黑马羊繁育及高效养殖技术研究与示范项目验收报告

1科技报告报告名称“X黑马羊繁育及高效养殖技术研究与示范”项目验收报告支持渠道报告类别_验收报告_编制单位编制时间2科技报告基本信息表1报告名称（填写项目名称报告类别，20字以内）“X黑马羊繁育及高效养殖技术研究与示范”项目验收报告2作者及作者单位（对报告编写做出直接贡献的研究人员及其所在单位）宋德荣X市畜牧兽医科学研究所彭华X市畜牧兽医科学研究所周大荣X市畜牧兽医科学研究所江兴美X市畜牧兽医科学研究所王嘉福X大学3公开范围（分为公开和延期公开，延期公开需明确延期时间）公开4编制时间（YYYYMMDD）X07115报告编号（单位机构代码项目编号/顺序号）429790500X科合NY字20113064号6备注（需要注明的一些特殊事项，如延期公开报告的查询权限、免责声明、报告与其它工作或成果的联系等）本项目是以前期课题工作为基础开展研究，形成的报告仅反映本项目的执行情况，包括实施成效、取得的成果、创新及经济效益等。7摘要（1000字以内）项目是X省科技厅立项的农业攻关计划，其编号为“X科合NY字20113064号”。执行时间为X6月2014年6月。项目选择在赫章县的古达、威奢两个乡镇及X地区X畜牧开发有限责任公司实施，开展X黑马羊扩群繁育、生长及繁殖性状相关基因的多态性检测、杂交试验及高效养殖配套技术研究与示范等。项目采取切实可行的开放式选育路线，进行黑马羊的繁育与选育，就是把核心群农户中生产的、经培育的青年后备公羊推广到商品生产群中去，而选育点商品生产群农户中的优秀公羊又可引进到核心群农户中来，保证了选育群体优良基因的双向流动。同时，商品生产群农户中培育出的优良后代又向周边乡镇农户辐射，开展应用推广。项目实施三年，示范点建立黑马羊繁育示范户305户，建成黑马羊繁育种群4643只，三年累计向社会提供优质种羊5102只、商品羊13320只，推广人工种草150亩，开展天然草地改良400亩，指导养殖户新修和改造圈舍1530。开展技术培训、咨询指导532人次。通过选育，核心群周岁公、母羊体重比地方标准指标提高1369、1959，成年公、母羊体重比地方标准指标提高1242、1691；商品群周岁公、母羊体重比地方标准指标提高3963、4285，成年公、母羊体重比地方标准指标提高2474、2236。产羔率达15142，比X黑山羊地方标准平均值122提高2411。周岁公羊屠宰率达4850，比X黑山羊地方标准45高出778，比合同指标高05个百分点。项目发表论文28篇，其中SCI期刊1篇、中文核心期刊10篇；参编专著2部；参编技术手册1本；获国家实用新型专利授权1件；培养博士1名、在读博士1名、农推硕士1名，中级晋升副高2名，初级晋升中级5名，外派到X省遗传育种与繁殖重点实验室进行分子生物学三个月的短期培训1名；并在无角间性、扩群繁育、育种值估计等研究方法上实现了创新。项目实施三年，养殖户累计实现总产值170229万元，总经济效益123336万元，新增总产值53701万元，新增纯收入339404万元，人均增收322984万元，投入产出比为1363，投入新增纯收入比1084。综上所述，全面完成合同规定的目标任务及技术指标。8关键词（38个）黑马羊，扩群繁育，选育提高，生长及繁殖性状多态性检测，养殖技术研究示范项目名称X黑马羊繁育及高效养殖技术研究与示范依托部门X省科技厅计划名称X度X省农业攻关计划项目编号X科合NY字20113064号领域或专题生物育种第一承担单位X市畜牧兽医科学研究所参加单位X大学动物科学学院；X市X畜牧开发有限责任公司；XX生态牧业发展有限公司。总经费6690国拨经费30009项目信息项目负责人宋德荣起止年月姓名X电话EMAIL10联系人单位X市畜牧兽医科学研究所4目录1引言82主体部分921主要研究内容9211X黑马羊扩群繁育研究，建立黑马羊纯繁体系，开展扩繁应用研究及选育。9212建立BLUP动物模型及种公羊个体育种值的估测，优选种羊。9213X黑马羊生长及繁殖性状相关基因的多态性研究。9214X黑马羊导入同色毛被高产外血提高其生产性能的杂交试验研究。9215高寒山区高效养殖配套技术研究与示范。922主要考核指标9221建成核心群、扩繁群100户，规模1500只，生产群200户、规模3000只。9222核心群周岁、成年公母体重比X黑山羊地方标准二级种羊提高10，生产群周岁、成年公母羊体重及产羔率比标准提高20，周岁屠宰率达48。9223申请专利1项，培训500人次。9224省级以上期刊发表论文5篇，其中核心期刊3篇。10225培养研究生1名。10226三年累计提供种羊5000只，推广商品羊10000只；推广种草及草地改良500亩；指导圈改1000平方米；养殖户累计实现经济效益500万元。