细菌分离与鉴定方

1、细菌分离与鉴定方 细菌分离与鉴定方法细菌分离与鉴定方法 嗜水气单胞菌分离鉴定嗜水气单胞菌分离鉴定 分离方法分离方法 细菌的生长状况观察细菌的生长状况观察 氧化酶试验氧化酶试验 AHM鉴别培养鉴别培养 吲哚试验吲哚试验 革兰氏染色法革兰氏染色法 糖发酵试验糖发酵试验 脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验）脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验） 细菌分离与鉴定方 分离方法分离方法 用途用途: 在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、在检查含两种或两种以上的待检材料（如肝、脾、肾、 心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行心、肌肉等）中的某种细菌时，须先将待检材料进行 分离培养。常用的分离培养方法

2、是琼脂平皿分区划线分离培养。常用的分离培养方法是琼脂平皿分区划线 法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来，法，是借划线将混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来， 使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形使个别的细菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形 成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。成单个菌落，以达到分离获得纯种细菌的目的。 细菌分离与鉴定方 分离方法分离方法 具体操作方法如下：具体操作方法如下： 点燃酒精灯，右手执笔式握持接种环（见图点燃酒精灯，右手执笔式握持接种环（见图1），在酒精灯火焰上烧灼接种环，），在酒精灯火焰上烧灼接种环， 待冷，取待测菌液一环。待冷，取待测菌液一环

3、。 左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬 起一些，进行接种（见图起一些，进行接种（见图2）。或者，将平皿的盖留在实验台上，尽量直立平）。或者，将平皿的盖留在实验台上，尽量直立平 皿靠近酒精灯火焰，右手持接种环在琼脂表面的一端（即皿靠近酒精灯火焰，右手持接种环在琼脂表面的一端（即1区，约占整个平皿区，约占整个平皿 的的1/61/5）涂布，划线时，接种环与琼脂表面呈）涂布，划线时，接种环与琼脂表面呈 3040的角度轻轻接的角度轻轻接 触，利用腕力动作，切忌划破琼脂表面。烧灼接种环，待冷后，将接种环通触，

4、利用腕力动作，切忌划破琼脂表面。烧灼接种环，待冷后，将接种环通 过过1区划线数次，在区划线数次，在2区作连续划线，各线条间隔要小，但不能重叠。划满平区作连续划线，各线条间隔要小，但不能重叠。划满平 皿的皿的1/51/4区域，划完区域，划完2区不需烧灼接种环，继续通过区不需烧灼接种环，继续通过2区数次，在区数次，在3区作连区作连 续划线，如此反复至划完整个平皿（如图续划线，如此反复至划完整个平皿（如图3）。）。 细菌分离与鉴定方 图1 接种环的握持方法 图2 平皿的握持方法 1区 4区3区 2区 图3 划线分离的方法 左：分区 右：培养后的结果 细菌分离与鉴定方 分离方法分离方法 接种完毕，盖好

5、平皿盖，在平皿底玻璃上用记号接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号 笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将 平皿的底朝上，放置在平皿的底朝上，放置在37孵箱内孵育孵箱内孵育24h。 取出后观察琼脂表面的菌落分布情况（见图取出后观察琼脂表面的菌落分布情况（见图3），）， 注意观察最后注意观察最后12区内是否分离出单个菌落，并区内是否分离出单个菌落，并 观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、透明度、观察记录菌落特征（如菌落大小、形状、透明度、 色素等情况）。色素等情况）。 细菌分离与鉴定方 烂鳃病病原菌平板划线分离：烂鳃病病原菌平板划线分离： 取病鱼

