高等色谱分析知识总结(超级完整版)

1、一、 色谱概论色谱区别于其他分析方法的特点：一次进样完成分离与测定，同时进行多组分的定性定量测量。1、 提高分离度R的方法：. 容量因子k(流动相流速，柱温) 在k=0-5时，利用保留作用提高R是最有效的，一般要求不超过10，否则会大大延长分析时间。1） LC中最重要的是改变流动相的组成。2） 调节柱温。有可能改变流出顺序。GC中降低柱温可以提高k。3） GC中可通过降低载气流速提高k. 选择性（流动相和固定相组成，柱温）1） 改变流动相组成、种类和pH2） 调节柱温3） 改变固定相4） 采用化学改性剂. 柱效N（柱质量，柱长，温度，流动相）H=A+B/u+Cu1） 涡流扩散项：用粒度分布较窄

2、的填料用小的粒度（要适中）小孔径柱子减少排列的不紧密及死体积2） 分子扩散项：（在LC中作用小）使用重载气减小柱温增大流速3） 传质阻力项：减小粒径流动相粘度小、流速小固定相膜涂薄、均匀、低粘度升高柱温轻载气4） 适当增加柱长5） 柱外体积小. 柱外体积的影响（尤其是小内径柱子和HPLC上） 柱外效应：从进样系统到检测器之间色谱柱以外的流路部分，由于进样方式、柱后扩散等因素对柱效能产生的影响。. 程序升温和梯度洗脱 程序升温：在分离过程中柱温随时间改变 （组成简单的样品最好用恒温分析，这样分析周期会短一些，特别是用填充柱时，恒温分析时色谱图的基线要比程序升温时稳定得多。对于组成复杂的样品，常需

3、用程序升温分离，因为在恒温条件下，如果柱温较低，则低沸点组分分离得好，而高沸点组分流出时间会太长，造成峰展宽，甚至滞留在色谱柱中造成污染；反之，当柱温太高时，低沸点组分难以分离。） 梯度洗脱：在分离过程中流动相组成随时间改变2、 色谱理论新进展：Poppe Plot 理论阐明了粒度与分离时间、N和柱压降的关系. 柱长，N，但是峰容量不一定大. 填料粒度越小越好1） 柱压降&填料粒度、柱长、分析时间的关系：粒度小N高R高峰容量大粒度小柱压降大柱长短分析时间短 2）根据对N的要求选择粒径，同等N下粒径小会使分析时间大大增加3、 流动相：运载样品通过色谱柱的相4、 固相微萃取（SPE）:属液固分离，

4、待测物质从液相被萃取到固相，再用很少的溶剂洗脱下来，固相萃取柱的原理与色谱分离相同。不仅快速，且节约了溶剂，避免了浓缩步骤。5、 色谱定量需要用标准品的原因：绝大部分色谱检测器上，相同浓度的不同化合物在同一分析条件下、同一检测器上得到的峰面积或峰高往往是不相等的，故必须用标准样品进行校准，方可得到准确的定量分析结果。6、 判断出峰顺序PEG-20M（强极性）:环己烷，正辛烷，苯；丙酮、乙醇、异丙醇（氢键）OV-1（非极性）：丙酮（56.5）、异丙醇（82）、异辛烷（99.2）CZE pH3:苯胺、甲苯、苯甲酸；苯胺、苯甲酸乙酯、萘甲酸C18：硫脲、对硝基氯苯、甲苯；硝基甲苯、氯苯、二甲苯7、

5、色谱的活的灵魂：寻找物质间的差异，必要时创造差异，并利用差异达到使物质分离的目的。二、 GC缺点：对未知物的定性比较困难。解决办法：与其它分析方法联用（质谱、红外和电化学等）1、 GC的两种类型：填充柱和毛细管柱（按色谱柱分类）；气固色谱和气液色谱（按固定相分类）；分配色谱和吸附色谱（按分离机理分类）。. 毛细管柱的优缺点1） 优点：比填充柱分离效率更高（没有固体填料，气阻小，故可采用较长的柱子和较小的柱内径及较高的载气流速），消除了涡流扩散同时减小了纵向扩散造成的谱带展宽。采用较薄的固定液膜又在一定程度上抵消了由于载气流速增大引起的传质阻力增大。2） 缺点：柱容量小，且对进样技术要求高，载气

