《罗非鱼链球菌病检测技术规程》编制说明

1、海南省地方标准罗非鱼链球菌病检测技术规程编制说明一、任务来源罗非鱼链球菌病检测技术规程的制定任务是根据海南省质量技术监督局“琼质技监标【2013】71号”文件精神内容，由海南省水产研究所负责罗非鱼链球菌病检测技术规程的编制工作。二、标准制定背景与意义罗非鱼是联合国粮农组织向全世界推广养殖的优良品种，海南省罗非鱼产业经多年的发展现已形成了集遗传育种、种苗生产、成鱼养殖、饲料、加工、运销和配套服务为一体的完整的产业链。 2011年止全省共有罗非鱼种苗场60多家，其中规模较大的14家，年产鱼苗108亿尾；获得haccp认证的罗非鱼加工厂34家，欧盟注册的有22家，年加工能力80多万吨；养殖面积约3万

2、公顷，年实际产量约31万吨，出口量10.3万吨，位居全国第一，罗非鱼养殖已成为我省出口创汇和渔民增收的重要途径。我省罗非鱼养殖模式以池塘养殖为主，但随着罗非鱼养殖业的快速发展，养殖环境不断恶化，罗非鱼主产区等地不断爆发链球菌疾病，死亡率最高到达40%，罗非鱼链球菌病已成为我省罗非鱼养殖的重大危害之一。为准确检测罗非鱼链球菌病，规范罗非鱼链球菌病检测技术，科学的引导对罗非鱼链球菌病的防治，杜绝盲目用药，促进我省罗非鱼产业的健康持续发展，制定罗非鱼链球菌病检测技术规程具有极其重要的意义。海南省水产研究所科研人员多年来对罗非鱼链球菌病防治做过较多研究，本标准编制组的成员是上述研究工作的主要技术力量，

3、积累了较完整的技术资料，为罗非鱼链球菌病检测技术规程的制定奠定了相当的研究工作基础。三、制订本标准的过程准备阶段：标准制定小组在接到制标任务后，由项目负责人牵头开展对相关文献资料的查阅、实验耗材和试剂的准备；并及时与参与单位进行交流，为项目的顺利完成做好充分的准备工作；分工情况：本制标任务由海南省水产研究所负责，中国水产科学研究院珠江水产研究所协助完成。具体分工为海南省水产研究所负责标准方法的建立，包括临床诊断、实验室诊断，初步建立完整的罗非鱼链球菌病检测技术规程；中国水产科学研究院珠江水产研究所对所建立的诊断方法进行完善，并从实际应用方面进行了验证。标准草案编写情况：本标准草案经过准备、设计

4、、建立、优化和验证等几个阶段，结果证实标准中所制定的方法，内容完整，可操作性和实用性强，能够满足罗非鱼链球菌病检测需求，而后根据gb/t 1.1-2009标准化工作导则 第一部份：标准的结构和编写和海南地方标准编写的相关规定进行了标准草案的编写工作，完全按照规范术语编写，达到使用者简单易懂、方法结果能够溯源的目的。四、主要起草人及其承担的任务： 王德强 标准编制组主持人。负责项目组织实施，制定方案，执笔“罗非鱼链球菌病检测技术规程”，撰写编制说明。 可小丽 标准编制组成员 参与“罗非鱼链球菌病检测技术规程”工作。 刘志刚 标准编制组成员 参与“罗非鱼链球菌病检测技术规程”工作。 佟延南 标准编

5、制组成员 参与“罗非鱼链球菌病检测技术规程”工作。李芳远 标准编制组成员 参与“罗非鱼链球菌病检测技术规程”工作。卢迈新 标准编制组成员 参与“罗非鱼链球菌病检测技术规程”工作。高凤英 标准编制组成员 参与“罗非鱼链球菌病检测技术规程”工作。朱华平 标准编制组成员 参与“罗非鱼链球菌病检测技术规程”工作。五、标准制定的原则和依据制定原则：1、本标准的编写规则遵循gb/t1.1-2000标准化工作导则 第一部分：标准的结构和编号规则及gb/t1.2-2002标准化工作导则 第二部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法。2、标准必须实用，其所函盖的内容应适合我省的实际情况，编写内容上简明、准确、通

6、俗、易懂，真正能指导生产。3、本标准在总结链球菌病检测技术的基础上，多次组织有关病害专家进行研讨，进行综合分析确定了本标准的技术数据。制定依据：本标准严格按照gb/t 1.12009标准化工作导则的技术要求进行编制起草。六、本标准主要内容说明1、罗非鱼链球菌病（1）病原体无乳链球菌（streptococcus agalactiae）、海豚链球菌（streptococcus iniae）。（2）流行情况在我国南方罗非鱼养殖区，一年四季均有流行，尤其是510月高温期，水温30以上时为爆发高峰期，对各种规格罗非鱼均可造成危害。2、设备、药品选择参照gb/t 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色