6、鳃丝一小块，置于滴有无菌水的载玻片 的边缘，10分钟，用接种环蘸水，在胰胨琼脂培养 基上划线。 肠炎病病原菌划线分离：肠炎病病原菌划线分离： 用70%酒精棉球擦拭鱼体，无菌条件下，取病 鱼的肝或脾或肾或心于普通营养琼脂基划线分离。 赤皮病病原菌划线分离赤皮病病原菌划线分离： 用刀片刮除病灶腐烂部分后用接种环挂取病料， 在普通营养琼脂培养基上平板划线。28培养24h。 细菌分离与鉴定方 细菌的生长状况观察细菌的生长状况观察 原理原理 细菌于适宜条件下在不同的培养基上生长，其生长状细菌于适宜条件下在不同的培养基上生长，其生长状 态不同。不同细菌在同一种培养基中生长，生长特点也态不同。不同细菌在同一

7、种培养基中生长，生长特点也 不相同。这些区别称之为培养特征，是鉴别细菌和细菌不相同。这些区别称之为培养特征，是鉴别细菌和细菌 分类的依据之一。分类的依据之一。 把细菌接种在固体培养基上，在适宜的条件下经过一把细菌接种在固体培养基上，在适宜的条件下经过一 定时间的培养，在培养基表面（或内部）形成肉眼可见定时间的培养，在培养基表面（或内部）形成肉眼可见 的有一个细菌大量繁殖后而成的集团，称之为菌落。不的有一个细菌大量繁殖后而成的集团，称之为菌落。不 同细菌的菌落大小、光浊度、色泽均有其特征。同细菌的菌落大小、光浊度、色泽均有其特征。 细菌分离与鉴定方 普通琼脂平板 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.

8、0g 氯化氯化钠（NaCL） 5.0g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.0g 琼脂 15.0g 蒸馏水 1000mL 混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，112kPa高压灭菌15min， 冷却至45倾注灭菌平板。直径90cm平皿每皿倾入1520ml培 养基，培养基过少，划线分离时细菌的营养较少，菌落生长过小， 菌落形态不易观察，培养基也易于干燥，不易在数天内对菌落形 态进行观察。 细菌分离与鉴定方 含糖培养基灭菌条件115，1015分钟 一般培养基灭菌条件121，1520分钟 细菌分离与鉴定方 细菌的生长状况观察细菌的生长状况观察 在无菌平皿中，倒入溶化后在无菌平皿中，倒入溶化后50普通营养琼

9、脂培养基，每普通营养琼脂培养基，每 皿约皿约 20毫升，水平静置待凝固。用接种环挑去待分离菌毫升，水平静置待凝固。用接种环挑去待分离菌 株分区划线，株分区划线，28培养培养24h。 菌落形态观察：菌落形态观察： 大小：以毫米计。大小：以毫米计。 形状：圆形、不规则形、放射状等。形状：圆形、不规则形、放射状等。 表面：光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。表面：光滑、粗糙、圆环状、乳突状等。 边缘：整齐、波形、锯齿状等。边缘：整齐、波形、锯齿状等。 色素：有颜色，颜色，是否可溶等。色素：有颜色，颜色，是否可溶等。 透明度：透明、半透明、不透明。透明度：透明、半透明、不透明。 嗜水气单胞菌菌落为光滑、微凸

10、、圆整、无色或淡黄嗜水气单胞菌菌落为光滑、微凸、圆整、无色或淡黄 色，有特殊芳香气味。色，有特殊芳香气味。 细菌分离与鉴定方 氧化酶试验氧化酶试验 原理原理 氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统 的终末呼吸酶，系由细胞色素的终末呼吸酶，系由细胞色素a和和a3所组成，一般仅存于需所组成，一般仅存于需 氧菌和兼性厌氧菌中，它使细菌能利用氧作为氢的最终受体，氧菌和兼性厌氧菌中，它使细菌能利用氧作为氢的最终受体， 使分子氧还原为过氧化氢，过氧化氢的积累会有毒性，固本使分子氧还原为过氧化氢，过氧化氢的积累会有毒性，固本 试验的阳性菌，不仅需氧而且能