6、流速的控制要求更精确，进样量过大易造成柱超载，因而对检测器灵敏度要求高。3） 对永久气体的分析，填充柱（包括填充毛细管柱）的分离能力更强。.气固色谱吸附机理：固体固定相，如多孔氧化铝高分子小球，主要用于永久性气体和M较低的有机化合物。气液色谱分配机理：液体固定相，90%以上分析基于此。2、 保留机理：.强极性固定液（如PEG-20） 极性小的先出峰；极性相似的，沸点低的先出峰。.弱极性固定液（如OV-1，OV101，SE-30）注：OV的其他型号是有极性的 沸点低的先出峰；沸点相近的分不开。3、 进样方式（应考虑的问题有：样品的稳定性；进样口对峰展宽的影响等）.分流进样：操作简单，但有分流歧视

7、，样品可能分解。.不分流进样：操作复杂一些，但分析灵敏度高，常用于痕量分析。.冷柱上进样：样品以液体状态直接进入色谱柱，无分流歧视问题。分析精度高，重现性好。适用于沸点范围宽或不稳定的样品，也常用于痕量分析（也可做柱上浓缩）。.程序升温气化进样：分流/不分流进样与冷柱上进样的结合，适应性更强，灵活性更好。.大体积进样：程序升温气化或冷柱上进样口，配合以溶液放空功能。.顶空进样：通过样品基质上方的气体成分来测定这些组分在原样品中的含量，只取气相易挥发组分，大大减少了样品基质对分析的影响。.裂解进样：在严格控制的高温下将不能气化或部分不能气化的样品裂解为可气化的小分子化合物，进而用GC分析，适用于

8、聚合物样品。对热不稳定的化合物，最好采用冷柱进样技术，对于热稳定的严谨，分流/不分流进样。4、 隔垫吹扫功能原因：进样隔垫一般为硅橡胶材料制成，不可避免的含有一些残留溶剂和低分子聚 合物；由于气化室高温的影响，硅橡胶会发生降解产生硅氧烷鬼峰5、 分流歧视：指一定分流比条件下，不同样品组分的实际分流比是不同的。.原因：1） 不均匀气化（主要原因）2） 不同样品组分在载气中的扩散速率不同，而扩散速率与温度成正比。.消除方法：1） 较高的气化温度2） 色谱柱的初温应高3） 分流比小更有利4） 使用合适的衬管5） 色谱柱安装：柱入口端超过分流点，且处于气化室衬管的中央。6、 程序升温：分离过程中温度随

9、时间改变7、 尾吹气：FID作为检测器时从色谱柱出口直接进入检测器的一路气体，由于毛细管柱内载气流量太低，为满足火焰灵敏度对氢气、空气和氮气比率的要求而增加氦气作为尾吹气。填充柱不用尾吹气，而毛细管柱大多采用尾吹气。作用有：.调节气体比例，提高检测灵敏度。.维持火焰稳定。.毛细管柱载气流速低，样品流出色谱柱后可能因体积膨胀而导致谱带展宽，尾吹气起到包裹、加速的作用，可消除这种柱外效应。8、 GC载气：H2：M小，传质阻力项影响小，热导率大，使用热导检测器（TCD）时灵敏度高N2：M适中，容易调节流速，成本低He：M小，传质阻力项影响小Ar：M大，分子扩散项影响小不能用干燥空气作载气，因为空气成

