炎症反应的交联透明质酸钠凝胶降解

炎症反应产生交联透明质酸钠凝胶降解NOBUHIKOYUI,TERUOOKANOANDYASUHISASAKURAI日本女子医学院生物工程研究所摘要制备可降解的二缩水甘油基醚（GLYCIDYIETHER）交联透明质酸钠凝胶，研究体内炎症和离体羟基自由基降解交联透明质酸钠凝胶。离体是由H2O2ANDFESO4反应产生羟基诱导迅速但有限制的交联透明质酸钠凝胶降解。降解样式符合假定适合于凝胶表面降解的理论方程。由于阻止透明质酸酶进入交联透明质酸钠凝胶内部，离体交联透明质酸酶的降解作用很小。交联透明质酸钠基质中掺入微球药物。在交联透明质酸钠基质降解过程中药物被释放。在体移植实验揭示了炎症应答过程交中联透明质酸钠基质的降解。因此交联透明质酸钠凝胶可以可以作为能降解的移植药物载体。前言药物经由多聚体基质的降解、释放、分散和溶解，多聚体基质表面降解已经得到广泛研究。过去，酯键的水解经常作为多聚体基质降解的机制。具有疏水键聚酯像多聚乙醇酸、多聚乳酸得到深入研究。经由表面侵蚀药物传输的生物降解多聚体优于经由体积降解药物的降解基质。基本上，这些多聚体的降解贯穿整个多聚体，可导致即突发的作用和掺入药物无活性。因此，药物的扩散发生在多聚体基质降解之前是有意义的。由此，生物降解的药物释放时必须被预言。因此，表面降解多聚体发展给与更多关注。最近，为了获得药物传输体系研究了几种多聚体。这些体系的可以使用磁的、电的、超声的、温度、PH值多聚体。这些多聚体可以与酶底物反应以及药物PH敏感的溶解能力相结合。使用了作为药物缓释作用的多聚物侵蚀率的比率的多聚体，例如1,1,1三乙氧基乙烷POLYORTHIESTERS,多聚乙缩醛（POLYACETALS）AND聚酸酐（POLYANHYDRIDES）。这些多聚体的表面侵蚀率（降解）通过疏水多聚体不稳定的链的水化发生的。由掺入敏感PH的不稳定的键完成刺激反应多聚体的侵蚀。酶底物反应产生局部PH变化用来改变多聚体的侵蚀率。不管怎么说，经由PH敏感多聚体的侵蚀率调节药物的释放率是相当困难。为了实现自动反馈药物传输系统“生物降解多聚体”，这个多聚体将被设计成有特殊的内部信号，保证适合药物传输的足够长的周期降解。透明质酸钠是由氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸二糖单位重复构成的线性粘多糖。当溶解在水溶液中时透明质酸通常为高粘度液体，可以被修饰成生理性关节滑液、玻璃体和身体其他液体。众所周知HA在机体有多种重要生理功能，包括控制细胞渗透压、细胞分化、炎症过程的羟基的清除，血管生成。最近，通过微生物发酵实现了大量HA商业化。HA已经在眼外科、关节外科作为治疗因子得到使用。在活体HA的降解主要通过两个途径实现。一是经由透明质酸酶途径，二是作为活性氧来源的羟基途径。在正常身体状态下皮肤和皮下组织中酶的活性很低，皮下注射透明质酸酶降解生理盐水透明质酸钠凝胶要好几天时间。然而，倘若透明质酸钠凝胶注射在一个部位，在这个部位就有炎症发生，羟基降解透明质酸钠凝胶速率比酶迅速和明显。在炎症的初始阶段增加了毛细血管的渗透性可以使细胞因子和吞噬细胞在炎症部位聚集。吞噬细胞可以被免疫复合体和炎症复合体激活产生杀菌因子羟基（OH）。不管怎样，宿主的保护性反应产生过多羟基可导致结缔组织损伤。羟基涉及到了器官和组织损伤和包括透明质酸钠大分子降解。透明质酸在炎症的急性期的降解机制是羟基（OH）在关节炎的滑液中得到了证据。滑液的粘性下降和HA溶解发生在离体产生酶触超氧发生之后，这已经使用单管粘度计证实了。从那时起，许多作者在离体和在体实验中羟基解聚了大分子。刺激生物降解敏感的药物传输体系的发展中，应用了羟基降解HA。例如具有关节病的患者治疗注射了甾体激素和HA液体。从这一点来看，交联透明质酸钠凝胶正面对着一个药物移植的炎症反应降解新家族。这样，抗炎药物的结合，像甾体激素和交联透明质酸钠凝胶依赖炎症作为药物传输。