毕业论文-sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进

编号2011届本科毕业论文（设计）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进学院生命科学学院专业生物科学学号200740810235姓名孙静芳指导教师姬云涛职称副教授完成日期2011年5月目录摘要1关键词1ABSTRACT1KEYWORDS1引言11材料与方法211实验材料2111试剂2112主要仪器、设备212实验方法2121溶液的配制2122制胶3123电泳4124染色51241传统考马斯亮蓝染色法51242水浴加热法51243微波炉加热法5125染色结果观察62结果与分析621染色效果与操作的简便性622不同染色方法凝胶成像结果723染色时间73结论与讨论8参考文献8致谢10SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进姓名孙静芳学号200740810235指导教师姬云涛（07级生物科学2班）摘要针对传统的SDSPAGE染色法耗时长，脱色所用甲醇有毒，乙醇会同时把考马斯亮蓝颜色脱去，使蛋白质条带不清晰等问题，对常染法进行了改进。本文用水浴或微波加热处理，同时改变染色液和脱色液成分，用乙醇、蒸馏水代替甲醇，大大缩短了染脱时间，经过比较，认为改进后的水浴法所耗时间大大缩短，染色效果也较好。关键词SDSPAGE；考马斯亮蓝；水浴法；染色；脱色AMODIFIEDMETHODFORSDSPAGESTAININGNAMESUNJINGFANGSTUDENTNUMBER200740810235DVISORJIYUNTAOABSTRACTFORTHETRADITIONALSDSPAGETIMECONSUMINGSTAINING,COOMASSIEBRILLIANTBLUECOLORCANBETAKENOFFBYTHEETHANOLUSEDFORBLEACHING,METHANOLISTOXIC,THEPROTEINBANDSISNOTCLEAR,ANDOTHERISSUES,ANIMPROVEDMETHODFORTHECOMMONDYEINGISCOMINGBYUSINGAWATERBATHORMICROWAVEHEATTREATMENT,ATTHESAMETIMECHANGINGTHECOMPOSITIONOFDYEINGANDBLEACHINGLIQUID,ETHANOL,DISTILLEDWATERINSTEADOFMETHANOL,REDUCINGTHETIMEOFDYEINGOFFGREATLYBYCOMPARISION,THATTHEBATHINGMETHODIMPROVEDREDUCESTHETIMESIGNIFICANTLY,DYEINGBETTERKEYWORDSSDSPAGE；COOMASSIEBRILLIANTBLUE；WATERBATHING；STAINING；DECOLORIZATION引言继人类基因组计划之后，蛋白质组学已经成为21世纪生命科学研究的热点，对蛋白质高分辨率的分离和准确鉴定变得至关重要。目前分离蛋白质的主要方法之一就是采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPOLYACRYLAMIDEGELELECTROPHORESIS,SDSPAGE），它的支持介质是三维网状的聚丙烯酰胺凝胶。在催化剂的作用下，单体丙烯酰胺（ACRYLAMIDE，ACR）与N，N甲叉双丙烯酰胺（N,NMETHYLENEBISACRYLSMIDE，交联剂，BIS）发生聚合反应，生成凝胶介质。由于不同蛋白质分子大小和所带电荷的不同，从而对蛋白质进行分离，而分离后的电泳凝胶检测的染色方法也有多种，其中考马斯亮蓝染色法由于具有很强的特异性、较少的干扰因素、操作简便等优点，而成为蛋白质电泳检测和定量分析的一种常用方法。常用的考马斯亮蓝有G250，R350，和R250三种，在游离状态下，考马斯亮蓝G250为红色，其最大吸收值为488NM；而它与蛋白质结合后颜色由红色变为青色，在595NM波长下二者的结合物光吸收最大，光吸收值和蛋白质的含量成正比关系，所以可用于蛋白质的定量测定1。