10、分多，而不纯的气体会使检测器的噪音增大，降低检测灵敏度，缩小线性范围，还可能对色谱柱性能有影响。9、 检测器1） 火焰离子化检测器（FID）：质量型，准通用型，对CH化合物的灵敏度高2） 热导检测器（TCD）：浓度型，通用型，适用于各种无机气体和有机物的分析，多用于永久气体的分析。3） 电子俘获检测器（ECD）：浓度型，选择型，适合分析含电负性元素或基团的有机化合物，多用于分析含卤素化合物。4） 氮磷检测器（NPD）：质量型，选择型，适合于含氮和含磷化合物的分析。5） 火焰光度检测器（FPD）：浓度型，选择型，适合于含硫、含磷和含氮化合物的分析。10、二维色谱：采用合适的调制器将两个色谱柱连接

11、起来，第一级色谱分离后的组分可以转移到第二级色谱中继续分离。中心切割：仅将第一级色谱中未分离开的组分送入二级色谱进行分离，分离能力可表示为n+m。全二维色谱：将第一级色谱的所有组分都送入第二级色谱，且两柱的分离机理往往不同，分离能力可表示为nm。11、反吹的优点：效率高；延长柱使用寿命；降低检测器污染；降低操作成本；减少仪器维护频率；背景干扰小，数据可靠。12、GC-MS：适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的物质。1）GC对MS的要求：分子结构鉴定能力快速响应能力不损失分离度高灵敏度在线联用2）接口： 喷射式分离器：分离除去大部分载气，使试样组分浓集；同时使其达到质谱的真空度。 开口分流型

12、：色谱流量大时，传输能力较低，不适用于填充柱条件 毛细管直接连接：无死体积，无选择性，受柱容量限制。3）GC载气的选择 .化学惰性，不干扰质谱图； .不使用N2：（电离能15.6eV，和一般有机物接近），对总离子流有干扰；其分子离子峰信号较强，接近通常MS扫描起始质量； .使用He：电离能24.6eV，对TIC干扰小；分子离子峰不影响低质量区 .高纯4）色谱柱和隔垫本底：色谱柱中固定相、隔垫残渣主要成分都是硅氧烷的聚合物，在高温下分解通常称为“流失”，这种流失进入离子源，是GC-MS质谱图中背景的主要来源。 消除方法：选择耐高温、低流失的隔垫，常换隔垫，防止隔垫碎屑进入衬管三、 HPLC1、

13、按吸附机理分：.吸附色谱（液固色谱）：针对弱极性和中等极性的化合物，以及同系物的分离。.分配色谱：又分为液液分配色谱和键合相分配色谱1） 正相HPLC：弱极性到中等极性，异构体固定相极性流动相极性，极性小的先出峰。2） 反相HPLC：强极性，同系物和苯系物，也可适用于离子化的酸性或碱性化合物（离子对HPLC）。很难分析胺和不溶于水的化合物。固定相极性-OH,-NH2-C=O-NO2-O-X芳烃-CH3; C数，不饱和度，支链，则极性。 .离子交换色谱（IEC）：有机或无机离子。按照荷电基团进行可逆性离子交换的能力的差异进行分离。 .体积排阻色谱（SEC）：用于M2000的聚合物和生物大分子。

14、大分子先出峰。 .亲和色谱（AC）：生化分析和药物筛选2、 梯度洗脱：在分离过程中改变流动相组成，后期逐渐增加有机改性剂的含量，分配转移到流动相，增加化合物的流速，尾部的速度比峰中心快，使峰聚焦。优点：改善峰形和分离度，提高分离能力；提高检测灵敏度；缩短分析时间；降低由于强保留组分而使色谱柱性能变差的可能性缺点：有时引起基线漂移；强保留添加剂不适用；离子对色谱不适用；裸硅胶柱上正相HPLC，部分检测器不适用3、 色谱柱封端（填料封尾）：加入小分子的硅烷化试剂，与固定相硅胶基体表面上残留的硅羟基或氨基反应，使其表面惰性更好，对碱性化合物的吸附作用大大减小，减少了二次保留作用，改善分离效果。分单体