1023技术路线与实施方法10231技术路线10232实施方法1024考核指标完成情况11241实施地点11242示范规模12243生产性能12244自主知识产权135245人才培养13246技术培训13247经济指标14248资金使用情况1425研究内容完成情况14251X黑马羊扩群繁育研究取得进展14252建立了BLUP动物模型并应用于公羊个体育种值的估测21253开展了黑马羊生长及繁殖性状相关基因的多态性检测22254完成了黑马羊导入努比亚羊、简阳大耳羊的杂交试验34255开展了黑马羊高效养殖配套技术的熟化与集成示范3526项目实施取得的成效43261建立了有一定规模的黑马羊扩繁群体43262品种群结构及整齐度得到优化43263黑马羊生产性能显著提高43264黑马羊导入努比亚羊、简阳大耳羊血液可取得较好杂交效果44265高效养殖配套技术集成示范取得显著效果44266项目取得显著经济、社会及生态效益443结论部分4531摸索出了黑马羊的生长发育、扩群繁育规律4532初步掌握了黑山羊、黑马羊、无角间性羊的基因型存在形式4633初步得出颌下髯、颈部肉垂等外观性状在群体中所占比例4634初步得出了主要影响生长和繁殖性状的基因4635培育黑马羊具有较好的经济价值并丰富了生物的多样性4636关于无角与合下髯、颈部肉垂等外观特征的遗传机理研究4737熟化了一套高寒山区高效养殖配套技术476插图清单图1黑马羊060月龄生长曲线18图2黑马羊各时间段日增重走势19图3黑马羊基因组DNA电泳结果23图4GDF9基因PCR扩增结果23图5BMP15基因PCR扩增结果23图6ESR基因PCR扩增结果24图7ADAMTS1基因PCR扩增结果24图8GHSR基因PCR扩增结果24图9CIS基因PCR扩增结果25图10STAT5A基因PCR扩增结果25图11测序胶图26图12测序胶图26图13测序胶图26图14测序胶图27图15测序胶图27图16测序胶图27图17测序胶图28图18测序胶图287附表清单表1项目示范规模12表2项目种草、圈改示范规模12表3种羊初步选择标准14表4选育后体重与地方标准对照16表5不同杂交方式后代基因型表现形式20表6前20名种公羊育种值排名22表7变异位点的位置和突变的碱基类型28表8X黑马羊基因型频率和等位基因频率31表9X黑马羊体温、呼吸、脉搏变化对照39表10舍饲、放牧条件下角膜炎、口疮、腐蹄病、内科病对照408“X黑马羊繁育及高效养殖技术研究与示范”项目验收报告1引言X黑马羊是从X黑山羊中分化出来的一个新的品系，分布于赫章、威宁、纳雍等县，现存栏3万只左右1。经长期的黑马羊基地建设，其中形成了以赫章县古达乡为中心，威奢、兴发、达依等周边乡镇为辐射区域的黑马羊核心产区。上世纪90年代初以来，X市牧科所在上述区域一直从事黑马羊的基地建设、选育提高、无角间性性状的研究，前期取得了一些研究成果，初步掌握了无角性状、间性性状的遗传机理，掌握了其生长速度、繁殖性能水平，并优越于有角羊。其生产性能及马头、合下髯、颈部肉垂、黑色毛被等独特的外观特征，为品种的形成奠定了坚实基础，遗传特性稳定。但从整体水平来看，黑马羊在生产性能、扩群繁育、角性状的分化、合下髯和颈部肉垂遗传机理、无角纯合个体测交、养殖配套技术等方面还存在问题，这是项目的研究目的。本项目紧紧围绕这些问题，开展了黑马羊的扩群繁育、BLUP动物模型估测种公羊个体育种值、生长及繁殖性状相关基因的多态性检测、导入同色毛被高产外血的杂交试验及养殖配套技术的研究与示范等工作。项目的研究，初步掌握了黑山羊、黑马羊、无角间性羊的基因型存在形式；初步得出颌下髯、颈部肉垂等遗传特征在群体中所占的比例；摸索出了黑马羊的9生长发育、扩群繁育规律；把BLUP模型估测种公畜个体育种值的方法应用到黑马羊的选育上，并形成了一套X黑马羊高效生产养殖配套技术。本项目的研究内容除本课题外，在国内未见相关报道。2主体部分21主要研究内容211X黑马羊扩群繁育研究，建立黑马羊纯繁体系，开展扩繁应用研究及选育。212建立BLUP动物模型及种公羊个体育种值的估测，优选种羊。213X黑马羊生长及繁殖性状相关基因的多态性研究。214X黑马羊导入同色毛被高产外血提高其生产性能的杂交试验研究。215高寒山区高效养殖配套技术研究与示范。22主要考核指标221建成核心群、扩繁群100户，规模1500只，生产群200户、规模3000只。222核心群周岁、成年公母体重比X黑山羊地方标准二级种羊提高10，生产群周岁、成年公母羊体重及产羔率比标准提高20，周岁屠宰率达48。223申请专利1项，培训500人次。224省级以上期刊发表论文5篇，其中核心期刊3篇。10225培养研究生1名。226三年累计提供种羊5000只，推广商品羊10000只；推广种草及草地改良500亩；指导圈改1000平方米；养殖户累计实现经济效益500万元。23技术路线与实施方法231技术路线采取切实可行的开放式选育路线。为加大选择差，把核心群农户中生产的、经培育的青年后备公羊推广到基础群中去，而选育点基础群农户中的优秀公羊又可引进到核心群农户中来，保证了选育群体优良基因的双向流动。