PCR原理与应用

1、PCR原理与应用 Principle and application of PCR目录PCR原理 应用 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。简述简述0501020304PCR五要素模板Mg2+引物原料dNPTDNA聚合酶 单、双链DNA均可，一般为双链。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（1）模板浓

2、度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。（2）引物浓度（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。（4）dNTP（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。

3、变变性性退退火火延延伸伸主要步骤变性退火复性模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；DNA模板-引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。循环参数 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 变性 94oC 20-30秒 延伸 70-75,一般为72循环次数25至35 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度

4、可增加反应的灵敏性延伸时间由扩增片段长度决定次数过多： 扩增效率降低错误掺入率增加PCR不对称PCR逆转录PCR差异显示PCR锚定PCR多重PCR单链构象多态性PCR实时荧光定量PCR反向PCR随机引物PCR延伸。延伸。PCR技术在不断进化，而种类也会越来越多。1）不对称PCR(asymmetric PCR) 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01 0.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型应用2）、逆转录PCR (revers

5、e transcription PCR, RT-PCR) RT-PCR先在逆转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板加入dNTP和两种特异引物及Taq酶进行PCR反应，这样低丰度的mRNA被扩增放大易于检测。 RT-PCR中的关键步骤是RNA的逆转录，要求RNA模板必须是完整的，且不含DNA、蛋白质等杂质。RT-PCR图解 3）、锚定PCR(anchored PCR, A-PCR) 该法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，再用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因配对互补结合后进行PCR扩增。4）、）、反向反向PCR (in

6、verse PCR, IPCR)IPCR是是扩增未知序列扩增未知序列的一种简捷方法。其基础是：用的一种简捷方法。其基础是：用限制性内切酶消化限制性内切酶消化DNA，然后环化切割的产物，再用，然后环化切割的产物，再用切割后已知序列上两端相反方向的引物序列进行切割后已知序列上两端相反方向的引物序列进行PCR (图图8-3)，也可将环化，也可将环化DNA线性化后再进行线性化后再进行PCR。5）、）、随机引物随机引物PCR (arbitrary primer PCR, AP-PCR) RAPD建立在建立在PCR基础之上，它是利用一系列不基础之上，它是利用一系列不同的随机排列的寡核苷酸链同的随机排列的寡

7、核苷酸链(通常为十聚体通常为十聚体)为引物，为引物，对所研究基因组对所研究基因组DNA进行进行PCR扩增，扩增产物通过扩增，扩增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，经EB染色来检染色来检测扩增测扩增DNA片段多态性。可用于片段多态性。可用于进行基因组指纹图进行基因组指纹图谱的构建，并利用指纹图谱进行品种鉴定和对物种进谱的构建，并利用指纹图谱进行品种鉴定和对物种进行亲缘关系和系统进化的研究。行亲缘关系和系统进化的研究。 6）、差异显示差异显示RT-PCR(differential display RT-PCR,DDRT-PCR) DDRT-PCR技术最大的优

8、点是技术最大的优点是省去了省去了cDNA克隆和随后繁杂的克克隆和随后繁杂的克隆筛选工作隆筛选工作。但此方法也存在需要合成的引物多、费用大、操作技。但此方法也存在需要合成的引物多、费用大、操作技术要求高、虚假特异区带出现较多等缺点，仍有待进一步完善。如术要求高、虚假特异区带出现较多等缺点，仍有待进一步完善。如图图8-4。7 ） 、） 、 单 链 构 象 多 态 性单 链 构 象 多 态 性 P C R ( s i n g l e s t r a n d construction polymor-phism PCR, SSCP-PCR) 其原理是单链其原理是单链DNA分子因单一核苷酸不同，其二分子

9、因单一核苷酸不同，其二级结构有所差异，级结构有所差异，PCR产物常表现在非变性凝胶电泳产物常表现在非变性凝胶电泳中电泳迁移率不同。通过比较中电泳迁移率不同。通过比较DNA的电泳类型，即的电泳类型，即可测出突变。其优点是所需样品可测出突变。其优点是所需样品DNA量极少，灵敏量极少，灵敏度高，度高，可检测出点突变，以及插入、缺失突变，能一可检测出点突变，以及插入、缺失突变，能一次筛选多个样品次筛选多个样品。8）、）、多重多重PCR (multiplex PCR) 多重多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的的DNA片段；如果被测基因某一区段缺

10、失，则相应的电泳图谱片段；如果被测基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常(图图8-5)。多重。多重PCR具有灵敏、快速特点，特别具有灵敏、快速特点，特别适用检测单拷贝基因适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern杂交结果同杂交结果同样可靠，且多重样可靠，且多重PCR尚可检测小片段缺失。尚可检测小片段缺失。9）、实时荧光定量）、实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR, qRT-PCR）主要用于主要用于PCR产物实时监控。产物实时监控。应用生命科学临床应用检疫法学鉴定农业科学生命科学 人类基