考马斯亮蓝G250是快染，能与蛋白质迅速进行结合反应，约2MIN即可达到平衡；它们的结合物在室温下1H内保持稳定。一般情况下传统考马斯亮蓝染色法染脱时间较长，约624H2，同时在多次漂洗、换液的过程中，凝胶表面容易被污染3，而且凝胶中的SDS会干扰考马斯亮蓝和蛋白质的结合，使染色效果受到影响。同时常染所用的甲醇易挥发，在人体代谢作用下会转化为甲酸，进而在人眼睛部位积累，对视神经细胞进行破坏，危害操作者健康4。本文采用考马斯亮蓝G250进行染色，通过水浴和微波热处理法，对传统的考马斯亮蓝染色法进行改进，以期达到大大缩短凝胶染色、脱色时间，从而使操作更简便，所用试剂更少，成本更低，更有利于操作者的健康的目的。1材料与方法11实验材料111试剂浓硫酸，甘油，巯基乙醇，N,N,N,N四甲基乙二胺（TEMED），浓缩胶缓冲液（1M的TRISHCLPH68），无水乙醇，冰乙酸，双蒸水，牛血清白蛋白（68KB），考马斯亮蓝G250，丙烯酰胺，N,N甲叉双丙烯酰胺，溴酚蓝，十二烷基磺酸钠SDS，甘氨酸，TRIS碱，过硫酸胺。112主要仪器、设备直流稳压电源，水平脱色摇床（太仓科技器材厂），移液枪，垂直电泳槽，凝胶成像分析仪（金西盟北京仪器有限公司），PH计，量筒，烧杯，容量瓶，电子天平（奥豪斯仪器上海公司），低温冰箱合肥美菱有限公司，双蒸水蒸馏器，灌胶支架，电磁炉（九阳股份有限公司），水浴锅，微波炉等。12实验方法121溶液的配制5121130的丙烯酰胺用电子天平分别称取丙烯酰胺292G，N,N亚甲基双丙烯酰胺08G，用60L热的双蒸水溶解，过滤，定容到100L。（由于未聚合的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性，操作均须戴口罩手套，并在通风处进行，保存于棕色瓶中，4存放。）121210十二烷基硫酸钠（SDS）用电子天平称取10GSDS粉末，于90ML双蒸水中加热至68溶解，定容至100ML，室温保存。121310过硫酸胺（AP）称取05G过硫酸铵于5ML双蒸水中溶解，4保存（需新鲜配制）。1214分离胶缓冲液（15M的TRISHCLPH88）用电子天平称取1816GTRIS粉末，于80ML双蒸水中溶解，PH计测量并用浓盐酸调节PH至88，后定容至100ML，4保存。1215TRIS甘氨酸5X电泳缓冲液分别用电子天平称取60GTRIS粉末和288G甘氨酸，用900ML双蒸水溶解，再加入1GSDS，用容量瓶定容至1000ML。12165X上样缓冲液分别量取06ML1MTRISHCLPH68缓冲液，5ML50的甘油，2ML10的SDS，05ML巯基乙醇，1ML1溴酚蓝，09ML双蒸水，混合，4保存待用。1217蛋白质原液的配制称取01G的牛血清白蛋白，于100ML双蒸水中溶解，即为1000G/ML的蛋白质原液。122制胶61221确定所要配制分离胶的浓度和体积。表1SDSPAGE凝胶的有效分离范围丙烯酰胺浓度（白质线性分离范围（KDA）15435156018753012060212由于实验所用标准蛋白的分子量为68KB，并结合其他文献综合考虑应选择浓度为10的分离胶。先用洗涤剂分别把玻璃板，样品梳，SPACE洗净，双蒸水冲洗几次，吹风机吹干。把SPACE安装到制胶架上，按要求用制胶模安装并固定好玻璃板两边均匀用力，插入梳子后，在距齿底约1CM的地方用记号笔做个标记，去除加样梳，以有利于目测分离胶灌制的大致位置。1222配制8ML10的分离胶。表2分离胶的配制比TEMED为加速剂应最后加入，烧杯中迅速混合均匀后，向玻璃板间一次性缓缓灌制分离胶到标记处，并立即沿玻璃壁来回移动注入一层双蒸水，水封，以排空气7。约20MIN后在分离胶和水层间出现一清晰界面，即表明胶已聚合5。1223待分离胶聚合完全后，倒去上层双蒸水，并用滤纸吸干。再配制30ML6的浓缩胶。表3浓缩胶的配制比双蒸水1MTRISHCLPH88缓冲液30ACRBIS10SDS10AP10TEMED30ML21ML28ML80L56L6L双蒸水1MTRISHCLPH68缓冲液30ACRBIS10SDS10AP10TEMED20ML400L600L36L24L4L加入AP和TEMED后，迅速混合，将浓缩胶灌制到分离胶上，接近矮板顶端，立即平行插入样品梳，避免气泡，放置30MIN1H，待胶充分聚合并老化。