致病性大肠埃希氏菌及其检验

致病性大肠埃希氏菌及其检验,1,大肠埃希氏菌,俗称大肠杆菌,是人类和动物肠道中正常菌群的主要成员,每克粪便中约含109个.大肠埃希氏菌随粪便排出后,广泛分布于自然界.水、牛乳及其他食品一旦检出大肠埃希氏菌，即意味着这些物品直接或间接被粪便污染。,2,正常情况下，大肠埃希氏菌不致病，而且还能合成维生素B和维生素K,生产大肠菌素，对机体有利。但当机体抵抗力下降或大肠埃希氏菌侵入肠外组织或器官时，可作为条件致病菌而引起肠道外感染。有些血清型可引起肠道感染。致病性大肠埃希氏菌属主要分为五大类，首先根据发病机理分为三大类，1、产毒素型大肠埃希氏菌(ETEC)，2、侵袭型大肠埃希氏菌(EIEC)3、肠道致病性大肠埃希氏菌(EPEC)近来又提出另外两类4、出血性大肠埃希氏菌(EHEC) 5、肠粘附性大肠埃希氏菌(EAEC),3,致病性大肠埃希氏菌中，一般认为能产生耐热ST)和不耐热(LT)肠毒素的两种菌株均可引起人的食物中毒。引起大肠埃希氏菌中毒的主要是一些动物性食品，如乳与乳制品、肉类、水产品等，牛和猪是传播这种病菌、引起中毒的主要原因。,4,1996年7月在日本就发生了大肠杆菌0157型引起的食物中毒，造成9017多人中毒，10人死亡，其原因与生食萝卜苗有关，其中92例并发出血性肠炎及出血性尿毒症。2001年，再江苏、安徽等地爆发的肠出血性大肠杆菌0157:H7食物中毒，造成177人死亡，中毒人数超过2万人。 如仔猪黄、白痢、猪水肿病、牛腹泻和败血症等均可由大肠杆菌引起。,5,一、埃希氏菌属生物学特性,形态与染色 本属细菌为革兰氏阴性两端钝圆、中等大小的无芽孢杆菌，绝大多数周生鞭毛，能运动，周身还有菌毛，不产生荚膜，某些菌株有荚膜。,普通大肠埃希氏菌Escherichia Coli,6,培养特性 1)需氧及兼性厌氧菌 2)对营养的要求不高，在普通琼脂上就生长良好，在15C-45范围内均可生长，但最适生长温度为37，最适pH为7.2-7.4。 3)在普通琼脂平板上培养24小时，可形成圆形、凸起、光滑、湿润、半透明、边缘整齐、中等大小的菌落其菌落与沙门氏菌比较相似，但是，大肠杆菌菌落对光(45角折射)观察可见荧光。 4)在肉汤培养基中生长18-24小时变为均匀浑，而后底部出现粘性沉淀物，并伴有臭味。,一、埃希氏菌属生物学特性,7,5）在鲜血琼脂平板上生长，有些菌株可见溶血环。 6）在远藤琼脂上长成带金属光泽的红色菌落 7）在SS琼脂平板上多不生长，少数生长的细菌，也因发酵乳糖产酸而形成红色菌落； 8）在伊红美兰琼脂上形成紫黑色具有金属光泽的菌落 9）在麦康凯琼脂上培养24小时后孤立菌落呈红色,8,埃希氏菌在SS琼脂平板上形成红色菌落,9,在麦康基培养基上培养的大肠埃希杆菌 大肠埃希杆菌产生粉红色乳糖发酵菌落。麦康基培养基是肠道细菌的选择培养基，含胆盐、乳糖和pH指示剂中性红。乳糖发酵菌落产生酸，将指示剂变红。（麦康基琼脂，18小时，37）,10,革兰氏阴性杆菌,11,12,革兰氏阳性杆菌,13,大肠杆菌扫描电镜照片,14,大肠杆菌透射电镜照片,15,大肠杆菌革兰氏染色照片,16,大肠杆菌平板菌落照片,17,一、埃希氏菌属生物学特性,生化特性 1）可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，有些不典型的菌株不发酵或迟缓发酵乳糖； 2）不同菌株对蔗糖，卫矛醇、水杨苷发酵结果不一致; 3）本菌可使赖氨酸脱鞍、不能使苯丙氨酸脱羧。 4）不产生H2S，不液化明胶，不分解尿素;,18,5）、不能在氰化钾培养基上生长，靛基质试验阳性，V-P试验阴性，不利用枸橼酸盐。后四项生化特性是典型的大肠埃希氏菌，与此不一致的即为非典型大肠埃希氏菌菌。 IMViC试验：如IMViC试验为+、+、-、-，且乳糖发酵，表明被检物已有粪便污染，有发生肠道传染病的危险，这是卫生细菌中常用的检测指标。（I：吲哚形成试验，M：甲基红试验，Vi：V-P试验，C：枸橼酸盐利用试验）,19,I-吲哚（indol）试验 色氨酸吲哚玫瑰吲哚 吲哚试剂,20,M-甲基红（methyl red）实验葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇 甲基红 -葡萄糖丙酮酸 甲基红 +,21,V-VP（Voges-Proskauer）试验 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰红色化合物+ 胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇,V-VP（Voges-Proskauer）试验 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰红色化合物+ 胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇,22,C-枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验,利用枸橼酸盐生长 + 不能利用 -,23,一、埃希氏菌属生物学特性,抵抗力 该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强，55经60分钟或60加热15分钟仍有部分细菌存活。 