微生物对木质纤维素类物质的降解

1、第一章 微生物对木质纤维素类 物质的降解转化 木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源，全世界每年产生1000亿吨。 我国每年可利用的木质纤维原料总量可达20亿吨以上，包括农作物秸秆（7亿多 吨）、林业纤维废料和工业纤维废渣等。 木质纤维素原料来源于木材、农业废 物、林业产品、城市垃圾等。 Wheat straw Corn stover Wood chip Bagasse Rice straw Sawdust 大量的木质纤维素得不到有效的利用。 燃料或在田间直接焚烧 污染了环境，能量利用率低，造成资源严重浪费. 如能很好的利用这些资源，不仅能避免资源浪费，解决能源危机，而且能大 大改善我们

2、的生态环境。 木质纤维素主要由木质素、纤维素和半纤维素相互嵌合而成。 1. 木质纤维素组成及基本结 构 Components of Lignocellulosic biomass Hemicellulose (both 5 and 6 carbon sugars) Ash Extractives Lignin (phenols) Cellulose (6 carbon sugars) 纤维素由葡萄糖单元通过-1、4键组成的长链大 分子。通常一条链中有10000多个葡萄糖分子。 纤维二糖可以看作它的二糖单位。纤维二糖可以看作它的二糖单位。 1.1 纤维素 纤维素链中，每个残基纤维素链中，每个残基

3、 相对于前一个残基翻转相对于前一个残基翻转 180180度，使链采取完全度，使链采取完全 伸展的构象。相邻、平伸展的构象。相邻、平 行的伸展链在残基环面行的伸展链在残基环面 的水平向通过链内和链的水平向通过链内和链 间的氢键形成片层结构，间的氢键形成片层结构， 环面的垂直向靠其余氢环面的垂直向靠其余氢 键和环的疏水内核之间键和环的疏水内核之间 的范德化力维持。的范德化力维持。 纤维素大分子聚集态结 构 纤维素大分子的聚集可分为结晶区和无定形区. 结晶区：若干个纤维素分子链聚集成束，排列整齐 有序，相互靠的很近，呈现清晰的X射线图； 无定形区：分子链排列不整齐、较松弛，但其取向 大致与纤维主轴平

4、行。 结晶区和无定形区共同构成了纤维素纤维。 分别称为结晶纤维素( crystalline cellulose)与 无定形纤维素(amorphous cellulose ) 。 纤维素的结晶部分没有游离的羟基存在，具有牢固的结晶构造，酶分子及水分子 难以侵入到内部。因此，纤维素的结晶部分比非结晶部分难分解得多。 纤维素的聚集态，即所谓纤维素的超分子结 构，由结晶区和无定形区交错结合的体系， 从结晶区到无定形区是逐步过渡的，无明显 界限，一个纤维素分子链可以经过若干结晶 区和无定形区。 每一个结晶区称为微晶体。 纤维素的细纤维结构 纤维素在结构上可以分3级: (1)单分子级，即葡萄糖的高分子聚合

5、物; (2)超分子级，自组装的结晶的纤维素晶体; (3)原纤结构级，纤维素晶体和无定形纤维素分子组成的，进一步自组装的 各种更大的纤维结构。 若干纤维素分子聚合成结晶宽度为3-5nm的基 元原纤(elemenatary fibril )。 基元原纤聚集形成横截面直径约为7-30nm、 长度不固定的微原纤(microfibril) ，其中散布 着半纤维素，因为木质化过程发生在天然纤维 素合成的后期，所以木质素主要位于与半纤维 素共价相连的微原纤的外层。 纤维素微原纤聚集形成横截面约为200nm X 200nm、长度不等的大原纤(macrofibril)。 纤维素的结晶度及可及度 纤维素的结晶度是

6、指结晶区占纤维素整体的百 分率，它反映纤维素聚集时形成结晶的程度。 纤维素物料的结晶度大小，随纤维素样品而异。 据测定，种毛纤维和韧皮纤维纤维素的结晶度 为7080，木浆为6070，再生纤 维约为45。 100a 结晶区样品含量 结晶度 结晶区样品含量非结晶区样品含量 结晶度与纤维性能的关系 纤维结晶度升高，则： 1）纤维的吸湿性下降； 2）纤维润胀程度下降； 3）纤维伸长率下降； 4）纤维的抗张强度上升。 纤维素物料的可及度 利用某些能进入纤维素物料的无定形区而不能 进入结晶区的化学试剂，测定这些试剂可以到 达并起反应的部分占全体的百分率称为纤维素 物料的可及度。 纤维素影响水解的各种性 质

7、 纤维素的结构特征与酶水解之间的关系得到了广泛的研究，但是仍未全面了解。 一般认为纤维素的结构特点是其水解速率的限制因素，包括结晶度 (Crystaillinity Index, CrI )、聚合度(Degree of Polymerization)和 可及性(Accessibility )等。 纤维素的结晶度(CrI ) 通常认为结晶度是表明底物反应活性的指标。 真菌纤维素酶对非晶形纤维素的水解速率比结晶 纤维素的水解速率高1-2个数量级。 根据假说，在纤维素水解过程中，无定形纤维素 先被水解，因此在水解后，剩余纤维素的结晶度 将升高。 然而，部分研究发现在酶水解过程中结晶度没有 增加。很难

8、认定CrI是酶水解速率的关键决定因素。 纤维素的聚合度(Degree of Polymerization, DP ) 纤维素的水溶性随DP的升高而迅速降低。聚合 度为2-6的纤维糊精可溶于水，而聚合度为7- 13或更高的纤维糊精微溶于热水。DP为30的 葡聚糖已经具有纤维素聚合物的结构和性质特 点。 根据底物的来源和预处理方法的不同，纤维素 底物的DP变化非常大。 纤维素DP对酶解速率的作用主要表现在对外切 酶的影响。外切酶作用于链端，因此聚合度较低 的纤维素底物具有更多的外切酶作用位点。 水解过程中DP的变化则取决于外切和内切酶的比 例以及纤维素的性质。由于外切酶在链端依次水 解纤维素链，因