在这篇文章中，描述了交联透明质酸钠凝胶制备，研究由羟基降解交联透明质酸钠凝胶。离体检测了炎症应答反应中交联透明质酸钠凝胶的降解。交联透明质酸钠凝胶降解特性提示设计一个新的在体炎症调节降解凝胶是可能的。材料和方法交联透明质酸钠凝胶制备分子量87X10透明质酸钠购自SHISEIDOCO,TOKYO,JAPAN,乙二醇二缩水甘油基醚ETHYLENEGLYCOLDIGLYCIDYLETHEREGDGEAND多聚缩水甘油基醚POLYGLYCEROLPOLYGLYCIDYLETHERPGPGE由NIPPONOIL1）旋转混匀。当含HA的微球被制备的时候，EGDGE加之前，多聚乳胶加入透明质酸钠溶液。当PGPGE作为交联剂时，PGPGE溶入1N氢氧化钠溶液中，加入HA溶液（如表）。混合物放入直径10MM、高3MM的玻璃小皿中，并在60反应15分钟。获得凝胶放入过量水/乙醇（11）皿中并用1N盐酸PH值至中性。凝胶被过量水/乙醇（11）冲洗若干遍。最后，在实验室实施前凝胶中乙醇被水取代。图1透明质酸PGPGE和EGDGE化学结构表1由PGPGE和EGDGE制备交联透明质酸凝胶编号EGDGE摩尔水含量溶胀率微球数/MLHA105998569104HA210997642104HA315994819104HA41099512010490105HA510995421104交联透明质酸钠凝胶性质在蒸馏水中（25）检测交联透明质酸钠凝胶水溶胀。冷冻干燥后，用扫描电镜观察了干燥交联透明质酸钠凝胶。交联透明质酸钠凝胶在体外降解由硫酸铁和过氧化氢反应产生羟基降解交联透明质酸钠凝胶。该过程是众所周知过程。除了另由注释，按下例方法实施。7MMX7MM7MM方形交联透明质酸钠凝胶浸泡在5MMFES04溶液中100ML2天。为了形成HAFE2复合体。然后,交联透明质酸钠凝胶最初降解浸泡凝胶进入不同浓度的H2O2（100ML）中。H2O2浓度由液体分光光度法（二甲氧苯胺反应500NM产生红颜色）检测。除了另有说明，降解交联透明质酸钠凝胶HPLC分析。在预测试的基础上，HPLC分析了1ML的降解产物，HPLCX8010,TOSOHCO,JAPAN。使用恢复相柱（PAKODS2201N6200MM,SENSHUSCI,TOKYO,JAPAN。使用的溶剂是水，35流动速度1ML/MIN。降解产物保留时间1535MIN。相差显微镜下（0100MM,1/400MM2）用血球计数器记数微球释放数量估算微球释放透明质酸钠凝胶量。在体炎症反应交联透明质酸钠凝胶降解在下列实验前，201018MM凝胶平板用高压锅灭菌30分钟。确认高压灭菌没有改变平板凝胶内容，表明通过高压凝胶没有降解。外科移植凝胶平板在5周WASTER大鼠平均体重110G背部皮下实验用鼠46只。切口4CM长，用5号丝线缝合，然后消毒。移植后14和28天，为了产生初始炎症反应，背部切口4CM长伤口作为伤口愈合实验。预定的周期后，用过量麻醉剂杀死大鼠，然后移植HA凝胶和局部组织一起取出。伤口愈合实验7天后杀死大鼠。残留HA用咔唑法定量分析葡萄糖醛酸。没有移植（对照组）交联透明质酸钠凝胶的大鼠背部组织葡萄糖醛酸几近阴性。结果和讨论前面文献和专利已经报道交联透明质酸钠凝胶制备和在体没有毒性。HA与商业化的交联剂反应，使用的交联剂例如双环氧化合物和二乙烯砜（BISEPOXYCOMPOUNDS,DIVINYLSULFONE）。最适合的交联剂是通过HA分子的羟基基团形成醚键的多功能环氧化合物。本实验使用的EGDGEANDPGPGE分别具有两个或四个环氧基团，它们被认为制备稳定的、亲水的交联HA凝胶是充分的够用。在本实验中，催化是使用的氢氧化钠。文献报道HA长时间暴露在高PH值中导致HA解聚作用，通常，该过程室温条件下几个小时内完成，本实验使用了相似浓度氢氧化钠液体。为了减少HA的解聚，反应15分钟后停止交联反应。