同时，基础群农户中培育出的优良后代又向周边乡镇农户辐射，开展应用推广。232实施方法1、把好核心群的组建关。对各个点的无角羊进行抽样测定，制定适宜的核心群种羊初步选择标准，符合标准的进入核心群，低于标准的进入基础群。2、把好种羊的日常鉴定关。根据黑马羊的生长发育水平和繁殖性能制订不相关性状的综合选择指数，作好种畜的鉴定工作。3、把好核心种畜的调换关。为避免近亲交配，不定期交换种公羊。为强化选种选配，血缘较近不配，非优质种公羊不配，等级低公羊与等级高母羊不配，幼龄公母羊不陪，老龄公母羊不配。4、把好“两期一培育”补饲育羔技术关。“两期一培育”系指加强11母羊妊娠后期2个月和哺乳前期2个月补饲管理和羔羊培育。主要解决传统养殖条件下，饲养管理粗放，饲料结构单一，营养不全，维生素、微量元素缺乏等引起的羔羊代谢性疾病。同时提高羔羊初生重、母羊泌乳量及体质，以解决羔羊死亡率高、母羊产后恢复慢和发情晚的问题。5、把好“三定”保健技术关。“三定”指定期防疫驱虫，定期消毒圈舍，定期强化健胃补饲，降低发病率和死亡率。根据X地区近年来发生的疫病和寄生虫感染情况，研究制定出X高寒山区黑山羊传染病防疫技术操作规程和预防性驱虫技术操作规程，为山羊健康养殖提供保证。6、开展技术培训和咨询、指导，以提高农户的饲养管理水平和疾病防治能力，为农村培养了一支永久型的技术队伍。7、不定期召开课题日常工作会，检查督促上次安排的工作任务，分析解决课题实施过程中出现的各种问题，深入讨论需攻关的一些技术问题，安排部署当前工作。8、整合X黑山羊选育成果转化与高效养殖技术示范（2012GB2F200408）项目资金配套，弥补项目资金的不足。24考核指标完成情况241实施地点项目示范点选择在赫章县的古达、威奢2个乡镇及X市X畜牧开发有限责任公司。12242示范规模1、项目实施三年，初步建立X黑马羊纯繁体系，三个示范点建立黑马羊繁育示范户305户、示范规模4643只，其中核心群（含扩繁群）102户、示范规模1596只，商品生产群203户、示范规模3047只。累计推广种羊5102只、商品羊13320只。表1项目示范规模核心群（含扩繁群）商品生产群合计示范点示范户（户）示范规模（只）推广规模（只）示范户（户）示范规模（只）推广规模（只）示范户（户）示范规模（只）推广规模（只）古达8513423926149223310259234357514185威奢131861018507372645639233663X4681584774168145574合计102159651022033047133203054643184222、推广人工种草150亩，开展天然草地改良400亩，指导养殖户改造圈舍1530（表2）。表2项目种草、圈改示范规模示范点人工种草（亩）草地改良（亩）圈舍改造（）古达501200威奢50400330X50合计1504001530243生产性能项目实施三年，示范点核心群（含扩繁群）周岁公、母羊体重比地方标准指标提高1369、1959，成年公、母羊体重比地方标准指标提高1242、1691；商品生产群周岁公、母羊体重比地方标准指标13提高3963、4285，成年公、母羊体重比地方标准指标提高2474、2236。产羔率达15142，比X黑山羊地方标准平均值122（108136）提高2411。周岁公羊屠宰率达4850，比X黑山羊地方标准45提高778，比合同指标高05个百分点。244自主知识产权1、申请国家专利2件，其中发明专利1件、实用新型专利1件。一种绵羊、山羊品种的提纯复壮方法，2012年6月4日申请国家发明专利1件，申请号2012101796743，处于实审阶段。一种适用于羊防疫驱虫及个体鉴定的工作台，X年6月8日获国家实用新型专利授权。2、省级以上期刊发表论文28篇，其中SCI期刊1篇、中文核心期刊10篇、优秀期刊17篇；参编专著2部；参编技术手册1本。245人才培养协助培养博士1名（201109201406）、在读博士1名（201209X12）、农推硕士1名（201204X06），中级晋升副高2名（201412、201512），初级晋升中级5名（201212、201311、201411、201511），X省动物遗传育种与繁殖重点实验室短期培训1名（20130508）。支持参加国际国内学术交流会4次，其中国际1次、国内3次，共计参加人员5人。246技术培训提高农户的饲养管理水平和疾病防治能力，三年来共开展技术14培训、咨询指导532人次。247经济指标项目实施三年，通过提纯复壮、扩群繁育，建立黑马羊示范群4643只，累计推广种羊5102只、商品羊13320只；推广人工种草150亩，开展天然草地改良400亩；指导养殖户新修和改造圈舍1530。养殖户累计实现经济效益123336万元，新增纯收入39404万元，人均新增322984元（见经济效益分析报告）。248资金使用情况项目总资金657万元，其中省科技计划拨款30万元、自筹资金357万元。