绣球菌子实体多糖地分离与纯化

1、绣球菌子实体多糖分离与纯化一、材料菌株：绣球菌子实体二、方法与步骤1、预处理粉碎：取200体绣球菌子实体洗净、阴凉处晾干，机械粉碎。2、提取粗多糖取200g绣球菌子实体粉末与 2000ml水中浸泡24h。将浸泡后的液体置电磁炉上煮往锅内增添水，使加水量大约为6000ml。煮一定时间后，将液体滤出。于旋转蒸发仪中浓缩至适当体积 ，加入2倍体积的95%的乙醇，醇沉24h,用离心 机3000 r/min 的转速离心10min,弃去上清液，所得沉淀放入培养皿中于 5060 C电热真空 干燥箱中烘干，得粗多糖并分别称取粗多糖质量。3、葡聚糖含量测定试剂：(1 )浓硫酸：分析纯，95.5%(2 ) 80%

2、苯酚：80g苯酚(分析纯重蒸馏试剂)溶于 20ml水，冰箱中避光长期储存。(3) 6%苯酚：以80%苯酚配制。(现配现用)(4 )分析纯葡萄糖。操作(1 )制作标准曲线：准确称取葡萄20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至 2.0ml，然后加入 6%苯酚1.0ml 及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，沸水中加热20分钟，取出冷却至室温。于490nm 测光密度值。以2.0ml水按同样显色操作为空白，质量浓度为横坐标，A为纵坐标，得标准曲线。回归方程：A=0.0113C+0.015( r=0.9987 )线性范围

3、在 10-70 微克(2)样品含量测定：精密称取粗多糖10mg，置100ml量瓶中，蒸馏水定容，质量浓度为 0.1mg/ml 。吸取样 品溶液1ml ( 5份)，分别置于20ml试管中，加入蒸馏水使其最终体积为 2ml，各管加入 6%苯酚1ml，混匀，迅速加入浓硫酸 5ml，摇匀，静置5min后，放入沸水中加热 20min , 取出后冷却置室温，在 490nm处测定吸光度。以标准曲线计算多糖含量。4、脱蛋白(Sevag法)样品溶液：Sevag试剂=5:1Sevag试剂的配制三氯甲烷：正丁醇=5:1充分振荡1 2h，静止，离心，取上清重复，至无游离蛋白为止。5、透析剪取适当长度的截留分子量800

4、0的透析袋，用透析袋夹子夹住一端，灌入除蛋白后多糖溶液，再用透析袋夹子夹住另一端，放入一只大烧杯中，用一导管将水通入烧杯底部，逆向对流水透析 48h，以除去小分子的无机盐、低聚糖等杂质，即得到粗多糖。6、多糖的分级纯化6.1 DEAE 52色谱柱层析树脂预处理称取DEAE 一 52纤维素树脂50g，在25 C蒸馏水中浸泡24h，使其充分溶胀。再用双蒸 水反复洗涤，去除纤维素单体或碎片的悬浮颗粒。抽干，用0.5mol/L NaoH 溶液500mL浸泡30min，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性；再用0.5mol/L 盐酸溶液 500mL浸泡30min，适当搅拌后，用双蒸水洗至中性；最后用0.5mol

5、/L NaOH 溶液500mL浸泡30min，使之转为OH-型,适当搅拌后，用双蒸水洗至中性。抽干，备用。装柱与平衡将预处理好的DEAE 52纤维素树脂加适量双蒸水，搅拌，用超声脱气后，沿玻璃棒 小心缓慢一次灌到 2.0*60cm 层析柱，同时轻轻敲击柱壁，使填料沉降均匀、致密，柱高 45cm，然后静态沉降24h，使层析柱达到平衡状态。上样洗脱将脱蛋白后的粗多糖全部溶于水，经DEAE(OH)型纤维素柱(2 6cm XIOOcm)层析，先用蒸馏水洗脱，自动收集器收集，每管15min,用苯酚-硫酸法逐管检测多糖含量，一直洗至多糖为 阴性反应然后用01mol L-1的NaCI作梯度洗脱，每管6min,用苯酚-硫酸法逐管检测多糖 含量，一直洗至多糖为阴性反应，合并主峰部分，乙醇沉淀多糖，冷冻干燥。6.2 SephadexG 100 凝胶柱层析自然沉降法装 SephadexG 100凝胶色谱柱(2 X60cm)，脱气后用 ddH 2O(1000ml) 平衡层析柱，流速为 3d/min .取6.1所得的葡聚糖100mg溶于5mLddH 2O中，上样于 Sephadex G 100凝胶色谱柱(2 X60cm)，以ddH 2O为流动相，流速为每分钟 3滴，用 自动部分收集器以每管 5ml收集洗脱液，将收集到的样品溶液用