15、键合与聚合键合（惰性更好）4、 离子抑制技术：在反相HPLC中加入改性试剂以控制流动相的酸碱性，达到改善色谱峰形，提高分离度的目的。分析弱酸时加入三氟乙酸，分析弱碱时加入三乙胺。5、 提高的方法：见第一部分6、 检测器7、 紫外可见（UV-Vis）检测器：适用于绝大多数物质，可进行梯度分析，缺点是要求流动相无吸收。示差折光检测器：适用于检测碳水化合物，不可进行梯度洗脱，且受温度、压力、流速影响大；灵敏度低，检测限高。电导检测器（ECD）：选择性检测器，在离子色谱中广泛应用。不适用于梯度洗脱。荧光检测器（FLD）：高灵敏度，高选择性。适用于芳烃、甾族、氨基酸、维生素、酶、蛋白质的检测，可进行梯度

16、洗脱；受温度、流速变化影响小，灵敏度高；缺点是只能用于荧光活性物质检测。蒸发光散射检测器（ELSD）：通用型检测器，灵敏度比示差折光检测器高1-2个数量级，主要应用于糖检测；缺点是操作复杂，成本高。8、 HPLC对流动相的基本要求：1） 纯度高2） 与固定相不互溶，以避免固定相的降解和塌陷3） 对样品有足够的溶解度，以改善峰形和灵敏度4） 粘度低，以降低传质阻力，提高柱效5） 与检测器兼容，以降低背景信号和基线噪音6） 毒性小，安全性好9、 HPLC的应用1）M2000的样品需用SEC（体积排阻色谱）分离，脂溶性大分子用GPC（凝胶渗透色谱）、水溶性大分子用GFC（凝胶过滤色谱）2）对于M20

17、00的化合物，若极性较弱，可采用吸附色谱法或正相键合色谱法3）分离位置异构体如苯的取代位置异构体一般用吸附色谱法4）分离同系物则多用分配色谱法5）若是强极性混合物，则多用反相键合色谱分离6）对于弱酸性或弱碱性化合物，用反相离子对色谱7）离子型化合物用离子交换色谱8）生物大分子可用亲和色谱法10、HPLC和GC的比较HPLCGC样品挥发性没有挥发性要求样品必须溶于流动相样品必须是可挥发的样品极性可分离极性和非极性化合物从多环芳烃（PAH）到无机离子样品是非极性（大部分）和极性（少）的样品的热稳定性分析可在室温或低于室温条件下进行样品必须能经受进样口和色谱柱的高温样品的分子量没有理论上限，但实际上

18、，溶解度是一个限制典型的分子量所有样品离子尾随缓冲液，在外加电场作用下，运动平衡后样品区带匀速运动。缓冲液离子强度样品，样品区带的电导率低，局部电场强度大，在高电场作用下，淌度高的在前，淌度低的在后，使样品分离。3） 用途：在线样品浓缩（柱上浓缩）5、 进样方式. 压差进样：分为正压力进样、负压力进样、虹吸进样。. 电动进样：依靠电渗流将样品带入毛细管。存在进样歧视，即由于各组分的电渗淌度不同导致进入毛细管的样品组成与原来样品的组成不同。若不经过校准，误差大于压差进样。6、 检测器.UV1） 柱上检测，因此检测池即毛细管是圆柱形的，入射面是曲面；不同于一般方形样品池（入射面是平面）。因此线性范

19、围小，噪声高。解决方法有：Bubble池和Z型池2） 间接UV检测方法：分析物没有紫外吸收性质时，在分离介质中加入具有紫外吸收光性质的物质，造成很强的背景吸收，当样品组分流过检测窗口时出现负峰，通过极性转换即可得到正常的电泳图。3） 检测歧视：不同组分的区带在毛细管电泳中迁移速率不同，通过检测窗口的速率也不一样，导致吸光系数相等、浓度相同的组分所得峰面积不相等，故需要标准样品校准。.LIF（激光诱导荧光） 是CE检测器中灵敏度最高的，但并不是所有样品都有荧光，需要衍生化。.电化学检测器：柱后检测7、 CE-MS的三种接口类型：鞘液型、无鞘液型、液接型鞘液型优点：喷雾更加稳定、形成电流回路、可改

