实验四-大肠杆菌发酵培养基的优化.

1、大肠杆菌发酵培养基的优化大肠杆菌发酵培养基的优化实验目的v1.掌握发酵培养基的配制方法v2.熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法v3.学习比浊法测定发酵液菌浓的方法实验原理v1.确定培养基的基本组成v2.确定所用原材料的种类v3.确定所用原材料的浓度配比关系一、培养基的配制方法v1.单因素法v2.正交试验法v3.均匀试验设计二、培养基优化方法（原材料种类和浓度配比优化）v1.概念利用已经设计好的表格-正交表-来安排试验并进行数据分析的一种方法。它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。三、正交试验法

2、v2.基本工具正交表v记号：Ln（tm）L：正交表的符号n：表的行数（可安排试验的次数）t：表中的字码数（水平数）m：表的列数（最多可安排因素个数）vL8(27) L9(34) L16(45)v3.正交表的特点试验点分布均匀、整齐可比任何一列中各字码（水平）都出现，且出现的次数相等任何两列中各横行组成的数字对，包含着所有可能的数字对，且各种数字对出现的次数相等v4.实验的基本步骤v（1）明确任务 确定指标v（2）制定因素水平表1）确定因素（A、B、C）2）选择因素的变化范围3）确定因素水平数4）制定因素水平表因素水平A淀粉/%B黄豆饼粉/%C蛋白胨/%1530.22750.43970.6v（3

3、）设计试验方案1）选择正交表2）表头设计（不混杂）3）列出试验方案4）进行实验 因素因素实验号实验号ABC结果结果123456789111222333123123123123312231 因素因素实验号实验号ABC结果结果123456789111222333123123123123312231X1X2X3X4X5X6X7X8X9（4）分析试验结果）分析试验结果 1）方法一：直接比较v直观分析法是通过对每一因素的平均极差来分析问题。v所谓极差就是平均效果中最大值和最小值的差。有了极差，就可以找到影响指标的主要因素，并可以帮助我们找到最佳因素水平组合。 v极差的大小反应在所选择的因素水平范围内该因

4、素对测定结果影响的程度。极差大的因素在所选择的因素水平范围内对测定结果的影响最大，在测试过程中必须严格控制。2）方法二 直观分析 因素因素实验号实验号ABC结果结果123456789111222333123123123123312231X1X2X3X4X5X6X7X8X9k1k2k3 (X1+X2+X3)/3 (X4+X5+X6)/3 (X7+X8+X9)/3( X 1 + X 4 + X 7 ) / 3 ( X 2 + X 5 + X 8 ) / 3 (X3+X6+X9)/3(X1+X5+X9)/3(X2+X6+X7)/3 (X3+X4+X8)/3极差极差K最大最大- K最小最小K最大最大-

5、 K最小最小K最大最大- K最小最小A： 首先计算各因素每个水平的平均效果和极差。vB ：然后对计算结果进行分析，分析各因素的主次和影响趋势，找到最优试验方案。 比较RA 、RB、RC值，R值越大的因素，影响越大，控制要越严格，R值越小的因素，影响越小。 对每一个因素，选择K值最大的水平为最佳条件。如对于因素A 淀粉，若k2K1k3 ，即k2最大，根据因素水平表中的设计，其水平为7%。表明7%为最佳的淀粉浓度。对于因素B ，k2最大，对于因素C ，k3最大。 则实验的最佳实验条件为： A2 B2 C3，即最佳实验条件为：淀粉为7%，黄豆饼粉5%，蛋白胨0.6% 若某一因素若某一因素k3或者或者

6、k1 最大，则说明所选择的该因素的水最大，则说明所选择的该因素的水平范围不合适，平范围不合适， 如：对于因素如：对于因素C，k3最大，说明因素水平表最大，说明因素水平表中所设计的最高水平中所设计的最高水平0.6% 不一定为最佳。如果该因素的不一定为最佳。如果该因素的R值值较大，影响较显著，则必须进行重复实验或对照实验。较大，影响较显著，则必须进行重复实验或对照实验。 其中对照实验条件应为：其中对照实验条件应为： 试验试验1： A2 B2 C3 试验试验2： A2 B2 C4 C4应大于应大于C3 对照两者的结果，若试验对照两者的结果，若试验1结果值大于试验结果值大于试验2，则试验，则试验1条件

7、即为最优化条件。若试验条件即为最优化条件。若试验2结果值大于试验结果值大于试验1，则应再改，则应再改变因素变因素C的水平，继续做对照实验，直至达最佳结果。的水平，继续做对照实验，直至达最佳结果。v细菌培养物在生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。细菌悬液的混浊度和透光度成反比、与光密度成正比，透光度或光密度可借助光电比浊计精确测出，因此可用光电比浊计测定细胞悬液的光密度（OD值），表示该菌在特定实验条件下的细菌相对数目，进而反映出其相对生长量。 四、比浊法测定发酵液菌浓v本实验以菌体生物量为指标，用四因素三水平的正交试验确定大肠杆菌的最优培养基。实验步骤一、培养基的配制一

8、、培养基的配制表1 正交试验表设计因素水平A酵母浸膏/%B蛋白胨/%C氯化钠/%D pH10.20.50.5620.511730.81.51.581.将酵母浸膏、蛋白胨、氯化钠作为培养基的主要影响因素，每一因素设定3个水平，进行三因素三水平的正交试验，试验设计如表1因素A酵母浸膏/%B蛋白胨/%C氯化钠/%D pHOD值实验11(0.2)1(0.5)1(0.2)1(6)实验21(0.2)2(1)2(0.5)2(7)实验31(0.2)3(1.5)3(0.8)3(8)实验42(0.5)1(0.5)2(0.5)3(8)实验52(0.5)2(1)3(0.8)1(6)实验62(0.5)3(1.5)1(0

9、.2)2(7)实验73(0.8)1(0.5)3(0.8)2(7)实验83(0.8)2(1)1(0.2)3(8)实验93(0.8)3(1.5)2(0.5)1(6)表2 正交表实验方案2.按表2配制9组培养基入100ml锥形瓶中，每瓶25ml，（可四小组分工合作）v锥形瓶培养基：标记，加棉塞、报纸包扎。v1ml移液管2支v121，灭菌20min二、灭菌v将菌种（教师预先培养好）摇匀后用无菌移液管吸取0.5ml悬液，接到每一组培养基中（接种量要完全一样）三、接种v将三角瓶置于恒温摇床中，37，120rpm培养12h四、发酵五、比浊法测定各发酵液OD值v取下摇瓶，以空白培养基为对照，于600nm处测定各摇瓶中发酵液的OD值，填入表中。注意：如果OD值过大，需将发酵液作一定稀释后再测定。实验结果v填写正交实验表，分析数据，确定最优培养基配方因素A酵母浸膏/%B蛋白胨/%C氯化钠/%D pHOD值实验11(0.2)1(0.5)1(0.2)1(6)实验21(0.2)2(1)2(0.5)2(7)实验31(0.2)3(1.5)3(0.8)3(8)实验42(0.5)1(0.5)2(0