根据审计报告显示，项目整合配套资金3667万元，专项资金支出3023万元，合计使用669万元。25研究内容完成情况251X黑马羊扩群繁育研究取得进展1、生产性能研究（1）初步选择标准选择根据实际测定数据和参考X黑山羊地方标准制订初步选择标准，以组建核心群（含扩繁群）和商品生产群。（表3）。表3种羊初步选择标准年龄性别体重（KG）体长（CM）体高（CM）胸围（CM）成年公32555265母29555265周岁公2250476015母185047606月龄公16454255母14454255（2）综合选择指数法选择制订不相关性状综合选择指数，严格选种选配，并做到无角种公羊的异地调换工作，严格控制近交程度。制定综合选择指数，对核心群进行选择留种、整群扩繁，是做好种畜的鉴定工作的重要参考指标。选择的目的不仅是要提高当代畜群的生产水平，更重要的是提高未来畜群的生产水平，即要求种畜能产生优良的后代。但是由于种畜本身的表型不能完全表示它产生优良后代的能力，因此，种畜的选择必须考虑其血统和性状的遗传特点。故，为加快选育的遗传进展，制订综合选择指数选择留种比较准确，现根据黑山羊的生长发育水平和繁殖性能制订不相关性状的综合选择指数，生长发育水平以外形评分性状表示，繁殖性能以产羔率性状表示。计算必要的数据畜群均数（PI）由本地区黑山羊的统计资料计算；性状遗传力（HI）参考有关育种文献而得；经济重要性（WI）根据各种性状在育种工作中的重要性确定。现将有关数据列出产羔率P1140H2103W1070外形评分P270分H2203W2030制订综合选择指数WIHI070030300303016WIHIPI1000700310003003100P1P2PIWIHI1360370035147P104286P2制订标准根据产羔率为136（X黑山羊地方标准上限）2、外形评分为70分以上的个体才能达入选条件，则制订的综合选择指数I5147136042867010000。因此，凡个体的综合选择指数达10000的则进入核心群，低于指标10000的淘汰进入商品群。（3）生产性能变化生长性能示范点核心群（含扩繁群）周岁公、母羊体重比地方标准指标提高1369、1959，成年公、母羊体重提高1242、1691；商品群周岁公、母羊体重提高3963、4285，成年公、母羊体重提高2474、2236（表4）。表4选育后体重与地方标准对照地方标准（二级种羊）2扩群选育后类别年龄性别体重范围KG平均体重KG体重KG比地方标准提高2629564351369周岁2226314581959核心群成年384272551124217333858572169116221926534123963周岁15181652357520428529333138675732474商品生产群成年262927533655542236繁殖性能通过选种选配，产羔率达15142，比X黑山羊地方标准平均值122（108136）2提高2411；宋德荣等报道X黑山羊胎产羔率为148813，黑马羊产羔率比其高261个百分点。肉用性能选择生长速度快的公、母羊留种，以提高胴体重量。据屠宰测定，周岁公羊屠宰率达4850，比X黑山羊地方标准45高出778，比合同指标高05个百分点；宋德荣等（2003）报道，周岁X黑山羊屠宰率为46363，黑马羊屠宰率高出462；李孟年等（1994）报道周岁羯羊屠宰率48684，比同龄X黑山羊羯羊高出474；成年羯羊屠宰率51614，比同龄X黑山羊羯羊高出628。X北麻羊是X三大地方山羊品种之一，罗卫星等（2010）报道，对X北麻羊屠宰测定，23岁羯羊屠宰率为4505、周岁母羊屠宰率为37685，比同龄黑马羊低。说明黑马羊具有较好的产肉性能。2、生长发育规律研究（1）生长发育曲线根据月龄、体重作出的累积生长曲线可见，X黑马羊19月龄18生长较快，其中13月龄最快，36月龄次之，69月龄稍缓，直到9月龄成为公、母羊的生长拐点。过了拐点，公羊948月龄、母羊936月龄均呈直线生长。黑马羊的这一生长发育规律，对羔羊3月龄断奶成活、912月繁殖初配、母羊补饲、肉羊育肥有着指导作用（图1）。图1贵州黑马羊060月龄生长发育规律FIGURE1GUIZHOUBLACKHORSEGOAT060MONTHSOFAGEGROWTHRULE0102030405060初生NEWBORN1月龄INJANUARYTHEAGE3月龄INMARCHTHEAGE6月龄INJUNETHEAGE9月龄INSEPTEMBERTHEAGE12月龄INDECEMBERTHEAGE24月龄24MONTHSOFAGE36月龄36MONTHSOFAGE48月龄48MONTHSOFAGE60月龄60MONTHSOFAGE体重（KG）WEIGHTKG图1黑马羊060月龄生长曲线（2）各年龄段公母羊日增重据测定数据统计，公、母羊日增重，03月龄分别为12956G、12633G，06月龄分别为8812G、8459G，09月龄分别为7216G、6385G，012月龄分别为7364G、6162G，024月龄分别为4600G、3666G，036月龄分别为3675G、3037G，048月龄分别为3360G、2227G，060月龄母羊为1525G。