20、变缓冲溶液组成鞘液型缺点：会稀释待测物、电接触8、 如何提高灵敏度：优化电泳条件柱上浓缩用高灵敏度检测器：LIF、MS9、 如何提高重现性：每次灌胶毛细管涂渍技术（PFG,PVA）严格控制每次的条件参数一致，如温度等作业第一次1.Couldpersonsbeclassifiedbychromatographicstreet?可以尝试建立一种模型：人作为色谱街中的被分析物，一条街道作为分离系统中的色谱柱。街道上的不同商家店铺可视为色谱柱中的固定相，不同的人在其中的停留时间不同，街道上的交通信号灯以及每个人的行进速度等都会造成最终到达终点的时间不同，即保留时间不同。据此，色谱街道可以完成对人的分离

21、。2.LC的出现早于GC，但GC作为常规方法的应用则早于LC，为什么？尽管液相色谱在1903年就出现了，但由于经典的液相色谱法柱效低，未能得以广泛的应用。而高压液相色谱涉及到固定相的制备，小体积检测器的制备，高压泵的制造技术等是在接下来的一段长时间内逐步完善起来的。20世纪60年代，毛细管气相色谱的问世，从毛细管GC的理论研究到各种检测技术的出现，使得GC迅速的从实验室研究用仪器发展为常规的分析手段，同时由于当时石油化工领域的蓬勃发展也进一步促进了GC的发展和应用。第二次1. 色谱分离动力学理论，热力学理论和分离优化理论的主要研究内容？色谱分离动力学主要从动态角度由宏观唯象到微观分析水平探索色

22、谱分离的过程机理。探索各种因素对分辨率，灵敏度，以及分离速率的影响，为条件优化提供理论基础。如：速率理论。热力学理论主要讨论各物态间的相平衡，物质在色谱上的保留行为，即组分在固定相和流动相中的分配系数的影响因素。如塔板理论。分离优化理论主要研究色谱分离的优化。即在保证分离度和灵敏度的前提下，实现快速分离。在实际工作中首先满足分离度的要求，然后提高灵敏度，最后考虑尽可能缩短分析时间。2.色谱和毛细管电泳分离优化要调控的主要参数是什么？气相色谱主要调控的参数：载气种类，载气流速，色谱柱类型、色谱柱柱长、内径、膜厚，温度，进样量，分流比，检测器和气化室温度，以及固定液的选择等。液相色谱主要调控参数：

23、流动相组成（梯度或等度洗脱，pH值），流动相流速，色谱柱类型、色谱柱长、内径、填料粒度，柱温，进样量，溶样溶剂等。毛细管电泳分离主要调控参数：缓冲盐成分，缓冲液pH，缓冲液浓度，电压，毛细管管长及内径，添加剂成分及浓度，进样方式及时间，温度，毛细管涂层等。3Poppeplot有什么理论和实践意义？Poppeplot是HansPoppe在研究色谱分离动力学理论时在VanDeemter速率理论基础上提出的补充，指出颗粒粒径与柱压降之间的关系，推导出最佳固定相粒度公式。Poppeplot的实践意义在于在实际样品分析过程中不能盲目的追求小粒径的填料，并不是填料粒度越小柱效越高。同时，当填充物粒度达到纳

24、米尺度时，未知的纳米效应仍然未知。第三次1.CGC检测器为什么常常吹尾气？1)消除检测器死体积，由于毛细管气相色谱载气流速低，所以分离的化合物流出色谱柱后，会由于管道体积增大而引起谱带展宽，加尾吹气后可使色谱柱分离出的各组分加速通过检测器，减小纵向扩散带来的谱带扩张。2)对于火焰离子化检测器而言，需要的最佳流速要高于毛细管气相色谱的流速，因此加尾吹气有助于维持火焰的稳定性，以提高检测灵敏度。2.柱上进样的优缺点？优点：a消除了进样口对样品的歧视效应，包括注射器针头的歧视效应，这是因为液体样品直接进入柱内，进样过程中样品不会汽化，没有分流问题。b避免了样品的分解。样品既不接触可能有催化作用的气化

