高糖环境对乏氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响及脑神康胶囊的干预作用

1、高糖环境对乏氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响及脑神康胶囊的干预作用         10-09-06 16:15:00     编辑：studa20                     作者：林炜炜 刘德山 李伟 常萍【摘要】  目的 研究高糖环境对体外培养的大鼠海马

2、神经元乏氧损伤时凋亡的影响以及脑神康胶囊对损伤神经元的保护作用。方法 原代培养大鼠海马神经元，将细胞随机分成8组：对照组、高糖组、黄嘌呤（X）/黄嘌呤氧化酶（XO)组、川芎嗪组、生理盐水组、脑神康低、中、高剂量组。干预后测细胞存活率及凋亡率，采用Realtime PCR法检测各组海马神经元HIF1 mRNA、Bcl2 mRNA和Bax mRNA的表达及Bc2/Bax比值。结果 与对照组相比，高糖组及X/XO组神经元存活率、Bcl2 mRNA表达水平和Bcl2/Bax的水平均显著下降，神经元凋亡率、HIF1 mRNA和Bax mRNA表达水平均显著升高(均P<0.01)；与X/XO组比较，

3、川芎嗪组及脑神康各浓度组神经元存活率、Bcl2 mRNA表达和Bcl2/Bax的水平均明显上升，而神经元凋亡率、HIF1 mRNA和Bax mRNA表达均明显下降。结论 脑神康胶囊能够明显抑制高糖环境下大鼠海马神经元的凋亡，对高糖环境下海马神经元的乏氧损伤有保护作用，其作用机制之一是下调HIF1 mRNA表达、上调Bcl2 mRNA表达、改善乏氧环境及抗细胞凋亡。 【关键词】  海马神经元；高糖；凋亡；黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶；脑神康胶囊    【Abstract】Objective  To research the effect of Naosh

4、enkang capsule on expression of hypoxiainducible factor1 alpha (HIF1) of oxidative damaged rat hippocampal neurons in high glucose. Methods  The primarily cultured neonate rat hippocampal neurons were randomly divided into eight groups: control, high glucose, xanthine/xanthine oxidase (x/xo), l

5、igustrazine, normal sodium and the small, middle, and large dosage of Naoshenkang groups. The rate of cell survival and apoptosis were measured, and the method of realtime PCR was used to detect the mRNA expression of HIF1, Bcl2, Bax. Results  The survival rate, the expression of Bcl2 mRNA and

6、the ratios of Bcl2 and Bax in the high glucose group were lower, but apoptosis and the expression of HIFl and Bax mRNA higher than those of x/xo group (P0.01). The survival rate, the expression of Bcl2 mRNA and the ratios of Bcl2 and Bax in the ligustrazine group and all Naoshenkang groups were sign

7、ificantly higher, but apoptosis and the expression of HIFl and Bax mRNA lower than those of x/xo group. Conclusions  Naoshenkang capsule can significantly inhibit the apoptosis of rat hippocampal neurons in the high glucose, and make a protective effect on hypoxia injury. Its mechanism may be t

8、hat Naoshenkang capsule can downregulate HIFl mRNA expression, upregulate Bcl2 mRNA expression, improve the hypoxia and resist apoptosis.    【Key words】  Hippocampal neurons; High glucose; Apoptosis; Xanthine/xanthine oxidase; Naoshenkang capsule高血糖可引起神经传导速率下降和神经纤维变性，其神经系统的损害除表现在

9、周围神经和自主神经系统外，亦可累及中枢神经系统1，出现糖尿病脑功能损害2，这主要是由于高糖所引发的神经细胞的凋亡所致。目前已有较多文献报道了细胞凋亡与周围神经病变的密切关系3，4，但少见细胞凋亡与脑功能损害的关系报道。 本课题组前期研究了脑神康胶囊对乏氧海马神经元凋亡蛋白表达的影响，结果提示糖尿病引起的海马神经元凋亡可能与乏氧有关4。本实验旨在观察高糖状态对乏氧损伤大鼠海马神经元凋亡的影响，并研究脑神康胶囊的干预作用及其机制。1  材料与方法1.1  材料1.1.1  动物 成年雄性Wistar大鼠，出生24 h之内的Wistar新生鼠均由山东大学实验动

10、物中心提供，大鼠生产许可证号SCXK（鲁）20030004。1.1.2  药品及试剂脑神康胶囊由生黄芪、熟地、黄精、川芎、枸杞子、淫羊藿、苍术、野葛根、黄连等组成，由山东大学齐鲁医院制剂室提取制备，每克相当于生药3.564 g，用蒸馏水配制成5%水溶液备用。盐酸川芎嗪注射液购自山东潍坊制药厂有限公司，批号：030618；胰蛋白酶、多聚赖氨酸、葡萄糖、无水甘露醇、四甲基偶氮唑盐(MTT)、黄嘌呤（X）和黄嘌呤氧化酶（XO）、阿糖胞苷购自Sigma；低糖型DMEM、DMEM/F12、高糖型DMEM培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京

11、凯基生物科技发展有限公司；Trizol购自上海生工生物工程技术服务有限公司）；TaKaRa逆转录试剂盒和SYBR Green购自大连宝生物工程有限公司；毛细管购自Roche公司，所有引物均由上海Invitrogen公司合成。其余试剂为国产分析纯。1.2  方法1.2.1  含药血清的制备 30只成年雄性Wistar大鼠随机分为5组，每组6只，第1、2、3组分别给予脑神康低（5 ml/kg）、中（10 ml/kg）、高浓度（20 ml/kg）灌胃，第4组给予盐酸川芎嗪注射液40 mg/kg腹腔注射，第5组给予同等量生理盐水灌胃，以上操作均2次/d ，连续3 d。第3

12、天末次给药1.5 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，无菌剖腹，下腔静脉取血，凝后3 000 r/min离心8 min，分离血清，56灭活30 min，分装，-20保存备用。1.2.2  原代培养细胞出生24 h之内的Wistar新生鼠，无菌条件下分离出双侧海马，剥除脑膜及结缔组织，剪为1 mm3的小块，置含有0.125%胰蛋白酶的PBS中，37消化15 min，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止胰蛋白酶的作用，轻轻吹打，使组织分散成单细胞悬液，并经200目不锈钢筛过滤，以1×106/L 的密度接种于经0.1 g/L多聚赖氨酸处理过的6孔板中，置37、5% CO2的培养箱中培养，并于接种的第3天加入阿糖胞苷(终浓度为10 mg/L)作用24 h以抑制胶质细胞的增殖。此后每3天半量换液。1.2.3  氧化损伤模型制备 取原代培养的大鼠海马神经元在高糖环境和非高糖环境下培养至第8天的神经细胞用于实验，随机分为以下8组：对照组（5.5 mmol/L DMEM培养液），高糖组（25 mmol/L DMEM培养液）、X/XO组、川芎嗪组、生理盐水组、脑神康低浓度组、脑神