公、母羊日增重速度，03月龄最快，06月龄次之，09月龄与012月龄下降稍19缓且相当，024月龄、036月龄、048月龄、060月龄逐渐下降，公羊日增重速度比母羊快（图2）。表明肥羔生产最佳出栏时间为69月龄，为加快肉羊周转，提高出栏率，提供了理论依据。图1贵州黑马羊各时间段日增重走势FIGURE1GUIZHOUBLACKHORSEGOATEACHTIMEPERIODADGTREND020406080100120140030609012024036048060月龄MONTH日增重（G）ADGG图2黑马羊各时间段日增重走势3、放牧行为及鲜草采食量研究（1）放牧行为观察对10只成年黑马羊进行放牧行为观察，连续观察5天，全天放牧85个小时。结果表明，每只羊采食时间占6175，游走时间占1317，卧息时间占1183，彷徨时间占1300，哺乳时间占013，饮水时间占012。（2）鲜草采食量测定在秋季放牧条件下，每天随机对10只成年黑马羊进行鲜草采食量测定试验，结果表明，成年黑马羊日采食鲜草量为496KG，占体重1459，鲜草折合成风干物质089KG，占其体重的262。周寿荣等20（1985）测定，成都麻羊日采食鲜草量为494520KG，占体重127015806；杨秀歧等（1987）报道沿河山羊日采食量，春季为564KG，秋季为535KG，平均为550KG，日采食量占体重157019117。黑马羊日采食鲜草量与成都麻羊相近，低于沿河山羊，可能与品种、年龄的分组不同有关。4、有角、无角黑山羊基因型分析山羊无角性状是常染色体显性无角基因P引起（免疫遗传学分析）。间性羊的遗传基础为雌性，间性基因与无角基因相连锁，存在同一条常染色体上，间性基因纯合表现不育。间性基因用一对I、I表示，一旦II纯合，表示山羊间性不育8。依据有角、无角羊正反交试验及无角羊相互杂交试验分析，山羊的基因型存在多种形式，其中有角山羊存在PPII一种形式，正常无角山羊存在PPII、PPII和PPII、PPII四种形式、间性羊存在PPII、PPII两种形式（表5）。表5不同杂交方式后代基因型表现形式项目有角羊基因型无角羊基因型间性羊基因型有角无角PPIIPPII、PPII无角有角PPIIPPII、PPII无角无角PPIIPPII、PPII、PPII、PPIIPPII、PPII5、颌下髯、颈部肉垂特征遗传分析据对166只19个群体的黑马羊观察统计，有颌下髯占群体比例为8072，其中新田村为100，X公司为1667100，新田村稍高；有肉垂个体占群体比例为1928，其中新田村为30003889，X21公司为03333，X公司稍低。山羊的胡须是显性的性连锁遗传。山羊的肉垂由一个外显率完全的显性常染色体基因W控制，但表型有变异。不同品种的基因频率差别很大。张沅（2001）报道有肉垂（WW或WW）的母羊的多产性比无肉垂的母羊（WW）大约高7。颌下髯、颈部肉垂随着有目的的选育而上升，当无角亲本有颌下髯、颈部肉垂时，后代产生颌下髯、颈部肉垂的几率就高9。赫章县古达乡新田村黑马羊肉垂比例比X市X公司高，是由于新田村黑马羊选育基地建立的时间较长。关于极少部分有角羊也有肉垂，是不是有肉垂的无角母羊与有角公羊的杂交后代，还需继续观察。关于无角与肉垂是否存在连锁关系及遗传机理也有待进一步研究。无角、颌下髯、颈部肉垂等表型性状作为培育黑马羊品种的典型外貌特征，育种中具有非常重要的意义。252建立了BLUP动物模型并应用于公羊个体育种值的估测建立公羊单性状BLUP模型，估测种公羊个体育种值，优选继代种公羊。根据赫章县古达、威奢等选育点52只黑马种公羊261只子女的周岁体重鉴定记录，应用BLUP方法对可能影响黑马羊周岁体重的出生类型（单羔、双羔）、性别、出生年份和出生地点进行方差分析，设计出估测周岁重性状的BLUP线性模型为YXBZAE。式中Y为各性状观察值向量；B为固定效应；A为个体加性遗传效应；E为残差效应向量；X、Z分别为固定效应、个体加性效应的结构矩阵。利用建立的YXBZAE线性模型计算出了52只种公羊育种值，22按优劣次序排序，并选择前20名公羊作为核心群继代种羊（表6）。表6前20名种公羊育种值排名羊号育种值排序羊号育种值排序公羊4618241公羊27166411公羊20568682公羊281429512公羊49428083公羊31363713公羊26389844公羊481338514公羊19369775公羊501223115公羊38325926公羊321083316公羊8295527公羊50589817公羊7226298公羊360333318公羊31212189公羊350275619公羊6168610公羊420235220253开展了黑马羊生长及繁殖性状相关基因的多态性检测实验以GDF9、BMP15、ESR、ADAMTS1、GHSR、CIS、STAT5A等7个基因为候选基因，并进行PCR扩增及PCR产物纯化后测序。