用不同的摩尔浓度EGDGE或PGPGE/HA制备交联透明质酸钠凝胶的结果显示在表1。尽管，交联剂的含量相当的高，每一个交联透明质酸钠凝胶都含有较高的水（95）。交联剂的摩尔浓度和透明质酸钠是变化的0515，EGDGE交联的透明质酸钠凝胶在潮湿的状态下是有点脆，不适合在体皮下移植。这结果表明HA凝胶交联密度相对较低。这可以由于EGDGE与HA反应过低，（A）EGDGE具有水不相混性（B）HA溶液具有高的粘性。在降解试验中，使用方形EGDGE交联透明质酸钠凝胶是容易处理。图2显示了扫描电镜交联透明质酸钠凝胶的横断面。观察了覆盖致密的皮肤大孔海绵样结构。当HA凝胶含水超过95冷冻干燥样品形成大孔。由于交联透明质酸钠凝胶制备后切除方形平面，冷冻干燥致密的皮肤也将呈现。图2交联透明质酸钠凝胶凝胶冰冻干燥样品扫描电镜图为了在体试验中使用更好的机械性能的交联透明质酸钠凝胶，测试了PGPGE交联的透明质酸钠凝胶。PGPGE作为交联剂有两个好处第一溶于水，第二每个分子具有更多的环氧基团。尽管它有更高的水溶胀值，PGPGE交联透明质酸钠凝胶有好的机械性能，可以板样结构移植。图3表明在羟基存在的情况下交联透明质酸钠凝胶的降解结果。在这个例子中，方形交联透明质酸钠凝胶浸入含H2O2的液体中，然后加入确定量的FESO4。靠测量残留凝胶重量评价降解。尽管在H2O2中是稳定的，加入FESO4液体后交联透明质酸钠凝胶迅速降解。在图2图像显示降解依赖于FESO4液体加入的限制。一段时间凝胶达到恒定重量后迅速降解是由于H2O2产生了HO氧化FE2到FE3。以前，羟基水溶液中HA凝胶的解聚作用已经被广泛研究。H202和FESO4结合经常被使用产生羟基。这芬顿反应表示为下式FE2H2O2FE3OHOH关于由羟基降解HA并且形成其降解产物的机制，电子顺磁共振观察到了证据。HA与羟基反应是首先在碳抽出氢到葡萄糖醛酸羧基，引起糖苷的裂解。羟基被认为是最重要的活性组分，这具有在活性氧中最短的生命周期。例如报道1M羟基生命周期200S。我们的结果表明在其它氧化反应因子存在的情况下产生羟基降解了交联透明质酸钠凝胶并且降解以脉冲方式发生。在这个实验体系中，据认为由于当FES04溶解在H2O2的液体中速率与发生羟基速率相同，即使H202已经渗透到凝胶内部，羟基的产生发生在交联透明质酸钠凝胶表面。图3当FES04溶解在H2O2的液体中羟基交联透明质酸钠凝胶的降解图4当FES04溶解在不同浓度H2O2的液体中羟基交联透明质酸钠凝胶的降解因此，正像图3显示交联透明质酸钠凝胶的降解发生在正面。它也表明由于羟基短的生命周期大多数快速消失。为了控制药物传输释放以满足患者的生物需求，当生物需求结束时具有局部药的多聚体基质连续降解是可能的。从这一点看，交联透明质酸钠凝胶降解特性原理上使它适合于自反馈药物传输体系的应用。羟基的短生命周期使他很难检测交联透明质酸钠降解动力学。文献报道HA能与金属离子形成复合体像CU2和FE2，H2O2存在条件下该复合体引起位点特殊的氧化反应。这个系统的特性是FE2似乎束缚于HA,阻止没有液体情况下产生羟基，若非在透明质酸特殊位点产生羟基。在本研究中为了产生羟基，形成HAFE2复合体，交联透明质酸钠凝胶首先进入FESO4液体中，然后移到H202液体。图4显示在不同H202条件下交联透明质酸钠凝胶降解时间进程。这些交联透明质酸钠降解时间从几分钟到若干小时即依赖于羟基的产生又依赖于凝胶交联条件。通常，假设多聚体降解有三个可能的方法（1）优先于表面（2）均匀贯穿多聚体基质（3）靠上述机制结合。在这个体系中，可以预料是具有FE2的凝胶表面的H202反应产生羟基导致交联透明质酸钠凝胶降解。可以推测，没有透明质酸钠凝胶凝胶表面特殊位点FE2，H202不能侵入就没有透明质酸钠凝胶的降解。当然，理论上预测交联透明质酸钠凝胶降解动力学以表面降解为基础。如果MT是从方形表面任一时间T基质降解的量，那么方形样品块保留可表示为下式。