菊粉酶酶源诱变菌株产酶发酵条件的优化

1、菊粉酶酶源诱变菌株产酶发酵条件的优化        摘要为提高黑曲霉（Aspergillus niger）A24诱变菌株产菊粉酶的活力，采用单因子试验方法对该菌株的最佳产酶条件进行了优化。结果表明：该菌株在以3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和0.5%（NH4）2HPO4为复合氮源的培养基中，初始pH值6.0，30 培养72 h的条件下，所得的发酵液中酶活力最高，达到35.21 U/mL，比优化前提高了18%，表明该菌株有一定的应用潜力。  关键词黑曲霉；菊粉酶；酶活力；

2、发酵条件；优化  传统果糖的生产一般是由淀粉通过葡萄糖的异构化取得，该法工艺复杂、成本较高、果糖含量低。因此，人们一直在寻求一种廉价的新糖源和生产果糖的方法。其中菊粉酶（Inulinase或Inulase）主要催化水解菊粉中的-2，1呋喃果糖苷键，由于能在温和条件下水解菊粉产生果糖（70%以上）和少量葡萄糖，只需一步酶解过程，工艺简单，生产成本低，可直接制备超高果葡糖浆，已成为果糖化生产的主要酶制剂，为低聚果糖的生产提供了一个很好的解决办法。但来源于植物的菊粉酶底物专一性较强，仅作用于菊粉；由微生物产生的菊粉酶大都能水解含有-2，1呋喃果糖苷键的多种糖类，如菊糖、蔗糖和棉子糖等1。其

3、中霉菌具有所产菊粉酶的最适温度较高、热稳定性好、适宜偏酸性的环境等特点而倍受关注。由潍坊学院生命学院实验室所保存的黑曲霉（Aspergillus niger）A24诱变菌株是从菊芋根际周围土壤中筛选出的一株产菊粉酶、又经过多轮紫外线诱变获得的菊粉酶产量较高的菌株。该试验在此基础上，对其发酵条件进一步优化，以期获得更高的产菊粉酶活力，为进一步研究菊粉酶的生产以及生产应用提供理论基础。  1材料与方法  1.1供试材料  黑曲霉（Aspergillus niger）A24诱变菌株，由潍坊学院生命科学学院实验室保存。菊芋（Helianthus

4、0;tuberosus L.）采自潍坊市郊区。菊芋汁参照前人研究方法进行制备2。  1.2发酵培养条件及发酵液的制备  取0.1 mL黑曲霉孢子悬液，接入50 mL的Y J（初始培养条件：菊粉2%，酵母膏0.3%，（NH4）2HPO4 1%，初始pH值6.0）发酵培养液中（250 mL三角瓶），在不同条件下进行发酵培养。  1.2.1不同碳源对产菊粉酶的影响。选择碳源分别为2%的菊芋汁、菊粉、葡萄糖、果糖、庶糖和乳糖，将黑曲霉A24诱变菌种接入到不同碳源的培养基中，调节各培养基初始pH值为6.0，在30&

5、#160;、120 r/min的条件下培养72 h，将各处理的发酵液经8 000 r/min离心10 min后，收集上清液，分别测定酶活力。并选择出最优碳源，以1%、2%、3%、4%的添加量研究不同浓度的该最优碳源对产菊粉酶的活力影响。  1.2.2不同氮源对产菊粉酶的影响。用3%的菊芋汁作碳源，以不同种类的复合氮源（有机和无机）制备的培养基发酵培养3 d后，测定其发酵液中菊粉酶活力，确定最佳有机氮源；在确定最佳有机氮源为牛肉膏、无机氮源为（NH4）2HPO4的基础上，进行有机氮源和无机氮源最佳配比试验。以牛肉膏和（NH4）

6、2HPO4做复合氮源发酵试验，取质量浓度分别为1%、2%、3%的牛肉膏和质量浓度分别为0.3%、0.5%、0.8%的（NH4）2HPO4进行复合。调培养基初始pH值为6.0，于30 ，发酵培养3 d，将各处理的发酵液经8 000 r/min离心10 min后，收集上清液，分别测定酶活力。  1.2.3培养基初始pH值对产菊粉酶的影响。设培养基初始pH值分别为3、4、5、6、7，以3%菊芋汁作碳源，以牛肉膏、（CNH4）2HPO4为复合氮源，于30 条件进行发酵培养3 d。将各处理的发酵液经8 000

7、60;r/min离心10 min后，收集上清液，分别测定酶活力。  1.2.4发酵温度对产菊粉酶的影响。以3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和0.5%（NH4）2HPO4为复合氮源、初始pH值6.0的发酵培养基，对黑曲霉A24诱变菌株分别在24、26、28、30、32 下进行发酵培养72 h，将各处理的发酵液经8 000 r/min离心10 min后，收集上清液，分别测定酶活力。  1.2.5发酵时间对产菊粉酶的影响。以3%菊芋汁为碳源、2%牛肉膏和0.5%（NH4）2HPO4为复合氮源，培养基初始pH值为6.0，30&

