响应面法优化细菌纤维素发酵合成工艺

1、响应面法优化细菌纤维素发酵合成工艺         10-08-26 09:14:00     编辑：studa20               作者：袁帅，胡承，曹海鹏，唐德芳，孙苗苗 【摘要】  目的对细菌纤维素高产菌株葡糖醋杆菌G-29进行发酵优化，以提高其细菌纤维素合成能力。方法采用基于非完全平衡块原

2、理的Plackett-Burman(PB) 试验设计法，筛选出了3个主要影响因子：混合碳源（葡萄糖蔗糖=12），MgSO4，乙醇，然后采用Box-Behnten中心，组合试验设计和响应面分析方法（RSM）确定其最佳浓度分别为混合碳原52.3g/L，MgSO40.159 8 g/L，乙醇32.5 ml/L。用扫描电镜观察了细菌纤维素的形态结构，并通过X射线衍射分析其在干态下和湿态下的最佳结构。结果在优化培养基条件下，菌株G-29发酵生产细菌纤维素的产量为11.83 g/L，是优化前产量（6.20 g/L）的1.9倍。结论PB试验和RSM相结合的试验方法，用于优化G-29发酵培养基，不仅科学合理而

3、且准确有效。 【关键词】  葡糖醋杆菌属 细菌纤维素 Plackett-Burman设计 响应面分析Abstract：ObjectiveIn this manuscript,the optimal conditions for cellulose production by gluconacetoba-ater G-29 were determined in order to improve the yield of bacterial cellulose.MethodsPlackett-Burman Design was used to evaluate three statist

4、ically significant parameters including mixed carbon sources(Glucose:sucrose=1:2),MgSO4,ethanol.The optimal levels of three variables were defined by Box-Behnken design and response surface method(RSM):mixed carbon sources:52.3 g/L,MgSO4 0.159 g/L,ethanol 32.5 g/L,ethanol 32.5 g/L comparison.The mor

5、phology of bacterial cellulose(BC) produced was observed by scanning electron microscope(SEM).The crystal structure of BC in dried and wet state was studied by X-ray diffractometry(XRD).ResultsThe results indicated that the BC yield under the optimal fermentation medium was 11.83 g/L,which was as 1.

6、9 times as that under the original fermentation medium.ConclusionThe method of PB design combined with RSM used for optimization of G-29 fermentation medium is scientific and accurate.Key words： Gluconacetobacter;   Bacterial cellulose;   Plackett-Burman design;   Respo

7、nse surface method    细菌纤维素(Bacterial cellulose，简称 BC)是由部分细菌产生的一类高分子化合物，在化学组成和结构上同植物纤维相同，都是由D-葡萄糖以-1,4糖苷键连接形成直链多糖，再经聚合而成。与植物纤维不同的是细菌纤维素是以单一纤维形式存在，纯度极高，不掺杂如植物纤维中的半纤维素或木质素等其它多糖类1，因此其具有抗拉强度高、 杨氏模量高、良好的生物适应性以及优良的持水性和通透性等特点2。除了可用作膳食纤维和食品成型剂，还可用于生产纱布、绷带、人造皮肤等生物医学用品，有利于皮肤组织生长和限制感染。 

8、0;  自1987年以来，已有很多关于细菌纤维素膜用于烧伤、烫伤、皮肤移植等治疗的报道，目前已发展出纱布、绷带和“创可贴”等各种伤科敷料商品。它具有在伤口中维持湿的环境，防止体液流出，保持高机械强度，对液、气具有良好通透性，与皮肤相容性好、无毒、不发热，良好的防菌和隔离性等众多特点，均优于当今其它人造皮肤和伤科敷料。早在20世纪80年代初，巴西的Biofill公司就开始了用细菌纤维素膜制造伤科敷料的研究，成功开发出人造动脉，人造血管与人造皮肤等医疗用品3，并已成功地应用于处理皮肤移植和慢性皮肤溃疡。这种材料可有效缓解疼痛，防止细菌感染，有利于皮肤组织生长，促进伤口愈合，对水分及电解物

