[精品][经典]塞来昔布治疗裸鼠前列腺癌骨转移研究

1、经典塞来昔布治疗裸鼠前列腺癌骨转移研究塞来昔布治疗裸鼠前列腺癌骨转移研究【摘要】目的建立裸鼠前列腺癌骨转移模型，探讨塞来昔布 作为血管抑制剂对前列腺癌骨转移的形成及生长的影响。方法将30 只前列腺癌骨转移裸鼠随机分成二组，第一组隔日予以生理盐水，腹 腔注射；第二组隔日予以塞来昔布30 mg/kg,腹腔注射；30d后处 死。检测血清碱性磷酸酶，采用免疫组化和图象分析系统测定血管内 皮生长因子(vegf)和肿瘤微血管密度(mvd),光镜下观察各组肿瘤组 织，流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡。结果治疗组肿瘤的生长明显受 到抑制(p0. 01),塞来昔布组肿瘤组织屮的vegf和mvd与对照组比 较无统计学

2、意义(p<0. 01),抑瘤率为54. 47%，凋亡指数由 (4.68±183)%上升到(24.93±614)%,血清碱性磷酸酶由(26.5土4. 93)u/l下降到(17. 17土3. 13)u/lo结论 塞来昔布能显著 抑制裸鼠前列腺癌骨转移瘤的生长和新生血管形成。o【关键词】塞来昔布；前列癌骨转移令作者单位：332000九江市第一人民医院骨外科骨是前列腺癌转移的好发部位，约80%的前列腺癌的患者发生 骨转移，其机理尚未完全明确，但肿瘤的生长及转移与血管生成密切 相关的理论已得到公认^lo塞来昔布是一种新型的非笛 体类

3、抗炎药，因具有抗血管生成及诱导肿瘤细胞凋亡的作用而引起人 们的关注。关其单独应用对前列腺癌骨转移瘤生长影响的研究目前 尚未见报道，本实验对此进行初步探讨。1材料和方法1.1主要试剂和材料blabc种系裸鼠,spf级，鼠龄4、8周，雌性，体重1520 g, 共30只，购于湖北省防疫站，在武汉大学动物实验中心spf环境中 饲养。人前列腺癌细胞系pc3购于中科院武汉生物保存中心。vegf 抗体、鼠抗人v111因子抗体购于北京屮山公司。1.2前列腺癌骨转移动物模型建立²前列腺癌单细胞悬液采用pc3细胞，用pbs调节细胞浓度到 1x100070个/ml。裸

4、鼠用戊巴比妥钠麻醉,75%乙醇消毒股骨及胫 骨处皮肤后，用4. 5号针头直接于股骨驟上刺透骨皮质，然后将针尖 插入骨干内注入0. 1 ml的单细胞悬液。1.3动物分组与标本处理将接种之后的裸鼠30只随机分为2组，每组15只。24 h后给 药，第一组（对照组）:隔13腹腔注射生理盐水；第二组（塞來昔布组）: 隔h腹腔注射塞來昔布30 mg/kgo 30 d后断颈处死裸鼠，处死z前 每只摘眼球放血以检测血清碱性磷酸酶的含量；脊椎离断处死后连同 包膜完整剥出肿瘤组织，电了天平称重，游标卡尺测量肿瘤长径和短 径，按下列公式计算体积和抑瘤率。vpxb2/2（v代表肿瘤体积，a为肿瘤长径，b为肿瘤短 径）

5、抑瘤率二（对照组肿瘤体积实验组肿瘤体积）/对照组肿瘤体积 x100% 1.4免疫组织化学染色及结果判断肿瘤组织置于10%中性甲醛中固定24 h,石蜡包埋，连续切片（4 u m）,行vegf和mvd免疫组化染色，以pbs代替一抗作阴性对照。1. 4. 1 vegf判断标准 高倍镜视野下计数100个细胞，胞浆棕黄 的阳性细胞少于5%为阴性，多于或5%为阳性。釆用病理教研室cmias 真彩图形分析系统对vegf的表达进行定量分析。1. 4. 2 mvd判断标准³选用40x镜扫视整个切片， 寻找高血管密度区，然后计数1个200 x视野的染成棕色的血管环（条

6、） 数目（任何染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇，只要它和邻 近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就把它看作1个微血管。 由两名高年资病理医师分别计数3个200视野下的血管数目，取两 者的平均值）。01. 5流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡新鲜的肿瘤组织采用edta螯合法制备成单细胞悬液。然后经70% 乙醇固定，过滤，离心，pi染色，在流式细胞仪上用multicycle for windows软件作细胞周期分析。1.6统计学处理所有数据采用均数土标准差(x±s)表示，各组均数比较釆用单向 方差分析，p<0. 05表示差异有统计学意义，数据采用spss 11.5统 计软件分析。