以便对影响繁殖性状的前4个基因、在影响生长性状的后3个基因进行多态性分析，以寻找显著影响繁殖性状和生长性状的主效基因。1、黑马羊基因组DNA的提取检测用1的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA，结果如图，从图3可知，大部分DNA样品质量都较好，条带单一、明亮，完整性较好、纯度和浓度都较高。个别DNA有轻微降解。提取的基因组DNA的浓度在3060NG/L之间可直接用于PCR反应。23图10GDF9基因PCR扩增结果图基因扩增结果图1BMP15基因PCR扩增结果图基因扩增结果图9黑马羊基因组DNA电泳结果图黑马羊基因组电泳结果图3黑马羊基因组DNA电泳结果2、PCR产物扩增检测本实验用1琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，从图可见，PCR扩增出的大小在500BP900之间的特异条带为目的条带，扩增产物条带清晰、明亮、整齐、无杂带。并且大小符合所要扩增的目的片断的大小，扩增结果见图4图10。图4GDF9基因PCR扩增结果图5BMP15基因PCR扩增结果24图6ESR基因PCR扩增结果图7ADAMTS1基因PCR扩增结果图8GHSR基因PCR扩增结果图12基因扩增结果图基因扩增结果图13基因扩增结果图基因扩增结果图14基因扩增结果图基因扩增结果25图9CIS基因PCR扩增结果图10STAT5A基因PCR扩增结果3、测序结果试验样品送到北京诺赛基因组有限公司进行直接测序。测序结果送回后，应用DNASTAR软件进行编辑，然后用CLUSTALX软件进行比对，并与GENBANK上公布的基因参考序列比对，检测出各个基因的变异位点。GDF9基因X黑马羊GDF9基因共检测出1个突变位点，在GDF9基因外显子2的562碱基处发生了突变AC。测序胶图见图16ST5A基因扩增结果图基因扩增结果图15I基因扩增结果图基因扩增结果26图11图11测序胶图BMP15基因X黑马羊BMP15基因共检测出1个突变位点,在BMP15基因外显子2的480位碱基处发生了突变CG。测序胶图见图12图12测序胶图ESR基因ESR基因共检测出2个突变位点,在第541位点发生了由GA碱基突变；第618位点发生了由GT碱基突变。测序胶图见图13图13测序胶图ADAMTS1基因X黑马羊ADAMTS1基因共检测出4个突变27位点,在第127位点发生了由AG碱基突变；第243位点发生了由GT碱基突变，303位点发生了由GT碱基突变403位点发生了由AG碱基突变。测序胶图见图14图14测序胶图GHSR基因X黑马羊GHSR基因共检测出2个突变位点,在第70位点发生了由TA碱基突变；第229位点发生了由GA碱基突变。测序胶图见图15图15测序胶图CIS基因X黑马羊CIS基因BLAST分析共发现3个SNPS，SNPS位点分别为T66C、G175T、C219A，均为新发现位点。测序胶图见图16图16测序胶图28STAT5A基因X黑马羊STAT5A基因BLAST分析共发现5个SNPS,SNPS位点分别为G256A、T269C、T275C、G289A、G298A均为新发现位点。测序胶图见图17、图18G256AT269CT275C图17测序胶图G289AA298G图18测序胶图4、变异位点和突变的碱基类型，见表7。表7变异位点的位置和突变的碱基类型品种基因变异位点突变碱基GDF9562ACBMP15480CGESR541GA618GTADAMTS1127AG243GT303GT403AG29GHSR73TG229GACIS66TC175GT219CASTAT5A256GA269TC275TC289GA298AG5、氨基酸序列同源性分析将本实验中所测得的扩增片段的突变和正常序列分别翻译成氨基酸序列，然后进行两两比较，发现在X黑马羊GDF9基因外显子2的562位编码的氨基酸改变,导致谷氨酰胺突变为脯氨酸；BMP15基因外显子2的480位编码的氨基酸改变,导致谷氨酰胺突变谷氨酸ESR突变没有引起氨基酸的改变。ADAMTS1基因的第九外显子有四个变异位点G127A，T243G，T303G，G403A其中G127A为错义突变，导致编码的丝氨酸（SER）变为苯丙氨酸（PHE）。T243G为错义突变，导致编码的亮氨酸（LEU）变为丝氨酸（SER）T303G谷氨酰胺（GLN），G403AG结氨酸VAL为同义突变，GHSR突变为同义突变，没有引起氨基酸的改变。但是同义突变自由能发生了改变，可能影响到蛋白质二级结构的稳定性。