9、此只能有限降低DP，而内切酶作 用于链内，能快速降低DP，导致链端的大量增加。 纤维素的可及性 (Accessibility ) 在不溶性纤维素水解之前，纤维素酶必须结合到底物颗粒的表面。 纤维素颗粒的三维结构以及纤维素酶的大小和形状，决定了纤维素酶能否进 攻到1，4葡萄糖苷键，即纤维素酶能否发挥其水解纤维素的作用。 纤维素颗粒的内表面取决于毛细作用的结构和粒 子内的孔道(1-10nm)及粒子间的空间(5um) 。 而纤维素颗粒的外表面积则与其形状和颗粒大小 相关。 纤维素酶的吸附性和纤维素的反应活性，随着纤 维素颗粒体积的降低而不断升高。一些处理方法 在降低纤维素结晶度的同时也增加了其表面积

10、， 提高纤维素的水解速率。 在决定水解速率的因素中，纤维素的可及性比结 晶度更为重要。 除了以上三种因素，半纤维素、木素对纤维素的包被作用，纤维素表面的 平整度、纤维素的结晶形态等多种因素对纤维素的酶解效率都有显著的影响。 1.2 半纤维素 半纤维素是一类杂多糖，由五碳糖和六碳糖组 成的短链异源多聚体。 将植物纤维中多种糖基、糖醛酸所组成的、带 有支链的复合聚糖总称为“半纤维素”。 组成：由聚戊糖（木糖和阿拉伯糖）、聚已糖 （半乳糖、甘露糖）及聚糖醛酸（葡萄糖醛酸 和半乳糖醛酸）等组成。 根据其化学组成中主要单糖的成分，常将半纤 维素从结构上分为四类：(1)聚木糖，(2)聚甘 露糖， (3)聚

11、木糖葡萄糖，(4)聚混合-葡萄 糖。 木聚糖分四大类：a.线状同聚木聚糖( linear homoxylan); b.阿拉伯木聚糖 (arabinoxylan); c.葡萄糖醛酸木聚糖 (glucuronoxylan ) ; d.葡萄糖醛酸阿拉伯木 聚糖(glucuronoarabinoxylan)。 双子叶植物(阔叶木和草本植物) ，主要为聚 木糖型半纤维素。在一些单子叶植物中(如禾 木科和谷类植物)，聚木糖的含量可达50%以 上。 半纤维素是无定形物质，是填充纤维之间和 微纤丝之间的“粘合剂”和“填充剂”. 其聚合度较低(多数为80-200），易吸水润 涨。 半纤维素在植物组织中的含量仅次

12、于纤维素， 约占一年生草本植物残体重量的2540%， 占木材的2535%。 木质素 空腔 纤维素 木质素存在于除苔藓和藻类外所有植物的细胞壁中， 木质素的存在使植物具有一定的硬度，能够抵抗机 械压力和微生物侵染。 1.3 木质素 是结构复杂多样、稳定的生物大分子物质。 由苯丙烷单元(愈创木基丙烷、紫丁香基丙烷和 对羟基苯丙烷)通过醚键和碳-碳键相连接组成的 复杂的不溶性芳香族高聚物。 分子大(相对分子质量1.0X 105)、溶解性差， 微生物与酶不易与之结合，是目前公认的难降解 的芳香族化合物之一。 聚合 交联 按照植物种类不同，木质素可分为针叶材、阔 叶材和草木植物木质素三大类。 针叶材木质

13、素主要由愈创木基丙烷单元所构成， 阔叶材木质素主要由愈创木基丙烷单元和紫丁 香基丙烷的结构所构成， 草木植物木质素主要由愈创木基丙烷单元和紫 丁香基丙烷单元及对羟基苯丙烷单元所构成。 木质素结构单元的苯环和侧链上连有各种不 同的基团：甲氧基、酚羟基、醇羟基、羰基 等，也可以是氢、碳、烷基或芳基。 木质素大分子醚键和碳碳键的连接部位，可 发生在苯环酚羟基之间，或发生在结构单元 三个碳原子之间，或发生在苯环侧链之间。 木质素是一个大的分子网络，通常以木质素中若干结构单元、各结构单元的 比例及相互之间的联接方式加以说明，要严格确定它的结构式十分困难。 在不同植物纤维原料中，木质素的结构不同，即 使在

14、同一原料不同部位，木质素的结构也不相同。 木质素在结构上具有庞大性和复杂性，在化学上 具有极不稳定性，当受到化学试剂、温度、酸度 影响时，都会发生化学变化，即便在较温和的条 件下，也会发生缩合作用。 迄今为止，没有一种方法能得到天然木质素，这 给木质素研究造成一定困难。 在植物细胞壁中，木质素与半纤维素以共价键的形 式结合，形成木质素与碳水化合物复合体LCC (lignin-carbohydrate complex)，将纤维素分 子包埋在其中，形成一种天然的屏障。 在植物细胞壁中纤维素和半纤维素之间无共价 键连接，半纤维素与纤维素微纤丝之间存在氢 键和范德华力，从而形成二者之间的紧密结合。 半

15、纤维素和纤维素之间之所以呈现出相互作用 是由于在细胞壁的形成阶段，半纤维素的合成 和沉积始终和纤维素紧密联系。半纤维素通过 增加氢键结合吸附在纤维索的表面来提高纤维 网络之间的强度。 2 木质纤维素的预处理 预处理的目的：打破纤维素分子的结晶结构，解除木 质素的阻碍和保护层，使材料变得蓬松，易于 被纤维素酶作用。 未经预处理的原料，其水解率低于理论值的20%，而经预处理后的水解率可达 理论值的90%以上。 预处理方法 物理方法： 研磨、蒸汽爆裂、高能辐射、冷冻处理 化学方法： 碱处理、溶剂处理、酸处理 微生物处理： 包括机械粉碎(球磨、压缩球磨)，高温蒸煮、 微波处理和高能辐射等。 通过缩小生