DMT/DTBA6BH2BT21B是单位长度/时间表面降解速率，为多聚体密度,A为方块表面积，H为方块初始长度，方块表示MH32替代为H2BT3T是全部降解的时间，方程（1）能够与方程（2）、（3）整合表达部分多聚体降解相对时间。MT/ML1T/T34所有资料表明在图4方程4为降解周期基础的理论曲线，方程可以由下式表达。11MT/MM1/3T/T5以图4得到的方程5是显示在图5的线性关系。图5H2O2浓度（50500M）得到的方程5是显示在图5的线性关系。表2编号重量GH2O2MFE2降解率时间（MIN）降解率CM/SHA1035505,01005014104HA10325005,0100781104HA3037505,010018033105HA30335005,01004513104HA401555,01009022104HA4015505,01003414104图6微球羟基自由基降解透明质酸钠凝胶图7凝胶降解和微球释放速率这些结果表明羟基降解交联透明质酸钠凝胶发生由表面机制控制。前面报道的易受侵蚀表面的多聚体，定义侵蚀过程前面两个相对运动术语水的侵入速率为V1，多聚体侵蚀速率V2。当V2远大于V1时表面侵蚀过程发生，由多聚体摄入水的速率完全决定侵蚀速率。交联透明质酸钠凝胶表面降解被定义两个反应的相对速率V3为H2O2侵入速率，V4为羟基降解交联透明质酸凝胶速率。在这体系中，仅当V4大于V3时完成表面降解。在研究中使用H2O2浓度（50500M）是远低于凝胶中FE2（5MM）的浓度。一旦H202面临透明质酸钠凝胶表面，H202将与FE2迅速反应产生羟基。因为HA与FE2形成复合体防止H202进一步侵入凝胶。由于羟基的生命周期很短羟基将迅速消失透明质酸与羟基反应羟基反应相当迅速。图5提示该体系V4是快于V3。计算交联透明质酸钠凝胶降解图总结在表2。交联透明质酸钠凝胶降解率由方程3估算为105到104CM/S。本研究的实验条件下，102104NMOLH2O2，在凝胶中FE2仅是25NMOL，细胞吞噬过程中107白细胞释放055065NMOLH2O2/MIN。假设局部炎症发生24小时内H2O2全部的量被预期在102104NMOL，因此，在这研究中制备的交联透明质酸钠凝胶被降解与在体炎症发生的降解具有相似速率。发现激发诱导交联透明质酸钠凝胶降解快于酶降解。例如，尽管每克透明质酸用104105单位透明质酸酶，几分钟内降解透明质酸，用相同的酶浓度花了几个月时间降解交联透明质酸钠凝胶。这些详尽的研究资料将在以后文章中报告。在这种情况，降解的轮廓遵循表面控制机制，评估降解率是用107108CM/S这结果表明因为在活体透明质酸钠酶浓度是低于离体实验，移植后勿略不计酶降解交联透明质酸钠凝胶。在生理PH值条件下透明质酸羟基是阴电荷。假定靠静电排斥力或空间阻隔透明质酸酶侵入凝胶受到限制，说明对透明质酸钠凝胶由酶降解率很低。对维持药物维持侵入凝胶保持药物活性，来自交联透明质酸钠凝胶的物质的空间排斥是有用的。由于蛋白质不能渗入凝胶，例如透明质酸酶掺近凝胶的药物活力能被维持直到该药物被降解。无论怎样，为了建立药物释放与高水溶交联透明质酸表面成降解比例，人们考虑要求药物分隔贮存。关于药物参入交联透明质酸钠凝胶，提出降解的透明质酸钠基质内作为有用的一个异质药物微贮存结构。依据这一道理，若干个与生物相容性好的微颗粒例如脂微球白蛋白微球和其他微球引起了注意。在这研究中为了证实异质结构微球控制降解释放药物的可行性，聚苯乙烯被用来制备含有交联透明质酸钠凝胶的微球。图6显示靠羟基降解交联透明质酸钠凝胶及微球顺序释放的结果。图8羟基应答交联透明质酸钠凝胶台阶式降解图9在体炎症应答交联透明质酸钠凝胶降解从这图上可以结论基质降解的速率与微球释放速率一致。如果ST是任何时间T从方块表面微球释放的量,微球的表面的控制释放能被描述为下方程式5。11ST/S1/3T/T方程5和6以图6为基础显示在图7。图中线性关系表明交联透明质酸钠凝胶降解控