生化实验：过氧化氢酶Km的测定

1、1,过氧化氢酶Km的测定,2,一、实验目的,1.掌握Km值的概念，作图法求Km的常用方法。 2.掌握过氧化氢酶Km测定的原理和操作方法。,v为反应速度 S为底物浓度 vmax为最大反应速度 Km为米氏常数,二、实验原理（1.Hanes-Woolf作图法）,米氏方程表示底物浓度与反应速度的关系,在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。,米氏常数Km,Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 Km表示酶和底物之间的亲和能力， Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。 对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。,问题：如何测定酶的Km

2、值?,1 Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax,S Km S = + v Vmax Vmax,两边取倒数,两边乘以S,令S/v=y, S=x,y=b+ax,S V,S,S v,-Km,0,Km Vmax,Hanes-Woolf 作图法,二、实验原理（2.过氧化氢酶Km测定）,过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，铁起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。 2H2O2 2H2O+O2,CAT,8,H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。 2KMnO45H2O23H2SO4 2MnSO4K2SO45O28H2O 求出反应前后H

3、2O2的浓度差即为反应速度（V）。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。,二、实验原理（2.过氧化氢酶Km测定）,三、实验步骤,l血液稀释：吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml。取1ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1:1000稀释血液。 2H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度，求平均值。,3反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下

4、表操作。,依次加入1：1500稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，反应时间确保5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。 最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色（5个反应瓶的滴定标准要统一！），记录KMnO4消耗量(ml)。,H2O2标定的浓度： 0.004 高锰酸钾消耗的ml数(5/2)/2 2. 反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。 反应速度=加入的H2O2 mmol数剩余的H2O2 mmol数 即：H2O2 mol浓度加入的毫升数KMnO4 0.004 mol/L消耗的KMnO4毫升数 5/2 （式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数）,四、结果计算,按前述方法作图求得Km3.210-2mol/L。,3求Km值： 己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.08mol/L，列表计算如下：,五、实验结果,l过氧化氢标定浓度的计算：写出高锰酸钾的用量以及计算过程 2. P132 表 3.