16、物质的粒度降低结晶度，破坏木 质素和半纤维素的结合层，使物料的比表面 积相对增大，软化生物质，使部分半纤维素 从生物质中分离、降解，增加纤维素的可及 性，提高纤维素的酶解转化率。 2.1 物理预处理法 2.2 化学预处理方法 酸、碱、臭氧和有机溶剂处理等方法。 其机理主要是使纤维素、半纤维素和木质素吸胀并破坏其晶体结构，从而增加其可降解性。 浓酸水解 是指用浓度在30%以上的硫酸、盐酸和磷酸 将生物质水解成单糖的方法。 优点：糖转化率高，纤维素和半纤维素的转 化率都高达80%以上。 缺点：反应速度慢，工艺流程复杂，形成的 产物不是葡萄糖而是寡糖等，浓酸必须回收 且工艺流程的管路和反应器采用耐腐

17、蚀材料。 稀酸处理 稀酸处理一般指用10%以内的硫酸、盐酸、磷 酸等酸为催化剂将纤维素、半纤维素水解成单 糖的方法，反应条件温度为100240，压 力一般高于10个大气压，反应几秒钟至几分 钟。 反应进程快， 适合连续生产，酸液无需回收； 缺点是所需温度和压力较高，生成的降解产物 对发酵有抑制作用，反应器材质要求耐酸蚀材 料。 在酸处理过程中，半纤维素脱乙酰基产生乙酸和糖类降解产生的少量糠醛具有毒性， 对后期的发酵有一定的抑制，通常采用离子交换、过量石灰中和等措施脱毒，或选 育和使用能抗毒性的发酵菌。 碱处理法是利用木质素能溶解于碱性溶液的特点，用稀氢氧化钠或氨溶液处 理生物质原料，破坏其中木

18、质素的结构，便于酶水解的进行。 碱预处理操作简便，成本较低，环境污染严重。 2.3 生物预处理法 利用分解木质素的微生物除去木质素，以解除 其对纤维素的包裹作用。 他们产生分解木质素的酶类，专一性地降解木 质素，提高纤维素和半纤维素的酶解糖化率， 其中最有效的是白腐菌。 白腐菌在次级代谢中产生木质素降解酶、木质 素过氧化物酶和依赖锰的过氧化物酶。 木质素在真菌作用下的生物降解过程，是在常温、 常压和近中性pH值的条件下进行的，降解的最终 产物是二氧化碳和水。 优点：作用条件温和、能耗低、专一性强，不存 在环境污染，处理成木低等。 缺点：木质素降解微生物种类少，木质素分解酶 类的酶活力低，作用周

19、期长等问题，在处理过程 中部分纤维素和半纤维素会被细菌消耗掉。 2.4 物理化学预处理方 法 将物理处理与化学处理相结合， 以提 高预处理效果。 主要包括蒸汽爆破、 SO2 蒸汽爆破、氨纤维爆裂、 CO2爆破、高温热解预 处理。 蒸汽爆破预处理 1928由W. H. Mason发展起来的，采用160 -260饱和水蒸汽加热原料至0.69-4.83MPa， 作用时间为几秒到几分钟，然后骤然减压至大气 压。 作用机理：高压蒸汽渗入纤维内部，以气流的方 式从封闭的孔隙中释放出来，使纤维发生一定的 机械断裂，木质素、半纤维素结合层被破坏，高 温高压加剧纤维素内部氢键的破坏，游离出新的 羟基，纤维素内有

20、序结构发生变化，纤维原料结 构疏松， 大大增加了生物质的比表面积和孔隙 度。 对不同的物料，需要不同的汽爆温度和保留时 间，有学者把蒸汽温度和保留时间融合为一个 参数-汽爆强度。何一种物料都有自己的最佳汽 爆温度和时间参数。 弊端：需要消耗大量的蒸汽。 2007年8月，河南天冠集团建了年产3000吨的 纤维素乙醇生产线 ，就用到了蒸汽爆破技术。 SO2催化的蒸汽预处理 在蒸汽爆破预处理过程中添加 SO2 气体， 旨在提高纤维素和半纤维素的转化 率和酶水解效率。 处理过程中SO2酸性气体形成的酸促进了水解， 该法能显著提高半纤维素水解程度，成本高于 蒸汽爆破，但比氨纤维爆破低。 SO2进行预处理

21、不会像H2SO4一样腐蚀设备， 容易更快渗透原料，最大缺点是高毒性。 氨纤维爆破爆破法 (ammonia fiber explosion AFEX) 是一种用物理化学方法处理生物质原料的技术。 和蒸汽爆破预处理类似，是将木质纤维素原 料在高温和高压下用液氨处理，然后突然减 压，造成纤维素晶体的爆裂。 典型的AFEX工艺中，处理温度在60-95， 维持时间2030min， lkg固体原料用1 - 2 kg氨。 氨纤维爆破预处理可去除部分半纤维素和木质素，降低纤维素的结晶性，引 起纤维素的溶胀及晶体结构状态的改变，提高纤维素酶和纤维素的接近程度。 不太容易形成发酵抑制物，能量消耗和投资成本也比较合

22、理。 2.5 木质纤维素的酸水解及抑制物的形成 半纤维素经过酸水解，产生木糖、甘露糖、半乳 糖、葡萄糖和乙酸，而纤维素经水解产生葡萄糖。 在高温和高压下，木糖进一步降解形成糠醛，葡 萄糖会降解形成羟甲基糠醛。 糠醛和羟甲基糠醛进一步降解会生成甲酸。 木质素被降解时会产生酚类化合物，这类化合物 也会在碳水化合物的降解中产生。 木质纤维素的水解产物及产生的发酵抑制物 预处理方法的选择主要从提高效率、降低成本、 缩短处理时间和简化工序等方面考虑。 满足下列要求：产生活性较高的纤维，其中 戊糖较少降解；产物对发酵无明显抑制作用； 成本较低；固体残余物较少，容易纯化； 分离出的木素和半纤维素纯度较高，可

23、制备 相应的其他化学品，实现生物质的全利用. 3.微生物对纤维素的转化 降解纤维素的纤维素酶降解纤维素的纤维素酶 主要存在于微生物中。主要存在于微生物中。 3.1 降解纤维素的微生物 好氧细菌粘细菌、镰状纤维菌和纤维弧菌 厌氧细菌产纤维二糖芽孢梭菌、嗜热纤维 芽孢梭菌及无芽孢厌氧分解菌。 放 线 菌链霉菌属。 真菌青霉、曲霉、镰刀霉、木霉及毛霉。 需要时可以向有菌种库的研究机构购买或自行 筛选。 纤维素降解细菌 从生理学角度纤维素降解细菌主要分为以下几类: 可发酵的厌氧菌，主要代表属有芽孢梭菌属 (Clostridium )、高温厌氧杆菌属 ( Thermoanaerobacter)、热解纤维