9、有良好的通透性，与传统的材料相比，这种材料成本低，处理时间短，更有利于健康皮肤的生长4。除此之外，细菌纤维素还可作为缓释药物的载体，软骨组织工程的支架材料5等。    能产生细菌纤维素的细菌种类较多，常见的有醋酸菌属、土壤杆菌属、假单胞杆菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、气杆菌属、固氮菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等9个属中的某些种。其中醋酸菌属中的木醋杆菌（Acetobacter xylinum）是最早被发现同时也是研究较为透彻的纤维素产生菌，现已作为研究纤维素生物合成过程和机制的模式菌株。根据伯杰氏系统细菌学手册第9版，木醋杆菌已被划分到葡糖醋杆菌属（Gluconac

10、etobacter）中，改为木葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter xylinum）。    近几年关于细菌纤维素生产合成的研究仍多以木葡糖醋杆菌或其变种做为试验菌种，为此，本实验室分离筛选出一株细菌纤维素高产菌G-29，并经16S rDNA测序鉴定该菌为葡糖醋杆菌属中一个新的菌种。    本实验以G-29为试验菌种，在前期试验的基础上，利用响应面分析法6，对其发酵培养基的诸多营养因素进行考察和评价，并确定了细菌纤维素合成的重要影响因子的最优水平，取得了较好的发酵效果，为进一步提高其产量和后续的放大培养奠定基础。1 

11、; 材料1.1  菌种来源葡糖醋杆菌（Gluconacetobacter sp.）G-29，由本实验室课题组2008年从成都市所采集的水果样品中分离获得，保存于四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室。1.2  培养基斜面培养基：葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，Na2HPO4 1 g/L，MgSO4 0.15 g/L，乙醇20 ml/L，琼脂18 g/L，pH6.0；种子培养基：葡萄糖50 g/L，酵母膏15 g/L，Na2HPO4 3 g/L，MgSO4 0.2 g/L，乙醇40 ml/L，pH 6.0；用于响应面分析的基础发酵培养基：葡萄糖30 g/L，酵母膏5

12、 g/L，Na2HPO4 1 g/L，MgSO4 0.15 g/L，乙醇20 ml/L，pH 6.5；优化后的发酵培养基：混合碳源52.3 g/L（葡萄糖:蔗糖1:2），酵母膏8 g/L，FeSO4 0.2 g/L，MgSO4 0.159 g/L，Na2HPO4 2 g/L，柠檬酸1 g/L，乙醇32.5 ml/L，pH 6.5。1.3  培养条件挑取一环活化的斜面菌种至装有100 ml种子培养基的250 ml三角瓶中，30，110 r/min振荡培养24 h，然后按照8的接种量，将种子培养基接入装有100 ml发酵培养基的250 ml三角瓶中，8层纱布封口，30静置培养7 d。2&

13、#160; 方法2.1  细菌纤维素的产量测定从培养基中取出纤维素膜，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，100煮沸20 min，去除液膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.2，80干燥至恒重。纤维素含量用g/L表示。2.2  发酵培养基优化方法Plackett-Burman设计、Box-Behnken中心试验设计及响应面分析。3  结果3.1  Plackett-Burman设计法筛选重要因素 根据笔者前期实验，本研究选取混合碳源（葡萄糖蔗糖=12

14、），酵母膏，FeSO4，Na2HPO4，MgSO4，柠檬酸、乙醇作为PB试验的7个因素，每个因素取两个水平，因素水平及编码见表1，数据分析及模型建立由Design Expert软件完成。表1  Plackett-Burman(PB)实验设计因素水平及编码（略）        根据Plackett-Burman实验设计得到的7因素12实验组合，依次进行培养基的配制、接种、发酵试验(每组3个平行，取平均值)，以细菌纤维素干重为响应值Y。结果如表2所示。    由表3可以看出，对G-29发酵合成能力影响最大的因素是混合碳源（葡萄糖/蔗糖=12），其次是乙醇和MgSO4。这3个因素对细菌纤维素产量影响显著，置信度高于90%，可作为进一步优化的因素。而其它4个因素对发酵产量的影响未达到显著水平，在下一步的研究中不予考虑。表2   Plackett-Burman(PB)试验结果（略）表3  Plackett-Burman试验主效应分析（略）3.2