11、产生过氧化氢酶。氧化酶并试验的阳性菌，不仅需氧而且能产生过氧化氢酶。氧化酶并 不是直接与试剂起反应，而是先使细胞色素不是直接与试剂起反应，而是先使细胞色素c氧化，然后此氧化，然后此 氧化型细胞色素氧化型细胞色素c再使对苯二胺氧化，产生颜色反应，因而再使对苯二胺氧化，产生颜色反应，因而 本试验实际也是测定细胞色素本试验实际也是测定细胞色素c是否存在。是否存在。 细菌分离与鉴定方 氧化酶试验氧化酶试验 试剂试剂 1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液或盐酸二甲基对苯二胺水溶液或1%二盐酸四甲基对苯二胺水溶二盐酸四甲基对苯二胺水溶 液。液。 方法方法 在干净的培养皿中放一张滤纸，滴上二甲基对本二胺的在干净的培

12、养皿中放一张滤纸，滴上二甲基对本二胺的1%水溶水溶 液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用白金丝接种环（不可用镍液，仅使滤纸湿润即可，不可过湿。用白金丝接种环（不可用镍 铬丝）取铬丝）取1824小时的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上，在小时的菌苔，涂抹在湿润的滤纸上，在10s内涂内涂 抹菌苔现红色者这为阳性，抹菌苔现红色者这为阳性，(四甲基对本二胺呈蓝色四甲基对本二胺呈蓝色)，1060s 现红色者为延迟反应，现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。以上现红色者不计，按阴性处理。 嗜水气单胞菌为阳性。嗜水气单胞菌为阳性。 细菌分离与鉴定方 氧化酶试验氧化酶试验 注意事项注意事项 二甲基对本二

13、胺溶液易于氧化，一般于冰箱中储存两周。二甲基对本二胺溶液易于氧化，一般于冰箱中储存两周。 如溶液颜色转红褐色，则不宜使用。如溶液颜色转红褐色，则不宜使用。 铁、镍等金属可催化二甲基对苯二胺呈红色，故不宜用以铁、镍等金属可催化二甲基对苯二胺呈红色，故不宜用以 上材料取菌苔。如无白金丝，可用玻棒或灭菌牙签取菌苔上材料取菌苔。如无白金丝，可用玻棒或灭菌牙签取菌苔 涂抹。涂抹。 在滤纸上滴加试液已刚刚湿润为宜。如滤纸过湿，妨碍空在滤纸上滴加试液已刚刚湿润为宜。如滤纸过湿，妨碍空 气与菌苔接触，延长显色时间，造成假阴性。气与菌苔接触，延长显色时间，造成假阴性。 细菌分离与鉴定方 AHM鉴别培养鉴别培养

14、AHM为Aeromonas Hydrophila Medium 的缩写。 用于可疑气单胞菌菌落的鉴定。用于可疑气单胞菌菌落的鉴定。 AHM鉴别培养基鉴别培养基 成分成分 蛋白胨 5.0g 酵母提取物 3.0g 胰蛋白胨 10.0g L-盐酸鸟氨酸 5.0g 甘露醇 1.0g 肌醇 10.0g 硫代硫酸钠（Na2S2O35H2O） 0.4g 枸椽酸铁胺 0.5g 溴甲酚紫 0.02g 琼脂 3.0g 蒸馏水 1000mL 制法制法 将各种成分（除溴甲酚紫外）溶化于1升水中，调pH6.7，加入溴甲酚紫，混 匀煮沸。分装于13100mm试管，每管 5.0ml，于121，灭菌15分钟。 （溴甲酚紫的有

15、效pH范围5.26.8，颜色变化：黄紫） 细菌分离与鉴定方 AHM鉴别培养鉴别培养 方法方法 以接种针挑取可疑菌落，穿刺接种达于管底，置以接种针挑取可疑菌落，穿刺接种达于管底，置352 培养培养1824h，如反应不肯定，可继续培养，如反应不肯定，可继续培养1824h。 气单胞菌典型反应为培养基管底部为变黄，在接近于试管气单胞菌典型反应为培养基管底部为变黄，在接近于试管 顶部有紫色带出现。此表明反因为甘露醇阳性，肌醇阴性，顶部有紫色带出现。此表明反因为甘露醇阳性，肌醇阴性， 鸟氨酸脱羧酶阴性（鸟氨酸脱羧产生腐胺，可使培养基由鸟氨酸脱羧酶阴性（鸟氨酸脱羧产生腐胺，可使培养基由 酸变碱）。有时仅在试