24、素菌属 (Caldicellulosiruptor)等; 好氧革兰氏阳性细菌(Cellulomonas和 Thermobifida); (3)好氧滑动细菌(Cytophaga和sporocytophaga) 细菌纤维素酶多数分布在细胞膜上，因此细菌 一般粘在纤维素纤维上，从纤维的表而向内增 生，在接触点溶解纤维素。细菌产生的纤维素 酶的量比较少，多数不能分泌到细胞外，因此 工业上较少将细菌用于纤维素酶的生产。 酶活力较强的菌种有纤维杆菌属、生孢纤维粘 菌属和梭菌属。 纤维素降解放线菌 对降解纤维素的放线菌研究相对较少。 常见的可降解纤维素的放线菌有链霉菌属 (Streptomyces)、纤维放

25、线菌 (Acidothermus. Cellulolyticus ) 和诺卡氏 菌属(Ncardia ) 对纤维素降解能力最强的是放线菌中的小单孢菌。 近年来，从堆肥中分离出了多种高温单孢菌。 纤维素降解真菌 真菌是最为人们所熟知的纤维素降解微生物， 从低等厌氧真菌到高等担子菌。 真菌中一些最原始的种类，如厌氧的壶菌纲 (Chytridomycetes），能在反当动物的胃肠 道中降解纤维素。 在700多种的接合菌中，只有毛霉具有较强的 降解能力，主要针对的是可溶性的底物。 而子囊菌、担子菌、半知菌中包含大量纤维 素降解菌。其中Chaetomium，Coriolus， Phanerochaete

26、，Aspergillus, Penicillium和Trichoderma等由于产生纤 维素酶或者一具有降解木材的能力很强，已 经被深入研究。 最多的纤维素降解菌是霉菌，其中酶活力较强的菌种为木霉、曲霉、根霉和 青霉，特别是里氏木霉、绿色木霉、康氏木霉等较为典型，是目前公认的较 好的纤维素酶产生菌。 不可培养的纤维素分解 菌 随着新的宏基因组技术的出现，使得不依赖于 培养、直接从自然生境中寻找特定功能或者序 列的基因成为可能。 对于纤维素降解菌的纤维素酶研究，主要通过 构建土壤的宏基因组库，筛选编码纤维素酶基 因的重组子克隆表达。 对不可培养微生物的纤维素酶研究还刚刚开始。 纤维素酶基因的外源

27、表达技术并未成熟，因此克 隆表达的蛋白并不能反映其天然活力，在筛选高 活力纤维素酶的时候会遇到困难。 基因表达与否、表达量、以及翻译后修饰都会影 响最后的产物蛋白，因此对于基因的分析并不能 反映此生境中纤维素酶的存在状况，有可能会得 到误导性的结果。此外，真核基因的不连续性增 加了其被筛选的难度。 3.2 纤维素降解酶类 第一阶段。20世纪80年代以前，主要工作是利 用生物化学的方法对纤维素酶进行分离纯化。 但由于纤维素酶来源广泛，组分复杂，纯化甚 为困难，进展缓慢。 第二阶段。1980年至1988年，主要是利用基 因工程的方法对纤维素酶的基因进行克隆和一 级结构的测定。其中里氏木霉(Tric

28、hoderina reesei)的内切酶(EGI, EGIII)和外切酶(CBHI, CBH II) 、粪肥纤维单胞菌的内切酶(CenA, CenB, CenC、CenD)和外切酶(CbhA, CbhB, Cex) 、热纤梭菌的内切酶(CeIA, CeIB, CeIC、CeID)的基因己被克隆和测序， 并在大肠杆菌、酵母菌等载体中得到表达。 第三阶段。利用结构生物学及蛋白质工程的 方法对纤维素酶分子的结构和功能进行研究， 包括纤维素酶结构域的拆分、解析、功能性 氨基酸的确定、水解的双置换机制的确定、 分子折叠和催化机制关系的探讨。 按其催化功能分为三大类: 外切- - 1,4-葡聚糖酶(exo

29、-1,4-glucanases, EC3.2.1.9， Cellobiohydrolases) (来自真菌的简称CBH，来自细菌的简称 Cex）. 从还原性或非还原性末端水解纤维素链，生成产物主要是纤维二糖，简 称外切酶。 可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素。 内切-1,4-葡聚糖酶(endo-1,4- glucanases, EC3.2.1.4) (来自真菌简称EG， 来自细菌的简称Cen) 作用于纤维素分子内的无定形区，随机作用于纤 维素链，从链中间水解，简称为内切酶。 -葡萄糖苷酶(-1,4-glucanases, EC3.2.1.21)。 水解纤维二糖为葡萄糖单体，

30、解 除了纤维二糖对EG和CBH的抑制作用。 内切酶(EG)水解纤维素链内的糖苷键，特别是纤 维素的非结晶区，生成糖链新末端。 外切酶（CBH)作用于糖链的末端，从纤维素的非 结晶区到结晶区降解纤维素。 内切酶通常以其水解可溶性的纤维素类似物-羧甲 基纤维素的活力CMCase来表示。 用EG和CBH同时作用于结晶纤维素底物，能够检 测到二者的协同作用。 内切-1.4葡聚糖水解酶Cx 外切-1.4葡聚糖水解酶C1 -1.4葡萄糖苷酶Cb 按纤维素降解微生物和纤维素酶系间的关系： 复合体型和非复合体型 非复合(Non-complexed)纤维素酶系统： 典型的真菌或放线菌产生的纤维素酶系统， 一般由