7、法、培养基和试剂和sc/t 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术选择设备和药品。3、采集样品依据中华人民共和国农业部发布的水生动物检疫实验技术规范，对患病的罗非鱼进行样品采集。4、临床诊断对样品的活动情况、体表、及其内脏进行观察、检测。病鱼一般活动缓慢，反应迟钝，食欲减退，独游，严重时，常以螺旋状游于水面。体表发黑，角膜发白浑浊、眼球肿大突出，虹膜充血，严重的可见眼球脱落；下颌、鳃盖边缘、鳍条基部不同程度的充血、出血，伴有肛门红肿、外突的现象。解剖内脏，肝脏充血、肿大，颜色不均，呈花肝状，质地脆弱；脑部组织软化；胆囊充盈、充满蓝黑色的胆汁；部分患病鱼体表现为腹水，肠道有轻度

8、的充血和炎症，肠腔内有少量黄色的粘液。5、实验室诊断（1）、病原菌分离、培养采集病鱼的眼、鳃丝、肝脏、脾脏、肾脏、血液和脑组织等器官的组织液接种于血琼脂平板，在28 恒温培养箱中倒置培养24 h48 h。最后，挑去单菌落，接种于一新的血琼脂平板上，在28 条件下倒置培养24 h。 （2）、生理生化检验 按照常规方法对分离的细菌进行运动性试验、生长试验、溶血试验和马尿酸钠水解试验。依照gb/t 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂的要求接触酶试验、淀粉水解试验、吲哚试验、v-p试验和糖类分解试验（3）、聚合酶链式反应（pcr）监测参照广东与海南养殖罗非鱼无乳链球菌的分离鉴定

9、与特性分析(1)（2010年，卢迈新等）和双重pcr快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌（2010，黎炯等）等研究报告及实践经验，对分离的样品进行pcr检测。4、细菌致病性实验 首先，若培养基培养的菌落类型清楚，选择其优势菌落进行培养；若不清楚，应选择不同类型分别培养。然后选择与被检样品同龄、同规格，同时血清为阴性的健康罗非鱼采用肌肉（或腹腔）注射（或涂抹、浸泡）方式对鱼体进行人工感染，并观察实验鱼24 h168 h的反应。最后若出现于自然链球菌病发病症状相同的菌落，为致病菌落。5、 综合判定依据的建立通过运用本标准所建立的针对罗非鱼海豚链球菌和无乳链球菌的细菌分离鉴定方法，从临床症状、病原分离培养

10、、菌体染色、生化实验到分子生物学鉴定方法，可以实现对临床罗非鱼样品相对系统和完整的病原分析和鉴定过程。根据海豚链球菌和无乳链球菌的病原特性，在标准中，还给出了罗非鱼海豚链球菌病和无乳链球菌病的综合判断依据。七、与现行法律、法规、强制性标准的关系本标准的编制依据与现行的法律、法规和强制性标准的规定相一致。八、标准作为强制性标准或推荐性标准的建议本标准的制定旨在规范我省罗非鱼链球菌病检测技术，提高罗非鱼链球菌病检测速度和准确度。标准在实施过程中根据海南省级相关法规与强制性标准的继续完善，相关指标、内容可根据国内外鱼类细菌性疾病检测技术研究的进展适时予以重新界定。九、贯彻标准的要求和措施建议本标准发

11、布后，应广泛组织宣传和贯彻，建议在有关水产刊物上发布，同时在我省罗非鱼养殖行业中执行本标准，尤其进行罗非鱼病害检测的有关单位和个人，在病害检测过程中，必须严格按本标准的规范进行。参考文献谭晶晶,陈昌福,高宇等.奥尼罗非鱼无乳链球菌的鉴定、致病性及药物敏感性研究j.华中农业大学学报.2010,29(6)745-751张俊,周素明,李安兴.广东省养殖罗非鱼、海鲈、尖吻鲈海豚链球菌感染调查j.中国水产科学.2012,19(1)卢迈新,黎炯，叶星等.广东与海南养殖罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析(1)j.微生物学报.2010,37(5)邓显文,谢芝勋,谢志勤等.广西罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定j.

12、广西农业科学.2010,41(5)黎炯,叶星,卢迈新等.双重pcr快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌j.湖南农业大学学报（自然科学版）.2010,36(4)周素明,李安兴,马跃等.养殖鱼类链球菌病病原的分离鉴定及其16srdna分析j.中山大学学报（自然科学版）.2007,46(2)罗璋,许杰,韩进刚等.银鼓鱼病原菌（海豚链球菌）的分离与鉴定j.华中农业大学学报.2012,31(1)mian gf, godoy dt, leal ca. aspects of the natural history and virulence of s. agalactiae infection in nile t

13、ilapiaj. vet microbiol, 2009, 136(1-2):180183.messick jb, berent lm, cooper sk, etc. development and evaluation of a pcr-based assay for detection of haemobartonella felis in cats and differentiation of h. felis from related bacteria by restriction fragment length polymorphism analysisj. j clinical

14、microbiology, 1998, 36(2): 462466.stackbrandt e, goodfellow m. nucleic acid techniques in bacterial systematicsm.new york: a willey-interscience publication, 1991: 115175.holt jg, krieg nr, neath ph, etc. bergeys manual of determinative bacteriology(nith edition.)m. baltimore: willian and wilkins, 1994: 151.woese cr, for ge, zablen l, etc. conservation of primary structure in 16s ribosomal rnaj. nature, 1975, 254: 8386.hassan aa,yild