笑梅 研究员 申请学位类别 : 农学博士 专 业 :预防兽医学 研究方向 :动物病毒分子 生物学 培养单位 :研究生院 哈尔滨兽医研究所 提交日期 2007 年 6 月 007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 （保密的学位论文在解密后应遵守此协议） 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 论文评阅人、答辩委员名单 论文评阅人：匿名评阅 论文答辩委员会 主 席 ： 刘文周 教 授 答辩委员： 师东方 教 授 华育平 教 授 童光志 研究员 于 力 研究员 刘胜旺 研究员 曲连东 研究员 答 辩 日 期 ： 2007 年 6 月 16 日 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 中国 哈尔滨 摘 要 为了研究鸡贫血病毒（ 白的抗原表位，本研究根据生物软件 白抗原性的分析结果，将 白进行了分段表达，选取缺失 端68 个氨基酸的融合表达产物 行纯化，免疫 c 鼠，制备了 6 株抗 白的单克隆抗体（。以这些 分段表达的 白进行 析，在 白上初步鉴定出 3 个抗原位点，分别位于 219基酸（残基、324 275为了更详细而全面地了解白的抗原结构，构建了因特异性噬菌体展示肽库，利用多克隆抗体对肽库进行 3 轮淘选，得到 9 个阳性噬菌体。序列分析表明，有 5 个克隆展示有相同的序列“有 4 个克隆展示有相同的序列“利用制备的 6 株这些阳性噬菌体进行果表明 2 4 株噬菌体应。为了对这 4 株应的表位精确定位，人工合成一系列成对的寡核苷酸，退火后插入体中进行融合表达。利用应性扫描，鉴定出 2 4 株 用同样的方法鉴定出应的表位位于根据生物软件白的分析发现该蛋白具有良好的抗原性，为了对其进行表位作图（，克隆、表达了白全长，纯化后免疫c 鼠，制备了 7 株抗白的单克隆抗体。人工合成一套彼此重叠 6 个氨基酸长度为 16 个氨基酸并覆盖长的短肽，融合表达后与行应性扫描，鉴定出 3 个抗原表位，分别为这 3 个纯化后的融合短肽免疫c 鼠，结果表明这些融合蛋白均能诱导小鼠产生为了研究因对病毒复制及致病力的影响，构建了 全缺失（失（两个突变体。首先构建了含有染胞，获得了能够自我复制的体内试验显示该质粒注入鸡体内，可以引起与染相似的病理变化。又对因及因C 端的核定位信号（进行缺失，分别构建了带有缺失的突变体染胞，初步证实因缺失后在体内体外均检测不到病毒复制，但 端失后在体外可以检测到病毒复制，而体内试验结果显示失的突变体可以引起鸡胸腺小体数目增多等变化。染性克隆的构建为获得纯化的病毒及研制新型疫苗奠定了基础，两个因突变体的构建为研究因功能及获得毒力减弱的病毒奠定了基础。 关键词：鸡贫血病毒，抗原表位，噬菌体展示，肽扫描，感染性克隆 I o P1 of on of P1 as of to 19274 324369 75302 To P1 in of 9 of of a 309of a 196 12, so F3 19253 To of D5 a of in On of to F3 245D5 353 of P2 of To P2 of as a c P2 . P2 1 as . by 21121to it 16of to c P2 To AV In an AV by of AV in I SK to be in I 00g of AV by AV To P3 in AV to in P3 of of AV in It as in of in of in of AV a AV of on is of of 目 录 第一章 绪论 . 1 1 . 1 2 . 1 . 2 . 2 . 2 . 2 白 . 3 白 . 4 白( 凋亡素) . 4 3 . 6 4 . 7 . 7 . 7 原表位研究方法 . 8 . 10 5 . 10 . 10 清学检测 . 11 子生物学方法 . 11 . 11 统疫苗 . 12 因工程疫苗 . 12 6 本研究的目的和意义 . 13 第二章 白单克隆抗体制备及其抗原表位初步鉴定 . 141 材料与方法 . 14 株、质粒、菌株、细胞 . 14 要试剂与药品 . 15 验动物 . 15 器设备 . 15 AV 因的分段克隆与表达 . 15 因抗原表位的预测及引物设计 . 15 因各片段的获得 . 16 段基因融合表达载体的构建 . 16 组质粒的原核表达与纯化 . 17 组蛋白的测 . 17 白单克隆抗体的制备 . 17 物免疫 . 17 胞融合 . 17 性杂交瘤细胞的筛选与纯化 . 18 克隆抗体的特异性鉴定 . 18 克隆抗体亚型的鉴定 . 18 白单克隆抗体抗原表位的初步定位 . 19 2 结果 . 19 白抗原表位预测 . 19 2.2 因的分段表达与鉴定 . 20 因分段表达载体的构建 . 20 因的分段表达 . 21 组蛋白测 . 21 白单克隆抗体的制备 . 22 疫原的制备 . 22 性细胞克隆株的筛选及纯化 . 22 接免疫荧光试验（ . 22 克隆抗体与真核表达的白的析 . 23 克隆抗体亚型的鉴定 . 24 白单克隆抗体抗原表位的初步鉴定 . 24 3 讨论 . 25 第三章 利用噬菌体展示结合肽扫描技术研究 白抗原表位 料与方法 . 27 株、质粒、血清 . 27 要试剂与药品 . 28 要溶液的配制 . 28 菌体载体 与因的处理 . 29 菌体载体 的制备 . 29 AV 因随机片段的制备 . 29 1.5 因特异性噬菌体展示肽库的构建 . 30 转化感受态细胞的制备 . 30 V 载体与因随机片段的连接、转化 . 30 因特异性噬菌体展示肽库的纯化 . 30 1.6 因特异性肽库质量的测定 . 31 因特异性肽库库容量的测定 . 31 因特异性肽库随机性测定 . 31 1.7 因特异性肽库的淘选（ . 31 91. 31 B（培养基的制备. 31 库滴定 . 32 一轮淘选 . 32 菌体的第 2、3 轮淘选 . 32 菌体. 32 菌体阳性克隆的序列测定 . 33 争抑制试验 . 33 性噬菌体与抗白单克隆抗体的析 . 33 白单克隆抗体抗原表位的鉴定 . 33 因一系列短肽的设计 . 34 肽的融合表达 . 35 克隆抗体识别的表位的鉴定 . 36 2 结果 . 36 AV 因噬菌体特异性展示肽库的构建 . 36 因随机片段及 载体的制备 . 36 因特异性肽库库容量的测定 . 36 因特异性肽库随机性的测定 . 36 性噬菌体的鉴定 . 37 菌体. 37 位序列的测定 . 38 争抑制试验 . 39 性噬菌体与单克隆抗体的析 . 40 克隆抗体 4 2别表位的精确定位 . 40 克隆抗体 4应的抗原表位的精确定位 . 40 克隆抗体 2应的抗原表位的精确定位 . 42 3. 讨论 . 44 第四章 应用肽扫描方法对 白进行抗原表位作图 . 471 材料与方法 . 47 株、质粒、菌株和细胞 . 47 与标记物 . 47 AV 因的克隆与表达 . 48 因的获取 . 4