123电泳1231装好模板（矮板于内侧），把胶条去掉并装入电泳槽中，拔出加样梳，用电泳缓冲液冲洗加样孔。将TRIS甘氨酸电泳缓冲液用双蒸水稀释5倍，加到电泳槽中，胶膜内侧液面不可超过高板，但要没过矮板。1232加样（1）分别取不同浓度梯度（0001，0002，0004，0006，0008，001，002，003，004，005G/L）的蛋白质样品原液20L与5L5X样品缓冲液于离心管中混合，标记，用电磁炉沸水浴加热处理510MIN，用移液枪进行点样，每个点样孔的上样量为5L。（2）取相同浓度蛋白质样品原液20L与5L5X样品缓冲液于离心管中混合，加热处理510MIN，进行点样，每个点样孔的上样量为5L。1233电泳连接直流稳压电源，打开电源开关，设定浓缩胶电压为75V，时间50MIN，待溴酚蓝进入分离胶后电压改为150V，时间1H。1234电泳结束后，关闭电源，取出凝胶模，用铲子小心撬开玻璃板一侧，凝胶便贴在其中一块板上，去除浓缩胶，并切去分离胶一角做标记，取下分离胶于容器中，以待染色。124染色1241传统考马斯亮蓝染色法1（1）固定将电泳后的凝胶浸泡于200ML固定液（40甲醇，10乙酸，用双蒸水定容）中，于脱色摇床上轻微震荡30MIN，以充分固定。（2）放大将固定后的凝胶浸泡在200ML10的乙酸溶液中，摇床上震荡20MIN。（3）染色把凝胶浸泡在考马斯亮蓝G250染液（01G考马斯亮蓝G250溶解于200ML固定液中）中摇床上染色2H。（4）脱色弃去染液（可收集回收利用），取出胶并在双蒸水中漂洗数次，室温下用200ML脱色液10甲醇，10乙酸，双蒸水定容，于脱色摇床上震荡脱色34H，其间换液23次，直至背景清晰。1242水浴加热法（1）电泳后先把胶置于200ML双蒸水中，煮沸，于脱色摇床上摇几分钟冷却。（2）弃去水立即把凝胶放入热染液中（含染料、乙醇、乙酸），脱色摇床上进行染色20MIN。（3）弃去染液后，把胶于沸水浴中脱色两次，再用200ML脱色液（10乙酸溶液）常温脱色10MIN，效果更好（染色脱色过程中可在容器上加一层薄膜，以免试剂挥发太快，影响染色效果）。1243微波炉加热法（1）不经固定液固定，电泳后直接把胶浸于200ML双蒸水中，用微波炉强火加热3MIN，稍微冷却后再重复一次。（2）把胶没于200ML染液中，不含甲醇和冰醋酸，只加考马斯亮蓝和双蒸水，微波炉中加热3MIN，加快染色。（3）先用双蒸水把多余的染液洗去，再把凝胶置于200ML双蒸水中，微波炉加热3MIN，冷却后即完成脱色，暂时保存于纯水中。125染色结果观察把不同染色方法的凝胶转移至凝胶成像分析仪中，打开电源开关，选择白光，底座换为白板，调节光线和焦距，直至能清楚看到蛋白质条带，拍照并保存记录。2结果与分析21染色效果与操作的简便性图1三种染色方法的结果注蛋白质上样量均为5G/孔A传统考马斯亮蓝染色B水浴常染结合法C微波炉加热法由图可知，水浴热染法较传统染色法条带更为清晰，微波炉加热法背景色太重，不容易彻底脱去，不易观察，且容易损坏胶片。另外，传统染色法脱色所使用的乙醇有可能会同时把考马斯亮蓝的颜色脱掉，从而使蛋白质条带不清楚，而水浴和微波法只使用冰乙酸脱色，操作更简便，更安全。22不同染色方法凝胶成像结果12345678910图23种染色方法的灵敏度检测注110号蛋白质上样量依次为005，01，02，03，04，05，10，15，20，25G/孔A传统考马斯亮蓝染色B水浴常染结合法C微波炉加热法定量牛血清白蛋白加热变性后电泳，分别用三种不同的染色方法传统考马斯亮蓝染色、水浴常染结合法、微波炉加热法对三块平行的凝胶进行染色，比较三者的灵敏度。由图中可知，三种方法的灵敏度差异不大，其中水浴法蛋白质测定的灵敏度都为01G/孔。23染色时间表4不同染色方法所用时间比较时间（MIN）方法固定和放大染色脱色总时间传统染色法水浴加热法微波热染法5059120203至少1801533504015由表可知，传统考马斯亮蓝染色法所耗时间长达6H，甚至需要进行过夜脱色；而水浴和微波加热法大大缩短了染脱时间，水浴法总消耗时间40MIN，其5MIN沸水浴脱色效果和传统染色的过夜脱色相当；微波加热法更短达15MIN，所用试剂也较少，可循环使用。