16、管顶端部有轻微变黑，此表明是因酸变碱）。有时仅在试管顶端部有轻微变黑，此表明是因 分解半胱氨酸产生硫化氢所致。沿穿刺线全部呈混浊状，分解半胱氨酸产生硫化氢所致。沿穿刺线全部呈混浊状， 表明该菌具有动力。表明该菌具有动力。 细菌分离与鉴定方 吲哚试验吲哚试验 原理原理 细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚(靛基质靛基质)，经，经 与试剂中的与试剂中的 对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚 而呈红色。而呈红色。 培养基培养基 1%蛋白胨水水溶液：调蛋白胨水水溶液：调pH7.27.6，分装于，分装于1/3 1/4试管，试管，115蒸

17、汽灭菌蒸汽灭菌30分钟。分钟。 Kovacs 试剂试剂 对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛 5.0g 戊醇戊醇 75g（ml） 浓盐酸浓盐酸 25ml 细菌分离与鉴定方 吲哚试验吲哚试验 方法方法 将新鲜的菌种接种与上述培养基中，将新鲜的菌种接种与上述培养基中，28培养培养24 h。 沿管壁缓缓加入沿管壁缓缓加入35mm高的高的Kovacs试剂于培养液试剂于培养液 表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。若颜 色不明显，可加色不明显，可加45滴乙醚至培养基，摇动，使乙滴乙醚至培养基，摇动，使乙 醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至醚分散于液

18、体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至 液面后，在加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲液面后，在加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲 哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应，哚可被提取在乙醚层中，浓缩的吲哚和试剂反应， 则颜色明显。则颜色明显。 嗜水气单胞菌吲哚试验阳性嗜水气单胞菌吲哚试验阳性 细菌分离与鉴定方 革兰氏染色法革兰氏染色法 由丹麦病理学家Christain Gram创立，用 于细菌分类学研究。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 Christain Gram氏创立的，用于细菌分类学 研究。革兰氏染色法是细菌学中最重要的 鉴别染色法。 革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰 氏阳性菌

19、（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两 大类。 细菌分离与鉴定方 革兰氏染色法基本原理革兰氏染色法基本原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料 和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷， 能和带负电荷的物质结合。酸性染料的离子带负 电荷，能与带正电荷的物质结合。中性染料是前 两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红 天青等。 因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱 性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采 用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀 绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、 酸性复红或刚果红等酸性染料着色。 细菌分离与

20、鉴定方 革兰氏染色原理革兰氏染色原理 革兰氏染色过程：（结晶紫）初染革兰氏染色过程：（结晶紫）初染 （碘液）（碘液） 媒染媒染 （95%乙醇）乙醇） 脱色脱色 （番红花红）（番红花红） 复染。复染。 初染：当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂初染：当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂 的蓝紫色。的蓝紫色。 媒染：碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一媒染：碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一 碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。 脱色：当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不脱色：当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不 同的。革兰

21、氏阳性细菌结晶紫同的。革兰氏阳性细菌结晶紫-碘的复合物不易被洗脱碘的复合物不易被洗脱 而保留在细胞内，革兰氏阴性菌结晶紫而保留在细胞内，革兰氏阴性菌结晶紫-碘的复合物比碘的复合物比 较容易被洗脱出来。较容易被洗脱出来。 复染：革兰氏阳性细菌仍保留初染时的颜色，呈紫色。复染：革兰氏阳性细菌仍保留初染时的颜色，呈紫色。 革兰氏阴性菌呈红色。革兰氏阴性菌呈红色。 细菌分离与鉴定方 革兰氏染色法原理革兰氏染色法原理 革兰氏染色法之所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴革兰氏染色法之所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴 性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不