31、菌丝分泌到细胞外发挥作用。 丝状真菌(或放线菌)能够通过菌丝的生长穿 透纤维底物，因此能够在纤维微粒的封闭腔 内释放纤维素酶系。 而厌氧细菌缺乏这种穿透纤维素的能力从而需要找另外的途径，参与到对底 物的竟争中来。因此形成了复合的纤维素酶系统(Cellulosomes，纤维小 体)，可以将纤维素降解细胞固定到水解位置。 细菌纤维素酶系纤维小体 (Cellulosome) 纤维小体最早由Bayer等1994提出。产生纤维小 体的微生物主要存在于厌氧环境中，某些厌氧的 纤维素分解细菌，如C.thermocellum与C. cellulolyticum等，具有复合(Complexed)纤 维素酶系统，

32、在其细胞壁上产生隆起的细胞结构。 纤维小体可以把各种纤维素酶组分都拉近到纤维 表面，并使各酶组分之间很好地协同，使水解产 物能够扩散的范围很小，从而使宿主细胞能够高 效地吸收降解产物。 C. thermocellum是典型的产生纤维小体微 生物，这些微生物的纤维小体由50多种蛋白组 成，总分子量在2-6MDa之间，在这类复合酶 体系中，都具有一个通用的骨架，每个酶分子 被锚定在骨架上，几种不同催化性质的酶组合 成一个复合物，共同作用。 酶基本不分泌到胞外，而是存在于细胞壁上， 通过脚手架蛋白把各种催化亚基组合成联合体， 以纤维小体的状态存在. 真菌纤维素酶系 真菌产生的纤维素酶多为胞外酶，酶系

33、较全、酶 活性较高，对纤维素酶的研究多以真菌为对象展 开。 典型的丝状真菌含有2个CBH组分、3个以上EG 组分以及1个-葡萄糖苷酶。 从己经研究的丝状真菌的纤维素酶来看，降解纤 维素的丝状真菌可能在生理生化和酶学性质方面 是极其相似的。 目前国内外研究较多的纤维素酶产生菌有木霉属 ( Trichoderma ) 、青霉属(Penicillium ) 、 根霉属(Rhizopus )、曲霉属(Aspergillus)及 漆斑酶属(Myrothecium)等，一些致病真菌如 茄病镰刀菌(Fusarium solani )也可产生纤维素 酶。 木霉属被公认为是产纤维素酶最高的菌种之一。 是当前生产

34、上应用较多的菌种，同时也是国内外 研究最广泛的纤维素酶产生菌。 其分泌的纤维素酶是胞外酶，分离纯化较容易， 且木霉的适应性很强、易培养，适于固体培养和 液态发酵，可以大规模应用于生产。 木霉属中的Trichoderma reesei因其纤维素酶 产量较高、稳定性好，易于培养和控制及代谢产 物安全无毒等优点已成为生产纤维素酶的典型菌 种。 曲霉属中以黑曲霉的研究最为深入，现已被许多 国家批准生产食品用纤维素酶。 纤维素的微生物破坏有2种可能的方式，一是外 部被破坏，然后向内发展；另一种是由内向外侵 蚀。 霉菌在降解纤维素时，菌丝横穿次生壁进入胞腔， 并不断生长，由内而外降解纤维素，使纤维逐步 被

35、破坏； 细菌则是黏附在纤维素纤维上，从纤维表面向内 生长，在接触点处纤维素被降解，使纤维表面呈 锯齿蚀痕。 纤维素酶的性质 分子量：45000-76000；最适pH：pH4-5；最适温度：40- 60 。 纤维素酶各组分大多为糖蛋白。 纤维素酶是诱导酶，诱导物为纤维二糖。 纤纤维维素素酶酶 纤纤维维二二糖糖酶酶 纤纤维维素素 纤纤维维二二糖糖 葡葡萄萄糖糖 糖糖酵酵解解 ATP 好好氧氧分分解解 H2O CO2 葡葡萄萄糖糖 丙丙酮酮丁丁醇醇发发酵酵 丙丙酮酮 + 丁丁醇醇 + CO2 + H2 厌厌氧氧发发酵酵 丁丁酸酸发发酵酵 丁丁酸酸 + 乙乙酸酸 + CO2 + H2 三三羧羧酸酸 循

36、循 环环 厌厌 氧氧 发发 酵酵 4.半纤维素的生物降解 分解纤维素的微生物大多数能分解半纤维素。 许多芽孢杆菌、假单胞菌、节细菌及放线菌 能分解半纤维素。 霉菌有根霉、曲霉、小克银汉霉、青霉及镰 刀霉。 半纤维素被微生物分解的速度比纤维素快。半半纤维素被微生物分解的速度比纤维素快。半 纤维素的分解过程大致如下：纤维素的分解过程大致如下： 厌氧分解厌氧分解 好氧分解好氧分解 聚糖酶聚糖酶 +H+H2 2O O 半纤维素半纤维素单糖单糖+ +糖醛酸糖醛酸 发酵的各种产物发酵的各种产物 COCO2 2+H+H2 2O O 按木聚糖酶的催化特性可将其分为内切木聚糖 酶，外切木聚糖酶，脱支链酶，木糖苷

37、酶等。 产生木聚糖酶的微生物分布非常广泛，已知有 几十个属，一百多个种，其中包括细菌、放线 菌和各类真菌(包括霉菌，酵母菌等)。 人们研究和应用得最多的是细菌、曲霉和木霉 所产的木聚糖酶。 5.5.木质素的生物降解木质素的生物降解 木质素是植物残体中最难分解的组分，一般先 由木质素降解菌把它降解成芳香族化合物、然 后再由多种微生物继续进行分解。 但木质素的分解速度极其缓慢，并有一部分组 分难以降解。 5.1木质素降解菌 自然界中只有少数微生物能够降解木质素。 木质素的完全降解是真菌、细菌和放线菌等 微生物群落共同作用的结果，其中起主要作 用的是真菌。 真菌通过菌丝作用进入到木质材料中，同时 能