8、#160;下分别发酵24、48、72、96、120 h，每隔24 h取样。将各处理的发酵液经8 000 r/min离心10 min后，收集上清液，测定酶活力。  1.3发酵液中还原糖含量及菊粉酶的活力测定  采用3，5-二硝基水杨酸法3测定发酵液中还原糖的含量，在540 nm波长处测定吸光度值，根据葡萄糖的标准曲线，求得还原糖的含量；酶活力定义为在规定反应条件下每分钟转化底物生成1 mol还原糖所需的酶量为一个酶活单位（U/mL），按照Pessoni等人报道的研究方法测定菊粉酶活力4。  2结果

9、与分析  2.1不同碳源对产菊粉酶的影响  试验结果表明，以2%菊芋汁为碳源时酶活力最高，为12.33 U/mL；菊粉次之，为10.18 U/mL；葡萄糖、果糖为碳源时酶活力较低，均在2.5 U/mL以下。进一步分析不同浓度菊芋汁为碳源对产菊粉酶的影响，发现菊芋汁浓度为3%时，菊粉酶活力最高，为11.18 U/mL。  2.2不同氮源对产菊粉酶的影响  研究结果表明，复杂有机氮源比简单无机氮源有利于菊粉酶的产生，且最适有机氮源为牛肉膏，无机氮源为（NH4）2HPO4， 2种氮源所得到的菊粉酶活力分别为14

10、.14 、8.64 U/mL。由表1可以看出，复合氮源比单纯有机或无机氮源更有利于菊粉酶的产生，且当牛肉膏和（NH4）2HPO4的质量浓度分别为2%和0.5%时，菊粉酶活力最高，为19.98 U/mL。  1         2.3培养基初始pH值对产菊粉酶的影响  检测不同初始pH值对黑曲霉A24诱变菌株产菊粉酶的影响，结果如图1所示。可以看出，在初始pH值为36的范围内，随着pH值升高，菊粉酶酶活增强，pH值为6.0时产菊粉酶酶活最高，达到28.83 

11、U/mL。此后随着pH值升高，菊粉酶酶活明显下降。  2.4发酵温度对产菊粉酶的影响  试验结果表明，在2430 范围内，随着培养温度升高菊粉酶酶活增强，30 时产菊粉酶酶活最高，为32.51 U/mL。此后，随着温度升高，菊粉酶酶活明显下降，说明菊粉酶对温度比较敏感。因此，30 是黑曲霉A24诱变菌株产菊粉酶的最适温度（图2）。  2.5发酵时间对产菊粉酶的影响  由图3可以看出，随发酵时间的增加，黑曲霉A24诱变菌株产菊粉酶活力增强，在培养72 h后产菊粉酶酶活最高，为35.21 U/mL。

12、此后，随着发酵时间延长，菊粉酶酶活有下降趋势。  3结论与讨论  近年来，利用微生物产菊粉酶已有不少报道，包括真菌中的黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium sp.）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）以及细菌中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和假单孢菌（Pseudononas sp.）等5，其中黑曲霉由于特性稳定、易于培养而受到格外关注，并被普遍用来发酵生产菊粉酶。王静等6对一株黑曲霉JNSP5-06产菊粉酶的发酵条件进行了优化，得到最

13、佳优化条件：2%菊粉，2%酵母膏和0.5%NH2PO4，初始pH值6.5，30 培养96 h，优化后的最佳产菊粉酶活力达到29.73 U/mL；唐艳斌等7曾报道黑曲霉菌株SYS-1在菊粉2%、（NH4）2HPO4 2%、初始pH值6.0、30 培养96 h的发酵条件下产菊粉酶酶活最高，达到59.25 U/mL。而该试验确定的黑曲霉A24菌株产菊粉酶的最适发酵条件为：菊芋汁3%、牛肉膏2%、（NH4）2HPO4 0.5%、初始pH值6.0，30 培养72 h。在此条件下，黑曲霉A24诱变菌株发酵液

14、中菊粉酶活力最高，为35.21 U/mL。试验所确定的最适氮源与王静等6的结果不一致，培养时间比上述报道缩短了24 h，可能是因为不同菌株间存在一定差异所致，但该试验结果明显能减少成本，在生产中的应用潜力更大。  4  1 祝彦忠，贾英民，桑亚新，等.黑曲霉U-2菊粉酶发酵条件的研究J.食品学报，2006，6（4）：57-60.  2 王东方，陈冠军.产菊粉酶丝状真菌菌株的筛选及产酶发酵条件的研究J.潍坊学院学报，2004，4（6）：40-42.  3 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法与技术M.2版.北京：高等出版社，1997：7-13.  4 冷云伟，赵玉斌.黑曲霉产菊粉酶的条件及其酶学性质的研究J.食品与机械，