CIS基因第2外显子T66C错义突变，导致编码的亮氨酸（LEU）变为脯氨酸（PRO）；G175T错义突变，导致编码的丝氨酸（SER）变为酪氨酸（TYR）；在STAT5A基因中第六、七外显子检测出5个单碱基突变，五个突变皆为错义突变，导致编码的氨基酸发生改变；在256位点30发生了由GA碱基突变，突变导致编码的半胱氨酸（CYS）变为酪氨酸（TYR）；在269位点发生了由TC碱基突变,突变导致编码的缬氨酸（VAL）丙氨酸（ALA）在275位点发生了由TC碱基突变,突变导致编码的缬氨酸（VAL）丙氨酸（ALA）在289位点发生了由GA碱基突变,突变导致编码的精氨酸（ARG）组氨酸（HIS）在298位点发生了由AG碱基突变,碱基突变导致编码的组氨酸（HIS）精氨酸（ARG）。6、群体遗传学分析等位基因频率（ALLELEFREQUENCY）通常描述群体特征的指标是基因频率和基因型频率。基因频率是指一个群体中某一等位基因对其他等位基因的相对比率。基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。他们的计算公式如下（假设在一个基因座位上有两个等位基因）BANP2BANQ2其中P为等位基因A的频率，Q为等位基因B的频率NAA、NAB、NBB分别为群体中基因型为AA、AB、BB的个体数。基因型频率（GENOTYPEFREQUENCY）基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。他们的计算公式如下（假设在一个基因座位上有两个等位基因）BANHBANR31根据上述公式计算X黑马羊基因型频率和等位基因频率，见表8。表8X黑马羊基因型频率和等位基因频率基因样本数基因型频率基因频率GDF930AAACAC04313056870843401566BMP1530CCCGCG03655063450821701783ESR30GGGAGA02250077500887501125GGTGGT05250047500487505125ADAMTS130AAAGAG04218057820391906081GGGTGT03715066850215207848AAAGAG03811061890241407586GGGTGT04657053430354206458GHSR30TTTGTG06583034170494605054GGGAGA05348046520442705573CIS30TTTCTC06453035470803201968GGGTGT06242037580790302097CCCACA05861041390771702283STAT5A30GGGAGA04987050130435905651TTTCTC04653053470457805422TTTCTC05124048760445705543GGGAGA04971050290435705643AAAGAG0564204356046380536232根据山羊GDF9基因序列的第二外显子、BMP15基因序列的第二外显子、ESR基因部分外显子、ADAMTS1基因的第九外显子、GHSR基因的第二外显子、CIS基因的第二外显子、STAT5A基因的第六、七外显子序列设计引物，采用PCR产物直接测序法检验在X黑马羊品种中的基因多态性，并与产仔数、生长性能进行相关分析，结论如下对七个基因进行PCR扩增，确立了最佳PCR反应条件和反应体系，对PCR产物纯化后进行直接测序，测序结果显示X黑马羊品种的二个性转的七个基因中，影响繁殖性状及生长性状的六个基因均为中度多态。本实验在X黑马羊品种中检测GDF9基因在第2外显子的562BP处有1个AC的单碱基突变,碱基突变导致谷氨酰胺突变为脯氨酸。X黑马羊产羔数在两个基因型之间呈现出ACAA，差异极显著PCC，差异显著PGGAA，差异显著PTGGG，差异极显著PAGAA，差异显著PTGGG差异极显著P005）（表9）。表9X黑马羊体温、呼吸、脉搏变化对照饲养方式年龄测定天数（D）试验羊（只）体温（）呼吸（次/MIN）脉搏（次/MIN）舍饲6月龄7503932A061282478A45998922A13703周岁7503889B079422382A77798614A16677成年7503867B071951928B35237378B8202总计15038960758222636061830514838放牧6月龄7503941AA050272534A37458926A12284周岁7503890B067582446A38618772A12531成年7503881B164391954B31127482B695740总计150390410923114388839312625注同组内、同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P005）。疾病发生情况据X7月6日至9月15日的70D疾病观察试验，就观察的病种而言，舍饲组发病率为角膜炎1222、口疮1111、腐蹄病为0、内科病1000，放牧组发病率为角膜炎556、口疮778、腐蹄病222、内科病444。