38、够分泌特殊的胞外酶攻击植物细胞壁中的 木质纤维素，造成木质素与纤维素的解聚和 溶解。 真菌 根据真菌对木质纤维素中不同组分的腐朽类 型可分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌。 前两者都属于担子菌纲(Basidiomycetes）， 软腐菌属子囊菌纲(Ascomycetes）或半知 菌类(Fungi Impecfecti)。 白腐菌(white rot fungi)是一类能引起木质 白色腐烂的丝状真菌的集合，是目前己知的对 木质素降解能力最强的真菌，能在纯培养中将 木质素彻底降解为C02和H20。 20世纪80年代初，(Science）首次报道了黄 孢原毛平革菌P. chrysosporium的降解作用，

39、 自此引起了广泛关注。 白腐菌降解木质素有三个特点： 能彻底降解木质素生成C02，而细菌至多把20%的木质素降解成C02； 木质素降解主要是氧化反应，产物中不出现木质素单体； 木质素降解本身不提供微生物生长和维持所需的碳源和氮源，需要提供其 他的碳源和氮源供菌体生长并降解木质素。 分类学上，白腐菌绝大多数为担子菌纲，少数 为子囊菌纲，包括多孔菌、侧耳、栓菌等多个 种属200多个品系。 研究得较多的白腐菌有:黄孢原毛平革菌 (Phanerochete chrysosporium、彩绒革盖 菌(Coriolus Versicolor)、变色栓菌 (Thametes versicolor)、糙皮侧耳

40、 (Pleurotus ostreatus),烟管菌 (Bjerkandera adusta )等。 (Phanerochaete chrysosprium)是白腐真菌 的一种，隶属于担子菌纲、 同担子菌亚纲、非褶菌目、 丝核菌科。 白腐树皮上木质素被该 菌分解后漏出白色的纤维 素部分。 白腐菌的降解活动只发生在次级代谢阶段， 与降解过程有关的关键酶只有当一些主要营 养物，如氨、碳、硫限制时才形成，产生酶 的这种营养限制称为木质素降解条件 （Ligniolytic condition) 。 褐腐菌 (Brown rot fungi)除了能氧化木质 素苯环上的甲基为二氧化碳外，褐腐菌不能 有效地

41、降解苯环和其支链。使木质材料中的 纤维素受到侵蚀而对木质素的影响却极小， 致使最终的降解产物含有褐色的木质素成分。 软腐菌(Soft rot fungi)降解多聚糖的作用 优于降解木质素的作用，它一般只能分解纤 维素，木质素则被完整地保留卜来。 后两者分解木质素的能力不强或没有，因此， 对其研究报道也较少。 白腐菌降解木质素的能力优于其降解纤维素 的能力，而后两者降解木质素的能力弱于其 降解纤维素的能力，它们首先开始纤维素的 降解并分泌黄褐色的色素使木材变黄褐色， 而后才部分缓慢地降解木质素。 降解木质素的细菌和放线 菌 放线菌类是公认降解能力较强的菌，包括链霉菌 (Streptomyces

42、)、节杆菌(Arthrobacter)、 小单孢菌(Micromonospora )和诺卡氏菌 (Nocardia )等。 放线菌对木质素主要作用是在降解过程中可以增 加它的水溶性。放线菌能穿透木质纤维素等不溶 基质。在中性、微碱性上壤或堆肥中，放线菌参 与有机质的初始降解和腐殖化。 其中链霉属的丝状细菌降解木质素最高可达20%，非丝状细菌木质素降解 率小于10%，只能降解木质素低分子量部分和木质素的降解产物。但其在 降解过程中能够增加木质素的水溶性，有研究表明在堆肥后期，放线菌对木 质素降解起着主要作用。 某些细菌也具有降解木质素的能力。这类型的细菌包：Bacilus, Pseudomona

43、s 、 Aeromona和 Acinetobacter等。 真菌降解木质素一般是在 存在条件下 ， 葡萄糖氧化酶可氧化相应底物产生。 而在存在情况下 ， 锰过氧化酶、 木 质素过氧化酶和漆酶这三种酶协同作用 于连 结木质素结构单元之间的醚键和酯键 ， 首先 使木质素分解成为单个的结构单 元 ， 进一步催化苯丙烯醇之间的 -键 断成两分子苯丙烯醇 ， 最后苯丙烯醇断链降 解为小分子化合物 ， 完成木质素的降解。 5.2木质素降解酶 白腐菌的木质素降解酶系是目前木质素生物降解研究的重点。木质素的降解酶 系较为复杂，主要包括四类: （1) H2O2产生酶系：包括细胞内葡萄糖氧化酶、细胞外乙二醛氧化酶

44、，它们 在分子氧参与下氧化相应底物而形成H202，激活过氧化物酶，启动酶的催化 循环。 (2)氧化木素酶系：根据木素降解的氧化过程中 电子受体的不同，分为利用02的多酚氧化酶系和 利用H2O2的过氧化物酶系。 前者为漆酶(Laccase，Lac)，为一种含铜多酚 氧化酶，主要催化酚式羟基基团获得单电子； 后者为木质素过氧化物酶(Ligninperoxidase， LiP)、锰过氧化物酶(Manganese peroxidase，MnP)。 木质素过氧化物酶(Lip)是一种来源于真菌的 过氧化物酶，是降解木质素的过氧化物酶系的 主要成分。 Lip是一系列含有血红素辅基的同功酶，分子 量在38-4

45、3kDa，是一种糖蛋白。 一个血红素基构成了它的活性中心，可连接至 少一个黎芦醇（VA)，木质素大分子不能接近 该活性中心，但在接近活性中心通道表面裂缝 中，有一段有序的残糖基，可能是木质素结合 点。 Lip在以H202为辅助底物时，可氧化酚型木 质素模型物为苯氧自由基，氧化非酚型木质素 模型物为芳香正离子自由基，在经过一系列非 酶催化的自由基反应后使木质素侧链上的Ca- C键断裂。 低pH值，一般为pH4.5是木质素过氧化物酶 引起木质素模型物单电子氧化关键的条件。如 何维持低pH值，则主要靠木质素降解之前纤 维素降解形成的单糖酸。 黎芦醇和过氧化氢对Lip降解木质素的反应起重 要作用。Li