在自然界的水中可存活数周至数月，在温度较低的粪便中存活更久。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感，青霉素对它的作用弱, 易产生耐药菌株.,24,一、埃希氏菌属生物学特性,致病性：（1）致病因素 侵袭力:大肠杆菌具有抗原和菌毛,抗原有抗吞噬作用,有抵抗抗体和补体的作用,菌毛能帮助细菌黏附于黏膜表面.有侵袭力的菌株可以侵犯肠道表皮层引起炎症. 内毒素:大肠杆菌细胞壁具有内毒素的活性 肠毒素:有两种,不耐热肠毒素(LT),成分可能是蛋白质,加热65经30min即被破坏. LT与霍乱菌肠毒素作用相似,都是刺激小肠上皮细胞的腺苷环化酶,使ATP转变为CAMP,促进肠黏膜细胞的分泌功能,使肠液大量分泌,引起腹泻;耐热肠毒素(ST)无免疫性,耐热,100经10-20min不被破坏,也可使肠道细胞的CAMP水平升高,引起腹泻.,25,LT与ST的比较,26,一、埃希氏菌属生物学特性,致病性：（2）所致疾病 肠外感染：泌尿系统感染最常见病原菌。还可引起胆囊炎、肺炎、新生儿或婴儿脑膜炎。 腹泻：产毒素大肠杆菌是婴儿及旅游者腹泻的主要原因；致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要原因；侵袭型大肠杆菌主要引起较大儿童和成年人腹泻。,27,一、埃希氏菌属生物学特性,血清学特性 大肠埃希氏菌的抗原构造主要由菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)和荚膜抗原(K)三部分组成。 1）O抗原 成分为细胞壁上的糖、类脂和蛋白质复合物，也是细菌的内毒素，热稳定性较强，高压蒸汽处理2小时不被破坏。每一血清型只含有一种O抗原，本菌已发现有167种O抗原，分别以阿拉伯数字表示。 2）H抗原 为蛋白质；一种大肠埃希氏菌只有一种H抗原，无鞭毛则无H抗原，H抗原能在80度被破坏，也能被酒精破坏。H抗原共有64种。,28,3）K抗原 是细胞外部的荚膜或菌体表面物质，又称包膜抗原。新分离的大肠埃希氏菌70具有K抗原。根据K抗原耐热的敏感性可把K抗原分为A、B、L三类，共有103种，致病性大肠埃希氏菌的抗原主要为B抗原，少数为L抗原，B抗原与L抗原均可在煮沸后被破坏，A抗原耐热性强，可耐受煮沸1小时而不被破坏。， O抗原可将大肠埃希氏菌分成若干血清群，再根据K抗原和H抗原进一步分为若干个血清型或亚型，根据大肠埃希氏菌抗原的鉴定结果，写出其抗原式如O111：K58(B)H12，一般认为H抗原与致病性无关，因此，一般不需要进行H抗原的鉴定。,29,二、致病性大肠埃希氏菌的检验,致病性大肠埃希氏菌的检验应按中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法(微生物学部分)(GB4896-84)的有关内容进行检验。其检验程序如图52。,30,二、致病性大肠埃希氏菌的检验,（一）、增菌培养 1、以无菌操作的方法称取样品25g，加入225ml营养肉汤培养基中，可用灭菌砂在研钵中磨碎或以均质器打碎样品。 2、取适量接种于乳糖胆盐培养基中，测定大肠菌群MPN，其余移入500ml三角瓶中于361培养6小时。挑取一环，接种于一管30ml肠道菌增菌肉汤中，42增菌培养18小时。,31,二、致病性大肠埃希氏菌的检验,（二）、分离培养 1、将乳糖胆盐发酵阳性管液与增菌液分别划线接种于麦康凯或伊红美兰琼脂平板上。 2、于361培养1824小时观察菌落对于污染严重的食品可直接按划线法接种，不经过增菌过程。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵的菌落。,32,EMB平板照片及原理,原理：伊红美蓝琼脂平板含伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂。大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美兰结合（该两种染料即结合成复合物）使大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色的（龙胆紫的紫色）阳性菌落，从菌落表面的反射光中还可看到绿色金属闪光。在伊红美兰平板上的典型菌落呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。有的由于被检样品影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。,33,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征,34,EMB培养基，上为E.coli，下为伤寒杆菌,35,大肠杆菌在麦康凯琼脂（）的特征,麦康凯琼脂（）或伊红美兰（）琼脂平板上，置培养小时，检查有无疑似大肠杆菌菌落。