22、同决定的。 细菌细胞壁的结构细菌细胞壁的结构 G菌：细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，细胞菌：细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，细胞 壁厚，结构致密，类脂质含量低，用脱色剂处理后，肽聚壁厚，结构致密，类脂质含量低，用脱色剂处理后，肽聚 糖脱水而孔径缩小，通透性降低，故革兰氏染色后细菌仍糖脱水而孔径缩小，通透性降低，故革兰氏染色后细菌仍 保留初染时的颜色，呈紫色。保留初染时的颜色，呈紫色。 G菌：其细胞壁肽聚糖层较薄，交联度低，类脂含量高，菌：其细胞壁肽聚糖层较薄，交联度低，类脂含量高， 故脱色时，类脂质被乙醇故脱色时，类脂质被乙醇(或丙酮或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，溶解，细胞壁透性增

23、大， 使结晶紫使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用番红花红碘的复合物比较容易被洗脱出来，用番红花红 复染后，细菌被染上复染剂的颜色，即红色。复染后，细菌被染上复染剂的颜色，即红色。 细菌分离与鉴定方 革兰氏染色法革兰氏染色法 材料材料 嗜水气单胞菌，葡萄球菌嗜水气单胞菌，葡萄球菌 革兰氏染色液；载玻片；显微镜等。革兰氏染色液；载玻片；显微镜等。 方法方法 涂片：涂片： （1）取载玻片一张，试净。）取载玻片一张，试净。 （2）用灭菌的接种环取生理盐水一滴，放于载玻片的中央（如被检材料是液体，可）用灭菌的接种环取生理盐水一滴，放于载玻片的中央（如被检材料是液体，可 不加生理盐水）。不加生理盐

24、水）。 （3）左手斜持菌种管，右手将菌种管棉塞稍加转动，以便拔下。）左手斜持菌种管，右手将菌种管棉塞稍加转动，以便拔下。 （4）右手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小指拔开菌种管棉塞，管口通过火焰，）右手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小指拔开菌种管棉塞，管口通过火焰， 用接种环取少量菌（切不可过多）。用接种环取少量菌（切不可过多）。 （5）管口再通过火焰，塞好棉塞。）管口再通过火焰，塞好棉塞。 （6）将接种环上的细菌加到载玻片的水滴内，磨匀，涂成直径约）将接种环上的细菌加到载玻片的水滴内，磨匀，涂成直径约1厘米大小的薄薄厘米大小的薄薄 菌膜。菌膜。 干燥：将玻片置于空气中，使其自然干燥。干燥：将

25、玻片置于空气中，使其自然干燥。 固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）次固定（以不烫手为宜） 干燥后将涂片在火焰上缓缓通过三次，其目的是使细菌粘于玻片上，染色和冲水时干燥后将涂片在火焰上缓缓通过三次，其目的是使细菌粘于玻片上，染色和冲水时 不易脱落；且细菌为蛋白质，被热凝固后可保持完整形态。不易脱落；且细菌为蛋白质，被热凝固后可保持完整形态。 固定时通过火焰固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 细菌分离与鉴定方 革兰氏染色法革兰氏染色法 染色：初染染色：初染 媒染媒染

26、 脱色脱色 复染复染 初染：加草酸结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染初染：加草酸结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染12分钟，水洗。分钟，水洗。 媒染：滴加碘液冲去残水，并保持碘液覆盖媒染：滴加碘液冲去残水，并保持碘液覆盖1分钟，水洗。分钟，水洗。 脱色：加脱色：加95%酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。如此重复酒精于玻片上来回流动，倾去酒精。如此重复23次（约次（约30 秒）。水洗。秒）。水洗。 或用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加或用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95 的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色。约的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色