46、p使黎芦醇氧化为正离子，而这正电 离子则把氧化反应扩散开来，黎芦醇充当了单 电子氧化的中间媒介物。 过氧化氢是伴随着木质素酶系的产生而由白腐 菌受激发产生的，即碳、氮源的短缺激发葡萄 糖氧化酶形成的，继而产生过氧化氢。过氧化 氢的形成，Lip降解木质素的反应才能进行。 自然状态下的LiP含有自旋Fe3+，被H202氧化 失去两个电子后形成LipI (O=Fe4+-A+.)，Lip I含有一个O=Fe4+中心和一个有机阳离子自由 基(A+.)，该自由基依酶的种类和来源不同或定 位于血红素或定位于蛋白质多肽链中； 随后，Lip I氧化一分子外源底物(RH)，得到 一个氢原子和一个电子，产生底物自由

47、基(R.) 和Lip II，而有机阳离子自由基(A+.)则被还原 为初始态； 接着Lip II被另一分子外源底物还原为初始态形式Fe3+，但又形成一个R.；最 后，两个R.或结合成R2或歧化为R2H4。 上述过程中如果Lip II与过量的H202反应则生成低活性形式Lip IIIFe3+-OP 或Fe2+-O2P，使反应速率降低直至失活。 它降解木质素的特点是能氧化富含电子的酚 型或非酚型芳香化合物，在通过电子传递体 攻击木质素时，它能从苯酚或非酚类的苯环 上夺取一个电子，将其氧化成自由基，继而 以链式反应产生许多不同的自由基，导致木 质素分子中主要键断裂，然后发生一系列的 裂解反应。其中Li

48、P能催化丙基侧链的C- C链的断裂，这一裂解反应被认为是在白腐 菌降解木质素中最重要的一环。 MnP存在于大多数白腐菌中，分子结构与LiP 相似，也是一种糖蛋白，分子量为45-47kDa， 其活性中心由一个血红素基和一个Mn2+构成， 另外还有两个起稳定结构作用的Ca2+。 Mn2+在催化氧化中作为必需的电子供给者， 使缺一个电子的酶中间体恢复到原来状态，产 生Mn3+。 Mnp在H2O2存在时失去一个电子形成Mnp+，Mnp+将Mn2+氧化为 Mn3+，自身被还原为自然状态Mnp，Mn3+与某些有机酸结合形成稳定的 鳌合物，再进一步氧化其他的底物分子，Mn3+还原为Mn2+，如此完成氧 化还

49、原催化周期。 Mn2+是MnP氧化效率最高的底物。 在这个反应中需要有机酸鳌合剂如草酸盐和乙 醇酸盐的存在，这些鳌合剂固定产生的Mn3+。 鳌合的Mn3+是可传播的氧化剂，可在离MnP 活性位点一段距离的地方起作用，但是氧化性 不强，不能氧化在木质素中占优势的非苯酚结 构，只能通过C-芳基开裂和其他降解反应氧化 木质素中约占10%的抗性更强的酚结构。但是 由于鳌合的Mn3+分子小，能够穿透木材启动降 解以促进后续的氧化性更强的LiP的攻击。 LiP催化单电子氧化，将一系列木质素相关的 芳香族化合物氧化成芳香基阳离子自由基， 后者再经历一系列反应产生各种终产物。 MnP将Mn(II)氧化成Mn(

50、III)、 Mn(III)进 而氧化一系列酚类物质。一些研究结果认为 Mnp的作用主要是脱除木素甲氧基，形成易 于进一步被氧化的式结构导致芳香环断裂。 LiP和MnP均为含亚铁血红素的糖蛋白，催化 过程中依赖H202。这一类过氧化物酶系含血红 素辅基 ，可经单电子传递体攻击木质素生成木 质素自由基。 其中SH2为对酶系专一的递电子体。对于 LiP，黎芦醇（）是其自 然底物 ， 而MnP 中，Mn2+是活性电子传递体。通常VA和酶 两者合成是相伴的，这可保证基质中Mn 缺乏时，菌仍然有降解木素的活性。 在MnP的血红素中仅有一个Mn2+接合点。 MnP消耗一份H2O2，产生两份Mn3+，从 Mn

51、P脱离后，需要鳌合剂以保证扩散中稳定 性。 一般地 ， Lac 能氧化底物是多酚芳环及低电离能的非酚芳环。 过氧化物 酶既能作用酚环，也能攻击那些较高电离能的非酚环。 木质素降解是以自由基为基础的链式反应，过 氧化物酶是反应启动者，先形成高度活性的自 由基中间体，继而以链反应方式产生许多不同 自由基，促使底物氧化。 这种自由基反应是高度非特异性和无立体选择 性的，通过腐蚀细胞壁提高白腐菌胞外降解酶 系对细胞壁成分的可及性，对木质纤维素具有 高度破坏性。 漆酶（ Laccase, Lac ) 是以O2作电子受体催 化多酚化合物经四次单电子传递形成醌及自由基的含铜蛋白酶。 漆酶一般含有四个铜离子，

52、这4个铜离子处在漆酶的活性部位，在氧化反应 中起决定作用。 漆酶中的铜离子在催化氧化反应中起决定作用。 根据磁学和光谱学性质可将4个铜原子分为三类： I型Cu2+(T1Cu)和II型Cu2+ (T2Cu)各一个，是 单电子受体；III型Cu24+(T3Cu)两个，是双电子 受体。 I型Cu2+又称蓝色Cu2+，与Cys的S配位结合形 成的共价键Cu-SCys在600nm处有强的吸收值， 使酶分子呈蓝色；II型Cu2+非蓝色，没有特征吸 收峰；型Cu2+-Cu2+共价体，在330nm处有 宽的吸收峰。 漆酶催化氧化反应分为底物自由基中间体的 产生和氧气还原成水两个方面。 首先，漆酶分子的I型铜离

53、子从还原态底物中 吸收单个电子，底物被氧化成自由基，自由 基引发各种各样的非酶促次级反应，如羟化、 歧化和聚合等；其次，I型铜离子将单个电子 通过Cys-His途径传递给三核铜簇中心，从 而氧被还原成水。 只可催化木质素相关酚类的电子氧化，尤其 是丁香型木质素，形成酚氧基；在菌体外， 木质素单体在02存在的条件下，漆酶发生聚 合反应，还原态漆酶被氧化，02被还原成水， 此过程是通过四个铜离子协同传递电子和价 态变化来实现的。在反应中，漆酶从氧化底 物分子中获取了一个电子形成一个自由基， 该自由基不稳定可进一步发生聚合和解聚反 应。漆酶的氧化底物极为广泛，包括酚类及 其衍生物、芳胺及其衍生物、芳