经T检验，舍饲组、放牧组两两对应疾病差异不显著（P005）（表10）。表10舍饲、放牧条件下角膜炎、口疮、腐蹄病、内科病对照舍饲组放牧组疾病种类6月龄周岁成年小计6月龄周岁成年小计角膜炎（只）632113115口疮（只）532103227腐蹄病（只）00000112内科病（只）43292114合计11963085518试验表明，舍饲饲养方式，发现山羊生活力下降，常见疾病发病率增高，易感冒，角膜炎、口疮常发，体弱消瘦。研究总结出舍饲适度增加山羊圈内运动24H，或半天放牧半天圈养的半舍饲养殖方式，可以提高机体抵抗力。（3）山羊半舍饲技术通过圈舍改造，饲养管理调整，每天放牧34小时，目的是既可采食一部分牧草，又可起到运动的作用；放牧回来后，公母分圈，空怀、妊娠分圈，生活力、抗病力与放牧条件下的山羊比较，基本无变化，41充分体现了半舍饲的优越性，人得到劳逸结合。6、疫病防控技术（1）X市山羊传染病防疫技术操作规程根据X常发生的疫病情况及流行病学特点，制定出X山羊传染病防疫规范。主要注射口蹄疫疫苗、小反刍兽疫疫苗、羊痘疫苗、羊传胸疫苗、羊“三联四防”疫苗（见图19）。图19山羊防疫技术操作规程（2）山羊同一年三次预防性驱虫技术操作规程根据寄生虫的生活特性和感染规律，制定了同一年三次驱虫技术操作规程第一次驱虫在45月份（为第一个感染高峰），春天到了，万物复苏，虫体开始活动。第二次驱虫在89月份（为第二个感染高峰），秋高气爽，放牧旺季，虫体最为活跃。第三次驱虫在1112月份，驱除潜伏在肠道内组织期幼虫，因进入冬季，虫体不活跃，可使羊只42在35月内主要寄生虫维持最低水平，使山羊有一个健康的体质。驱虫后要收集羊粪，并集中堆积发酵，以防止病原扩散，引起重复感染（见图20）。图20山羊预防性驱虫技术操作规程7、废弃物无害化技术集成示范按照养殖粪便发酵有机肥还田的模式，探索粪污无害化处理及资源化利用，实现雨污分离、干湿分离、引排分开，耕地、草地消纳（施肥）。特别是驱虫后收集到粪便，进行干湿分离后，采用自然堆积发酵，以防止病原扩散，引起重复感染。8、黑马羊繁育推广应用研究采取“科研所基地农户”的模式，在赫章古达乡观音、新田、石43板村建立核心保种区，威奢乡大寨、营盘村建立繁育点，X公司基地建立扩群点，三年时间推广种羊5102只、商品羊13320只。26项目实施取得的成效261建立了有一定规模的黑马羊扩繁群体项目实施，初步建立X黑马羊纯繁体系，三个示范点建立黑马羊示范户305户，存栏规模4643只，其中核心群（含扩繁群）102户、示范规模1596只，商品生产群203户、示范规模3047只。项目建成后年可向社会提供黑马羊种羊1800余只、商品羊4900余只。262品种群结构及整齐度得到优化采用核心群开放式选育方法，开展选种选配，使得三个示范点黑马羊种群结构发生了变化。据抽样统计公羊占1077，母羊占8923，公母羊比例为19。年龄结构上，13月龄羔羊占285，410月龄育成羊占2344，11月龄以上5岁以下种羊占7329，5岁以上淘汰羊042，群体处于一种动态的、后备力异常旺盛的状态。选育后，品种整齐度得到提高，同年龄个体大小基本相当，外观特征较为整齐，被毛黑色，颌下有髯，部分羊颈部有肉垂，背平直，躯体呈长方形，公羊雄壮，母羊清秀，品种整齐度大大提高。263黑马羊生产性能显著提高示范点选育后，核心群（含扩繁群）周岁公、母羊体重比地方标准指标提高1369、1959，成年公、母羊体重比地方标准指标提高1242、1691；商品群周岁公、母羊体重比地方标准指标提高443963、4285，成年公、母羊体重比地方标准指标提高2474、2236。对体重进行两样本均数差异显著性检验，选育后核心群（含扩繁群）、商品群周岁、成年公母羊体重极显著高于选育前（P001）。产羔率达15142，屠宰率达4850，净肉率3894。264黑马羊导入努比亚羊、简阳大耳羊血液可取得较好杂交效果经试验，努比亚羊、简阳大耳羊作为父本，黑马羊作为母本，可提高F1代生长速度，努马杂F1和简马杂F1初生重、3月龄断奶重、36月龄日增重均极显著高于黑马羊（P005）。初产母羊努马杂F1、简马杂F1、黑马羊纯繁群的产羔率分别为1567、1685、15142。265高效养殖配套技术集成示范取得显著效果示范点开展了提纯复壮技术、“两期一培育”补饲育羔技术、高寒山区羊舍建筑技术、疫病防控技术等集成示范，核心群（含扩繁群）周岁和成年公、母羊体重比地方标准指标提高10以上，商品群周岁成年公、母羊体重比地方标准指标提高20以上，产羔率达到了15142，羔羊成活率从7886提高到90。266项目取得显著经济、社会及生态效益1经济效益项目实施三年来，推广种羊5102只、商品羊13320只，种草550亩，圈改1530。养殖户三年累计实现总产值170229万元，总经济45效益123336万元，新增总产值53701万元，新增纯收入53701万元，人均新增322984元。投入产出比为1363，投入新增纯收入比1084。