7、2结果2.1各组鼠重、瘤重及肿瘤体积大小对照组肿瘤体积20 d后增长明显；塞来昔布组则增长缓慢，24 d 后肿瘤儿乎处于停滞状态，体积无明显变化。实验结束时各组鼠重、 瘤重、肿瘤体积见表1。裸鼠体重方面：术后3d称重，两组中均有 部分裸鼠体重下降，到术后一周基本恢复到术前水平。两组裸鼠平均 体重在实验前后改变差异无统计学意义(p>0. 05) o瘤重方面：治疗组 与对照组比较差异有统计学意义(p<0.01)o肿瘤体积方面：治疗组与 对照组比较差异有统计学意义(p<0.01)o令图1对照组与塞來昔布组的肿瘤大小对比：塞来昔布组的瘤体体积比 对照组的瘤体体积明显要小表1两组鼠重、

8、瘤重及肿瘤体积groupmicemice weight(before experiment; g, x±s)mice weight(before sacrifice; g, x± s) tumorweight (g, x±s) tumor vol ume (mm3，x±s) inhi bitory rate (%, x±s)control 1517. 34±1. 4516. 38±1. 471. 77±0. 391658. 63±46. 180 celebrexl517. 02±l. 75a 1

9、7. 86±1. 6900b 1. 02±0. 270 c810. 48±31. 41 令d54. 47ap>0. 05, vs. control;bp>0. 05, vs. control;cp0 01, vs. control; dp0. 01, vs. control2. 2 vegf和mvd的表达vegf主要表达于肿瘤细胞的胞浆和胞膜，呈棕黄色。治疗组与 对照组比较，vegf的表达差杲有统计学意义。所有肿瘤组织中的mvd 均呈阳性表达，内皮细胞被染为棕黄色。微血管的大小、形态差异较 大。塞来昔布组和对照组比较，mvd显著减少。见表2及图2。表2

10、两组肿瘤组织中vegf和mvd的表达groupvegfmvdcontrol33. 50±4. 8728. 17±5. 02celebrex23. 67±3. 25a 14. 92±2. 82bap0 01, vs. control;bp0 01, vs. control 2. 3肿瘤细胞凋亡的检测结果两组肿瘤组织细胞凋亡指数差异有统计学意义(po01) o对照组 的平均凋亡指数为(4. 68±1. 83)%；塞来昔布组肿瘤细胞出现较为明 显的凋亡峰，s期细胞减少，g1期细胞增加，平均凋亡指数为 (24. 93±6. 14)%,较对照组

11、明显升高。图2骨肿瘤的vegf表达x400令图3流式细胞仪检测的凋广图2. 4血清碱性磷酸酶水平两组裸鼠血清碱性磷酸酶有显著差异(p<0. 05) o对照组的平均碱 性磷酸酶值为(26. 5±4. 93)u/l,塞来昔布组的平均碱性磷酸酶值为 (1717±313)u/l,较对照组明显降低。2. 5光镜下肿瘤细胞形态镜下可见对照组肿瘤细胞排列密集，核大小不一，染色深，病理 性核分裂象异常增多，杲型性明显，瘤细胞密度高；而塞来昔布组镜 下可见病理性核分裂象较对照组明显降低，异型性没有对照组高，肿 瘤细胞变性和坏死较对照组明显严重，核固缩和碎裂易见，瘤细胞密 度相对空白组也

12、有显著下降。图4光镜下细胞凋亡形态3讨论用胫骨髓腔注射法制备骨转移模型^{4, 5}o这种方 法具有很高的骨转移形成率。术后第2周即可通过影像学检测到局部 的骨质破坏，结合组织病理学和免疫组织化学方法证实其骨转移率为 100%。该模型形成的骨转移灶增殖快；34周即突破胫骨骨皮质, 局部形成肉眼可见的瘤体，便于观察。塞来昔布组的瘤重与空白组有显著差异，抑瘤率为54. 47%o说明 塞來昔布有效地抑制了转移瘤的生长。塞来昔布是一种高选择性的非 笛体类抗炎药(nonsteroidal antiinflammatory drugs, nsaid), 能选择性抑

13、制cox2,而对cox1儿乎没有作用，而其对转移瘤的 抑制作用可能与塞来昔布高选择性抑制cox02有关¹³o 目前研究认为cox2作为抗肿瘤治疗靶点的机制可能是：cox2 依赖性途径^6,7诱导肿瘤细胞凋亡來抑制肿瘤的工长。jiffcox2诱导血管内皮生长因子(vegf), n0合酶，血管生成素i受 体等促血管因了的表达从而影响肿瘤血管生成。其中vegf是重要的 血管内皮生长因子，它能刺激血管增生，调节血管通透性，能促进肿 瘤周围及内部形成新生的血管并促进肿瘤血道转移<sup>8,9</

14、sup>o 它在多种恶性肿瘤组织内均有过量表达。本研究结果显示塞来昔布组 癌组织的vegf和mvd的表达均较对照组显著降低，这提示塞来昔布 的抗瘤作用主要是通过减少肿瘤组织中vegf的分泌來抑制肿瘤组织 新生血管的形成，使肿瘤组织血管数目减少，血管通透性降低，肿瘤 细胞得不到充足的氧和营养物质，从而抑制肿瘤的生长。参考文献1 wong sy, hack h, crowlev d, et al. tumor secretedvascular endothelial growth factor c is necessary for prostate cancer lymphangiogene

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