54、香羧酸及其 衍生物等。 木质素生物降解是非专一性的氧化反应，其分子之 大决定了降解是一个胞外过程。 白腐菌分泌相关酶系攻击木质素的外部暴露面，导 致部分区域发生降解; 在木质素结构遭受破坏的前 期，降解反应主要以愈创木基和丁香基亚单位上甲 氧基的脱甲基化为主。 随着培养时间的延长，木质素中的甲氧基含量显著 减少，形成邻苯二酚，这些物质再被酶作用，芳环 被裂解，产生脂族羧酸，进一步被水解。 在白腐菌分泌酶系的作用下，木质素发生脱甲 基化、羟基化和芳环开裂，同时伴随低分子量 木质素片段的释放，再彻底降解为C02，从而实 现对不同组成形式的木质素底物非特异性和无 立体选择性的氧化。 木质素自然降解也

55、依赖酶与酶、小分子物质及酶 与介体的相互作用。即降解木质素的过程中，需 要酶系之间的相互作用。 此外，羟基自由基、铁离子、锰离子、黎芦醇等 小分子介体在木质素降解过程中也起到重要作用。 主要通过影响酶的性质进而影响到木质素的降解。 不同酶的介体不同，这些物质的存在有利于增强 酶的作用。 (3)纤维二糖/醌还原酶系：能将木素在氧化酶作用 下转变的芳环自由基和醌类还原成氢醌，从而防止 这类活性中间体的再聚合; (4)芳香环开裂酶系：主要用于环裂解前准备反应 及环裂解反应，包括单加氧酶、双加氧酶和胺氧化 酶等，这些酶在白腐菌中的分布及特性尚未明了。 6.微生物对几丁质的降解转 化 几丁质的结构、分布

56、和性质 几丁质降解微生物和几丁质酶 几丁质及其衍生物的应用 6.1 几丁质的结构、分布和性质 几丁质是真菌、甲壳类动物、昆虫、藻类等的 重要结构物质。 在自然界中分布广泛，储量丰富，自然界每年 合成的几丁质约有100亿吨，数量仅次于纤维素。 也是地球上除蛋白质之外数量最大的含氮天然 有机化合物。 几丁质（chitin）是由N-乙酰-D-氨基葡萄 糖以-1,4糖苷键连接而成的生物多聚体， 也称为甲壳素、甲壳质。 基本单位是乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc ，N- 乙酰葡萄糖胺）。 为一种直链状聚合物，分子量可达100万以 上，大约由3002500个单体聚合而成。 几丁质的化学结构式 几丁质按晶体结构

57、分为型、型和型三种。 -几丁质，由两条同向平行链组成； -几丁质，由两条反向平行链组成； -几丁质，由三条链组成，两条同向，一条反 向。 型最为稳定， 是最常见的一种形式。 在生物体中几丁质常与其它结构物质交联， 真菌细胞壁中的几丁质与-葡萄糖共价结合。 昆虫和其它无脊椎动物的几丁质通过共价与 非共价的形式与特定的蛋白质交联。几丁质 也常常与酚类和酯类分子相互作用，并发生 不同程度的矿化作用，尤其是钙化作用。 壳聚糖（chitosan），几丁质脱乙酰基后生 成的产物，又称脱乙酰甲壳质、可溶性甲壳 素、聚氨基葡萄糖。 一般将N-乙酰葡萄糖胺含量大于55%的称为 几丁质，反之称为壳聚糖。 几丁质、

58、壳聚糖的分子结构 几丁质、壳聚糖的化学结构与纤维素极其相似。 纤维素是葡萄糖以-1，4糖苷结合形成的多糖。当纤维素葡萄 糖环C2位置的羟基被乙酰胺基取代是几丁质，被氨基取代是壳 聚糖。 几丁质的理化性质 几丁质是白色或灰白色、半透明、片状固体。 聚糖大分子间有较强的氢键作用，理化性质非常 稳定，不易分解，不易熔化，不溶于水、稀酸、 稀碱和一般的有机溶剂，所以纯的几丁质又叫做 不溶性几丁质。但可溶于浓HCl、H2SO4 、冰乙 酸、7897%的磷酸及无水甲酸，也可以溶于某 些配合物溶剂中，如LiCl/DMAC（二甲基乙酸 胺-氯化锂）。 由于存在乙酰氨基和羟基，分子间的氢键作 用比纤维素更强。因

59、此，几丁质进行化学反 应比纤维素更难。 大多加工成壳聚糖使用。 壳聚糖是白色或灰白色、略有珍珠光泽、半 透明片状固体，不溶于水和碱溶液，可溶于 稀有机酸及部分无机酸，如盐酸等。溶于1% 乙酸溶液后形成透明粘稠的壳聚糖胶体溶液， 是最重要的性质之一。 6.2几丁质降解微生物和几丁质 酶 能产生几丁质酶的生物很多，包括植物、动物 和微生物。1905年，Benecke首次分离到能够 以几丁质为营养物质的微生物；1921年 Folpmers发现了分解几丁质的细菌和放线菌； 随后的研究发现，高等植物中也普遍存在着几 丁质酶系，并且与植物防卫反应的诱导有关； 1961年，Euniauxc首次报道了动物几丁

60、质酶 的研究成果；最近发现一些病毒如Chlorella virus 也能产生几丁质酶。 产生几丁质酶的微生物 己发现的产几丁质酶的微生物约有46个属近70种。 (1)细菌：粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) ，肠杆菌(Enterobacter)，假单 胞菌(Pseudomonas )，环状芽孢杆菌，巨大芽 孢杆菌，气单孢菌(Aeromonas) ，孤菌 (Vibrio），节杆菌(arthrobacter )，纤维单饱 菌 cellulomonas )，及一些未定种的梭菌 (Clostridium.) 。 (2)放线菌：皱褶链霉菌(Streptomyces plicatus)