大肠杆菌在麦康凯平板上的典型菌落呈鲜艳的桃红、粉红色.,大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板上的特征,36,大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板上的特征,大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂平板粘稠菌落的特征,37,沙门氏菌麦康凯琼脂平板菌落,不发酵乳糖,38,二、致病性大肠埃希氏菌的检验,（三）、生化试验 1、选取在麦康凯或伊红美兰平板上发酵乳糖或不发酵乳糖的菌落5个以上，分别接种于三糖铁(TSI)或克氏双糖铁琼脂(KI).同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、半固体、尿素琼脂、氰化钾肉汤和赖氨酸脱羧酶实验培养基。经36培养18-24小时。弃去H2S阳性或尿素酶阳性或阿拉伯糖阴性的培养物。 2、TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸, H2S阴性,氰化钾阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌. TSI底层不产酸或 H2S、氰化钾、尿素有任何一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶实验或革蓝氏染色镜检。,39,40,枸椽酸盐试验原理及斜面照片,枸椽酸盐试验：某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。大肠杆菌阴性,产气杆菌阳性.,41,枸椽酸盐试验原理及斜面照片,42,大肠杆菌：MR + /VP -,43,注关于大肠杆菌的反应的说明 大肠杆菌试验的模式反应，在一般情况下应为“”或将“”也包括在内，共代表了绝大多数大肠杆菌（占）的实际反应结果，因而受到了国际上的广泛承认，并将其列为大肠杆菌的常规鉴别反应公式。但个别大肠杆菌的反应，也可能出现“”和“”等等异常现象。由于这种异常反应出现的频率极少，没有普遍性的代表意义，因而在分类鉴别和统计学上，可以忽略不计。,44,致病性大肠埃希氏菌的检验,（四）血清学试验 假定试验： 从平板上选菌落生长稠密处挑取培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。不凝集的培养物可做阴性报告。当与某一种多价O血清凝集时,再与该多价血清所包含的单价血清做实验,如与某一种单价O血清呈现强烈的凝集反应,即为假定实验阳性.不凝集的培养物可做阴性报告。,45,致病性大肠埃希氏菌的检验,（四）血清学试验 证实试验： 制备O抗原悬液,稀释血清.稀释血清与抗原悬液在10mm75mm试管内等量混合,做试管凝集试验. （五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验 1、动物试验 将经过生化证实试验的大肠埃希氏菌培养物接种肉汤管，于36+1培养24小时，3000转分离心30分钟。取上清液用G6滤器过滤后分作两份，一份加热6030分钟，供ST测定用，另一份不加热，供LT测定用。,46,致病性大肠埃希氏菌的检验,（五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验 1、动物试验 1）家免结轧回肠段试验：取体重为2kg的家兔，禁食使肠内容物排空。麻醉后剖腹，取出回肠段，按10-15cm为一段，分段结扎，取一段注射肉汤2mL作为阴性对照，另一段注射已知产毒菌肉汤培养物的上清液2ml作为阳性对照。其他各段分别注射待试菌株肉汤培养物的滤液2mL。将腹壁缝合。 测定LT时，于注射后18小时剖腹检查 测定ST时，于注射后6-8小时剖腹检查 取出肠管分别抽取肠段的积液，测定其容量，并测定肠段的长度。积液量(mL)与肠段长度(cm)之比大于l者为阳性。,47,（五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验 1、动物试验 2）乳鼠灌胃试验：将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内,36度培养24小时,离心,取上清夜,注入1-4日龄乳胃内,禁食3-4小时,麻醉,取出肠管,称量肠管(包括积液)质量及剩余体质量,二者之比大于0.09阳性,0.07-0.09为可疑.,致病性大肠埃希氏菌的检验,48,致病性大肠埃希氏菌的检验,（五）、产肠毒素大肠埃希氏菌毒素试验 2、双向琼脂扩散试验: 将被检菌按5点环形接种于Elek氏培养基上，以同样操作共做两份，361培养48小时，在每株菌的菌苔上各放一片多粘菌素纸片，36+1经56时，使抗生素渗入琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的园并用一滴琼脂垫底。在一份平板的孔内滴加LT抗毒素30ul，另一份平板的孔内滴加ST毒素30ul。放于36+1经1520小时观察结果，在菌斑和抗毒素之间出现白