3结论与讨论高温有利于促进分子的自由扩散运动，加速试剂向凝胶中扩散和渗透。同时由于SDS对热不稳定，在80以下才相对稳定8，通过水浴或微波热处理，使SDSPAGE凝胶的温度达到100，从而分解了SDS，解除了SDS对考马斯亮蓝染色的扼制，使考马斯亮蓝染色得以顺利进行9；加热使蛋白质被快速固定，大大节省了固定和染色时间，降低了凝胶被污染的机会；同时由于不使用甲醇，降低了成本，也有利于操作者的身体健康。水浴考马斯亮蓝染色法检测的蛋白质灵敏度为01G/孔。水浴法中固定和染色的时间可由传统考马斯亮蓝染色法的3H缩短为25MIN，微波加热法则在10MIN左右，但微波炉加热法凝胶背景色较深，且容易损坏胶片，不容易把握，适用于蛋白质的快速分离。所以，总体上水浴法操作更简便快捷，效果更好，可用于蛋白质的测定。参考文献1BRADFORDMMARAPIDANDSENSITIVEMETHODFORTHEQUANTITATIONOFMICROGRAMQUANTIFIESOFPROTEINUTILIZINGTHEPRINCIPLEOFPROTEINDYEBINDINGANALBIOCHEM,1976,724822542CHENCQ,BELANGERRR,BENHAMOUN,ETALDEFENCEENZYMESINDUCEDINCUCUMBERROOTSBYTREATMENTWITHPLANTGROWTHPROMOTINGRHIZOBACTERIAANDPYTHIUMAPHANIDERMATUMJPHYSIOLMOLPLANTPATHOL,2000,5613233崔艳丽，王生余，张真微波技术在尿蛋白谱检测中的应用J现代检验医学杂志，2002,1735364谢克昌甲醇及其衍生物M北京化学工业出版社,2002065汪家政，范明蛋白质技术手册M北京科学出版社20006李林，张悦红生物化学与分子生物学实验教程北京化学工业出版社,20077MERRILCRGELSTAININGTECHNIQUESJMETHODSENZYMOL,1990,1824774888国家技术监督局十二烷基硫酸钠GB/T159631995S北京中国标准出版社,199608019叶长青SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进湖北工业大学学报2009，241618致谢在毕业论文即将完成之际，收获颇多，感触良深。论文完成的背后离不开可爱的亲们的支持和帮助。首先我要感谢我的指导老师姬云涛老师，姬老师严谨细致、一丝不苟的作风是我在人生路上的榜样。她在论文的选题以及实验方面给予了我无私的帮助，在忙碌的教学工作中抽出时间来审查我的论文，指出其中的不足，并不耐其烦的指导我进行论文的修改，在此特向姬老师表示我由衷的感谢；其次感谢屈长青老师，刘小丽和杨京霞老师，谢谢你们在实验过程中诸多方面给予我的指导，教会我科学的严谨态度和永不言弃的精神；也要感谢二楼和我一起做实验的“战友们”，我们一起走过大学最后的日子，在一次次“预实验”的失败之后，我们不断完善着自己，虽然忙碌但却很快乐；同时还要感谢07级生科二班的兄弟姐妹们，谢谢你们曾经给予我的关心和帮助，我们满怀希望，我们一腔热情，我们是一个可爱的大家庭。在这到处充溢着感伤的季节，在这离别的时刻，我心中满是不舍，但我想说“海内存知己，天涯若比邻”，我们不曾离开还有我宿舍的姐妹们，感谢你们大学四年的帮助，在我最悲伤的时候安慰我，在我最无助的时候支持我，快乐的时候我们一起疯狂，烦恼的时候我们一块分担，是你们给了我温暖，让我感受到“家”的温馨；最后要我要感谢我亲爱的父母，感谢你们的养育之恩，你们是我力量的源泉，永恒的动力大学四年即将结束，回头望去，有欢笑，有泪水，有遗憾，有感动我们一起携手走过这最为可贵的四年，最为难忘的四年。曾经，我们年少轻狂；现在，我们日渐成熟，我们都在经历华丽的“蜕变”。