27、。约2030秒钟，立即用水冲净酒精立秒钟，立即用水冲净酒精立 即水洗。即水洗。 复染：加番红花红（沙黄液、稀释复红等），染约复染：加番红花红（沙黄液、稀释复红等），染约1分钟。水洗、干燥。分钟。水洗、干燥。 镜检：干燥后用显微镜观察。革兰氏阴性菌成红色。革兰氏阳性均呈紫色。镜检：干燥后用显微镜观察。革兰氏阴性菌成红色。革兰氏阳性均呈紫色。 以分散开的细菌革兰氏染色反应为准。过于密集的细菌染色后常常呈假阳性。以分散开的细菌革兰氏染色反应为准。过于密集的细菌染色后常常呈假阳性。 同法在同一载玻片上以大肠杆菌和葡萄球菌混合纸片，作革兰氏染色对比。同法在同一载玻片上以大肠杆菌和葡萄球菌混合纸片，作革兰

28、氏染色对比。 细菌分离与鉴定方 革兰氏染色法革兰氏染色法 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过 度，则阳性菌被误染为阴性菌。此外，菌龄也影响染色结度，则阳性菌被误染为阴性菌。此外，菌龄也影响染色结 果，如阳性菌培养时间过长，或已死及部分自行溶解，都果，如阳性菌培养时间过长，或已死及部分自行溶解，都 常呈阴性反应。常呈阴性反应。 结果与思考结果与思考 在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和葡萄球菌被染在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和葡萄球菌被染 成何种颜色？它们是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌？成何种颜色？它们是革兰氏阳性菌还是

29、革兰氏阴性菌？ 作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关 键一步是什么？键一步是什么？ 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能保证你的染当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能保证你的染 色技术操作正确，结果可靠？色技术操作正确，结果可靠？ G+ G-另一判断方法：取40ul 3%NaOH滴加于洁净的载波 片上，用接种环刮去平板单个菌苔适量，在NaOH滴上研 磨40S，用接种环挑起，若有拉丝现象，则为G-，否则为 G+ 细菌分离与鉴定方 糖发酵试验糖发酵试验 原理原理 各种细菌因含有发酵不同糖类的酶，所以分解糖类 的能力各不相同，有

30、的能分解多种糖类，有的仅能 分解12中糖类，还有不能分解。细菌分解多糖类， 如淀粉、菊糖等，因其分子较大，不能进入细菌细 胞，必须被细菌分泌的胞外酶水解后，才能为细菌 吸收利用。双糖也要胞外酶水解为单糖后被细菌所 利用。细菌利用的单糖主要有葡萄糖、果糖等，细 菌发酵葡萄糖可产生丙酮酸，生成乳酸、琥珀酸、 甲酸、乙酸等有机酸，并生成醇类和气体（CO2和 H2）。细菌分解糖类后产生的代谢产物可因菌种的 不同而异，有的产酸、产气，有的则仅产酸，故可 利用此特点以鉴别细菌。 细菌分离与鉴定方 糖发酵试验糖发酵试验 培养基培养基 蛋白胨蛋白胨 5.0g 溴甲酚紫（溴甲酚紫（0.04%） 15 ml 蒸馏

31、水蒸馏水1000mL,调调PH至至7.4,分装，每瓶分装，每瓶100ml 每每100ml蛋白胨水中分别加入葡萄糖、蔗糖、阿拉蛋白胨水中分别加入葡萄糖、蔗糖、阿拉 伯糖、七叶苷及水杨苷伯糖、七叶苷及水杨苷1.0g，充分溶解，分装试管，充分溶解，分装试管， 106.44kPa高压灭菌高压灭菌10min。 方法方法 以幼龄斜面培养物分别接种上述发酵管，以幼龄斜面培养物分别接种上述发酵管，28培养培养 24 h。凡试验管颜色从紫色变为黄色，表明细菌可。凡试验管颜色从紫色变为黄色，表明细菌可 发酵该种糖类，判为阳性。发酵该种糖类，判为阳性。 嗜水气单胞菌可发酵以上嗜水气单胞菌可发酵以上5种糖类。种糖类。 细菌分离与鉴定方 脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验）脱脂奶平板试验（酪蛋白胨化试验） 原理原理 大部分细菌无直接分解蛋白质的能力，多是利大部分细菌无直接分解蛋白质的能力，多是