25、室内表面，也不经受高温，所以，冷柱上进样是分析热不稳定化合物的理想方法。c由于样品进入色谱柱处于低温，故很容易实现早流出峰的溶剂聚焦。d由于上述三点，分析准确度、精密度比分流/不分流进样高。缺点：a进样体积小，大进样量容易造成超载。b操作复杂，对初始柱温、溶剂性质、进样速度等有较为严格的要求要用特殊注射器。c毛细管柱容易被污染，样品记忆效应也较明显。d在溶剂峰前面流出的组分很难实现聚焦，测定困难。3.作为GC的检测器MS和单机的MS有什么不同？1)作为GC的检测器的MS需要满足检测GC能够分离的样品的要求，通常GC用来检测可挥发的热稳定性的小分子的有机化合物和气体样品，GC-MS的质谱部分离子

26、化方式主要为电子轰击离子化和化学电离模式，可进行谱图库检索对化合物进行定性。同时为了满足联机分析的要求，质量分析器通常要求扫描速度快，灵敏度高，体积较小，目前联用的MS多为四极杆质量分析器，检测器多为电子倍增器。2)GC相当于MS的分离装置，可分析非常复杂的样品，单机MS不行。3)单机MS不需要制作接口。4)单机MS可以配多种其它的电离源和质量分析器，满足分析不同样品的需求，可对被分析物进行高分辨率、高精确度的分析，同时其检测器和数据采集方式等也与常用GC-MS不同。4.什么是Scan和SIM？二者的主要用途？Scan是全扫描或连续扫描。即在一定质荷比范围内的全部离子都进行质谱分析。主要用途：

27、因其包含了大量信息数据，多用于组分的定性分析。SIM是选择离子监测，又称跳变扫描：即只对选定的离子进行质谱分析，其它离子被过滤掉。主要用途：对已知成分进行定量分析，灵敏度比Scan模式高。第四次1什么叫二维色谱？中心切割和全二维色谱有何差别？二维色谱是最常见的一种多维色谱，是指两支色谱柱以串联的方式结合在一起的一种色谱分析方法。中心切割即通常所说的（GC+GC），一般是从第一支色谱柱切割出感兴趣的部分馏分在第二支色谱柱上进行分离，缺点是只把第一支色谱柱上的部分馏分转移到第二支柱上进行进一步的分离，不能完全利用二维气相色谱的峰容量。全二维色谱（GCxGC）是把分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱

28、以串联的方式结合成二维色谱，在两只色谱柱之间装一个调制器，起捕集再传输的作用，第一支色谱柱分离后的每一个馏分先进入调制器聚焦后再以脉冲的形式进入第二支色谱柱进行进一步的分离，分离出的所有组分均进入检测器进行检测，全二维色谱要求配有快速的数据采集检测器。2.反吹的好处？反吹可以使不需要分离的出峰时间长的重组分不通过分离被反吹出来，提高仪器运行效率，节省分离时间，也可以保护色谱柱，延长柱使用寿命。反吹还可以使在进行进样口维护时保护气相色谱柱。还可以降低检测器污染，如GC-MS联用中需要更换GC色谱柱时不需要MS放真空。同时还有降低操作成本，减小仪器维护频率，使背景干扰小，数据可靠等等好处。3.提高样品组分保留的方法？（1）流动相的类型及组成比例；对于反相HPLC来说，增强流动相中弱洗脱能力物质的比例（如，水），改变流动相种类用低洗脱能力的流动相代替高洗脱能力的流动相等。（2）固定相的类型：对于非极性化合物而言，C18柱保留强于C8柱。（3）降低流动相流速和/或色谱柱温度注意：保留因子是特定化合物在给定流动相组成、温度和柱类型条件下的保留特征.它消除了柱尺寸和流速的作用4.减小色谱峰宽的四种方法？降低柱外死体积；提高流动相洗脱强度；提