大学，虽然不尽完美，但却让我们学会更加珍惜，学会勇于追求自己想要的生活GANEMPLOYMENTTRIBUNALCLAIMEMPLOYMENTTRIBUNALSSORTOUTDISAGREEMENTSBETWEENEMPLOYERSANDEMPLOYEESYOUMAYNEEDTOMAKEACLAIMTOANEMPLOYMENTTRIBUNALIFYOUDONTAGREEWITHTHEDISCIPLINARYACTIONYOUREMPLOYERHASTAKENAGAINSTYOUYOUREMPLOYERDISMISSESYOUANDYOUTHINKTHATYOUHAVEBEENDISMISSEDUNFAIRLYFORMOREINFORMATIONABOUTDISMISSALANDUNFAIRDISMISSAL,SEEDISMISSALYOUCANMAKEACLAIMTOANEMPLOYMENTTRIBUNAL,EVENIFYOUHAVENTAPPEALEDAGAINSTTHEDISCIPLINARYACTIONYOUREMPLOYERHASTAKENAGAINSTYOUHOWEVER,IFYOUWINYOURCASE,THETRIBUNALMAYREDUCEANYCOMPENSATIONAWARDEDTOYOUASARESULTOFYOURFAILURETOAPPEALREMEMBERTHATINMOSTCASESYOUMUSTMAKEANAPPLICATIONTOANEMPLOYMENTTRIBUNALWITHINTHREEMONTHSOFTHEDATEWHENTHEEVENTYOUARECOMPLAININGABOUTHAPPENEDIFYOURAPPLICATIONISRECEIVEDAFTERTHISTIMELIMIT,THETRIBUNALWILLNOTUSUALLYACCEPTITIFYOUAREWORRIEDABOUTHOWTHETIMELIMITSAPPLYTOYOU,TAKEADVICEFROMONEOFTHEORGANISATIONSLISTEDUNDERFURTHERHELPEMPLOYMENTTRIBUNALSARELESSFORMALTHANSOMEOTHERCOURTS,BUTITISSTILLALEGALPROCESSANDYOUWILLNEEDTOGIVEEVIDENCEUNDERANOATHORAFFIRMATIONMOSTPEOPLEFINDMAKINGACLAIMTOANEMPLOYMENTTRIBUNALCHALLENGINGIFYOUARETHINKINGABOUTMAKINGACLAIMTOANEMPLOYMENTTRIBUNAL,YOUSHOULDGETHELPSTRAIGHTAWAYFROMONEOFTHEORGANISATIONSLISTEDUNDERFURTHERHELPIFYOUAREBEINGREPRESENTEDBYASOLICITORATTHETRIBUNAL,THEYMAYASKYOUTOSIGNANAGREEMENTWHEREYOUPAYTHEIRFEEOUTOFYOURCOMPENSATIONIFYOUWINTHECASETHISISKNOWNASADAMAGESBASEDAGREEMENTINENGLANDANDWALES,YOURSOLICITORCANTCHARGEYOUMORETHAN35OFYOURCOMPENSATIONIFYOUWINTHECASEIFYOUARETHINKINGABOUTSIGNINGUPFORADAMAGESBASEDAGREEMENT,YOUSHOULDMAKESUREYOURECLEARABOUTTHETERMSOFTHEAGREEMENTITMIGHTBEBESTTOGETADVICEFROMANEXPERIENCEDADVISER,FOREXAMPLE,ATACITIZENSADVICEBUREAUTOFINDYOURNEARESTCAB,INCLUDINGTHOSETHATGIVEADVICEBYEMAIL,CLICKONNEARESTCABFORMOREINFORMATIONABOUTMAKINGACLAIMTOANEMPLOYMENTTRIBUNAL,SEEEMPLOYMENTTRIBUNALSTHELACKOFAIRUPTHEREWATCHMCAYMANISLANDSBASEDWEBB,THEHEADOFFIFASANTIRACISMTASKFORCE,ISINLONDONFORTHEFOOTBALLASSOCIATIONS150THANNIVERSARYCELEBRATIONSANDWILLATTENDCITYSPREMIERLEAGUEMATCHATCHELSEAONSUNDAY“IAMGOINGTOBEATTHEMATCHTOMORROWANDIHAVEASKEDTOMEETYAYATOURE,“HETOLDBBCSPORT“FORMEITSABOUTHOWHEFELTANDIWOULDLIKETOSPEAKTOHIMFIRSTTOFINDOUTWHATHISEXPERIENCEWAS“UEFAHASOPENEDDISCIPLINARYPROCEEDINGSAGAINSTCSKAFORTHE“RACISTBEHAVIOUROFTHEIRFANS“DURINGCITYS21WINMICHELPLATINI,PRESIDENTOFEUROPEANFOOTBALLSGOVERNINGBODY,HASALSOORDEREDANIMMEDIATEINVESTIGATIONINTOTHEREFEREESACTIONSCSKASAIDTHEYWERE“SURPRISEDANDDISAPPOINTED“BYTOURESCOMPLAINTINASTATEMENTTHERUSSIANSIDEADDED“WEFOUNDNORACISTINSULTSFROMFANSOFCSKA“AGEHASREACHEDTHEENDOFTHEBEGINNINGOFAWORDMAYBEGUILTYINHISSEEMSTOPASSINGALOTOFDIFFERENTLIFEBECAMETHEAPPEARANCEOFTHESAMEDAYMAYBEBACKINTHEPAST,TOONESELFTHEPARANOIDWEIRDBELIEFDISILLUSIONMENT,THESEDAYS,MYMINDHASBEENVERYMESSY,INMYMINDCONSTANTLYALWAYSFEELONESELFSHOULDGOTODOSOMETHING,ORWRITESOMETHINGTWENTYYEARSOFLIFETRAJECTORYDEEPLYSHALLOW,SUDDENLYFEELSOMETHING,DOIT一字开头的年龄已经到了尾声。或许是愧疚于自己似乎把转瞬即逝的很多个不同的日子过成了同一天的样子；或许是追溯过去，对自己那些近乎偏执的怪异信念的醒悟，这些天以来，思绪一直很凌乱，在脑海中不断纠缠。总觉得自己自己似乎应该去做点什么，或者写点什么。二十年的人生轨迹深深浅浅，突然就感觉到有些事情，非做不可了。THEENDOFOURLIFE,ANDCANMEETMANYTHINGSREALLYDO而穷尽我们的一生，又能遇到多少事情是真正地非做不可DURINGMYCHILDHOOD,THINKLUCKYMONEYANDNEWCLOTHESARENECESSARYFORNEWYEAR,BUTASTHEADVANCEOFTHEAGE,WILLBEMOREANDMOREFOUNDTHATTHOSETHINGSAREOPTIONALJUNIORHIGHSCHOOL,THOUGHTTOHAVEACRUSHONJUSTMEANSTHATTHEREALGROWTH,BUTOVERTHEPASTTHREEYEARSLATER,HISWRITINGOFALUMNIINPEACE,SUDDENLYFOUNDTHATISNTREALLYGROWUP,ITSEEMSISNOTSOIMPORTANTTHENINHIGHSCHOOL,THINKDONTWANTTOGIVEVENTTOOUTYOURINNERVOICECANBEINTHEHIGHSCHOOLCHILDRENOFTHEFEELINGSINAPERIOD,BUTWASEVENTUALLYINFARCTIONWHENGRADUATIONPARTYINTHETHROAT,LATERAGAINSTOODONTHEPITCHHEHASSWEATPROFUSELY,LOOKEDATHISTHROWNABASKETBALLHOOPS,SUDDENLYFOUNDHIMSELFHASALREADYCANTREMEMBERHISAPPEARANCE童年时，觉得压岁钱和新衣服是过年必备，但是随着年龄的推进，会越来越发现，那些东西根本就可有可无；初中时，以为要有一场暗恋才意味着真正的成长，但三年过去后，自己心平气和的写同学录的时候，突然就发现是不是真正的成长了，好像并没有那么重要了；然后到了高中，觉得非要吐露出自己的心声才能为高中生涯里的懵懂情愫划上一个句点，但毕业晚会的时候最终还是被梗塞在了咽喉，后来再次站在他曾经挥汗如雨的球场，看着他投过篮球的球框时，突然间发现自己已经想不起他的容颜。ORIGINALLY,THISWORLD,CANPRODUCEACHEMICALREACTIONTOANEVENT,INADDITIONTORESOLUTELY,HAVETODO,ANDTIME原来，这个世界上，对某个事件能产生化学反应的，除了非做不可的坚决，还有，时间。APERSONSTIME,YOURIDEASAREALWAYSSPECIALTOCLEARWANT,WANT,LINEISCLEAR,ASIFNOTHINGCOULDSHAKEHISALSOONCESEEMEDTOBEDETERMINEDTODOSOMETHING,BUTMOREOFTENISHEBACKEDOUTATLASTDISLIKEHISCOWARDICE,FINALLYFOUNDTHATTHEREAREALOTOFLOVE,THEREAREALOTOFMISS,LIKESHADOWREALLYHAVEBEENDOOMEDTHOSEWHODO,JUSTGREENYEARSONESELFGIVEONESELFANARMINJECTION,ORISASELFRIGHTEOUSSPIRITUAL一个人的时候，自己的想法总是特别地清晰。想要的，不想要的，界限明确，好像没有什么可以撼动自己。也曾经好像已经下定了决心去做某件事，但更多的时候是最后又打起了退堂鼓。嫌恶过自己的怯懦，最终却发现有很多缘分，有很多错过，好像冥冥之中真的已经注定。那些曾经所谓的非做不可，只是青葱年华里自己给自己注射的一支强心剂，或者说，是自以为是的精神寄托罢了。ATTHEMOMENT,THESKYISDARK,THEAIRISFRESHFACTORAFTERJUSTRAINEDSUDDENLYTHOUGHTOFBLUEPLAIDSHIRTTHOSEWEREBROKENINTOVARIOUSSHAPESOFSTATIONERYFROMTHECORNERATTHEBEGINNINGOFDEEPFRIENDSHIPHAVEDECLAREDTHEENDOFTHEENCOUNTERTHATHAVENTSTARTPLANNINGTHOSEYEARS,THOSEDAYSOFDO,FINALLY,LIKEYOUTH,WILLENDINOURLIFE此刻，天空是阴暗的，空气里有着刚下过雨之后的清新因子。突然想到那件蓝格子衬衫；那些被折成各种各样形状的信纸；那段从街角深巷伊始的友谊；还有那场还没有开始就宣告了终结的邂逅计划那些年那些天的非做不可，终于和青春一样，都将在我们的人生中谢幕。BAUMGARTNERTHEDISAPPOINTINGNEWSMISSIONABORTEDRPLAYSANIMPORTANTROLEINTHISMISSIONSTARTINGATTHEGROUND,CONDITIONSHAVETOBEVERYCALMWINDSLESSTHAN2MPH,WITHNOPRECIPITATIONORHUMIDITYANDLIMITEDCLOUDCOVERTHEBALLOON,WITHCAPSULEATTACHED,WILLMOVETHROUGHTHELOWERLEVELOFTHEATMOSPHERETHETROPOSPHEREWHEREOURDAYTODAYWEATHERLIVESITWILLCLIMBHIGHERTHANTHETIPOFMOUNTEVEREST55MILES/885KILOMETERS,DRI