采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体

1、采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体 作者：胡海，冉宇靓，陈立钊，遇 珑，孙立新，杨治华【摘要】 目的 研制抑制肺癌细胞功能性单抗，为治疗肺癌提供靶向治疗剂，并为分离获得肺癌相关的分子靶标打下基础。方法 从新鲜人肺癌组织分离肿瘤细胞免疫Bal b/c小鼠，免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后接种于甲基纤维素，制备大容量功能性抗体库。采用活细胞荧光、ELISA、免疫组化、肿瘤增殖、侵袭、黏附、动物体内治疗实验等方法筛选鉴定抑制肿瘤细胞的功能性单抗。结果 本次融合共获得了1573株杂交瘤克隆，在能与肺癌细胞膜反应的314株克隆中，154株与正常肺组织不反应或低反应。功能性筛选发现41株单抗显著地

2、抑制肺癌细胞增殖，24株能抑制肺癌细胞对Matrigel的侵袭，15株能抑制肺癌细胞与Collagen I的黏附，进一步实验验证了2株单抗能在体内抑制肺癌移植瘤的生长。结论 采用大容量功能性抗体库技术成功获得了多株具有抑制肺癌细胞恶性生物学行为的功能性单抗，其中2株可能具有靶向治疗肺癌的应用潜力。 【关键词】 肺癌；抗体库；功能性单抗；靶向治疗 肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一，在欧美等发达国家,其发病率在各种常见肿瘤中居首位1。我国亦是肺癌的高发国家，每年死于肺癌的人数超过40万，且有明显的逐年递增趋势。尽管近年来肺癌的治疗手段有了较大提高，但是患者的5年生存率仍低于15%2。近年来美国FDA批

3、准Herceptin和Avastin等单抗靶向药物作为一线抗癌药方案用于乳腺癌和转移性结肠癌的治疗，已在临床上取得了显著的疗效，为肿瘤治疗提供了一种全新的策略。本研究采用本室建立的高通量研制筛选功能性单抗的技术方法，获得了多株能显著抑制肺癌细胞增殖的功能性单抗，为治疗肺癌提供了有潜在应用价值的抗体靶向治疗剂。 1 材料和方法 1.1 材料 小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0细胞，肺癌细胞系GLC82（肺腺癌）、NCIH520（肺鳞癌）为本室保藏。6周龄Bal b/c小鼠购自中国药品生物制品检定所。 M199、M1640、DMEM、IMEM培养基均购自Gibco BRL公司； 胎牛血清（Fetal bo

4、vine serum, FBS）系Hyclone 生产；biotin马抗小鼠IgG、IgM、HRP标记羊抗小鼠IgG、IgM 均购自Vector公司；tublin兔多抗为Santa Cruz 生产；FITC标记的羊抗兔 购自Vector 公司；Cy3标记avidin 购自Jackson公司; PVDF膜由Millipore生产；DAPI购自Sigma公司；单抗亚类检测试剂盒均由SouthernBiotech公司生产；SP法免疫组化试剂盒购自福州迈新公司；Westernblot试剂购自普利莱公司。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 SP2/0细胞采用含10%FBS的DMEM培养基培养；肺癌细胞

5、系GLC82和NCIH520采用含10%FBS的1640培养基培养。 1.2.2 动物免疫 采用临床分离的肺癌新鲜组织标本(鳞癌、腺癌各一个) 分离单个细胞，以11065106细胞/（只次）的剂量免疫5只Bal b/c小鼠，连续免疫12个月。 1.2.3 免疫荧光 活细胞免疫荧光：将9000/孔肿瘤细胞接种于96孔培养板，37、5%CO2温箱培养2天。细胞约70%汇合后，用PBS洗涤每孔中的细胞后加入一定浓度的一抗，室温孵育1 h，含1%BSA的PBS洗涤5次，每次5 min；加入60l含0.5g/ml biotin标记二抗或60l含0.5g/ml FITC标记抗体室温孵育30min，1%BS

6、A的PBS洗涤5次，每次5min；加入 60l 11000稀释的Cy3Avidin，室温孵育30min后，PBS洗涤5次，每次5min；最后用含10g/ml DAPI的50%甘油50l封闭。对于固定细胞间接免疫荧光，在加入一抗前细胞经4%多聚甲醛固定10min，0.2% Triton X100通透5min，后续试验操作同活细胞免疫荧光。上述实验中，每种单克隆抗体重复做3孔。 1.2.4 细胞融合 待免疫小鼠血清滴度达到160 000以上时，取1108 免疫小鼠脾细胞与2107处对数生长期的杂交瘤细胞系SP2/0融合。融合后接种30个于铺有甲基纤维素的直径35mm的细胞培养皿内。置湿盒中于5%C

7、O2 、37温箱中培养。 1.2.5 免疫组织化学 免疫组化采用SP法。杂交瘤上清采用15和125两个稀释度。操作程序严格按照试剂盒说明书操作，镜下阳性细胞10%定为阴性。 1.2.6 ELISA 采用SouthernBiotech的单抗亚类ELISA检测试剂盒测定筛选获得的单抗亚型，操作严格按照试剂盒说明书进行。 1.2.7 肺癌细胞增殖测定 采用MTT法检测免疫小鼠血清对人肝癌内皮细胞增殖的影响。并同时采用RTCESTM(Real Time Cell Electronic Sensing System ) 细胞增殖测定仪实时监测单抗对人肝癌内皮增殖的作用3，详细按厂家说明进行操作。在细胞接

8、种后816 h，加入12稀释的杂交瘤上清或SP2/0对照上清（阴性对照），继续监测细胞生长情况。细胞增殖进入平台期前终止实验，根据监测数据计算杂交瘤上清对细胞生长抑制的影响，上述实验重复了3次。 1.2.8 抗体的侵袭抑制试验 100g/cm3 的BD Matrigel包被Corning Costar transwells的多孔的聚碳酸酯膜，37、5%CO2温箱中包被30min后，每孔4104人肺癌细胞系GLC82接种于transwells中。接种细胞后在transwells中加入15稀释的杂交瘤上清或SP2/0对照上清。在37 、5%CO2 培养24h后，镜检观察肿瘤细胞穿过多孔的聚碳酸酯膜

9、后，刮除多孔的聚碳酸酯膜上层未穿过的肿瘤细胞。然后用11的甲醇/丙酮溶液固定膜上细胞20min。侵袭的细胞用DAPI染核，在荧光显微镜下计数侵袭细胞数。每张膜观察4个不同的100倍视野，并经SPSS10.0进行统计分析，上述实验重复3次。 1.2.9 抗体的黏附抑制试验 96孔培养板经100g/cm3的Collagen I包被，37、5%CO2温箱中包被30min后，每孔4104人肺癌细胞系GLC82接种于96孔培养板，接种细胞后在6孔培养板中加入15稀释的杂交瘤上清或SP2/0对照上清。在37、5%CO2 培养1h后，每孔加入250l无血清1640培养基振荡洗涤，每次5min，共计洗涤3次，

10、以洗去未黏附的肿瘤细胞。随后，使用MTT法测定黏附细胞数，经SPSS10.0进行统计分析，上述实验重复了3次。 1.2.10 体内抑瘤试验 将BALB/C裸鼠分为抗体治疗组，正常鼠IgG为对照组，每组6只。将人肺癌细胞系GLC82按100万细胞/只小鼠的比例接种所有各组的BALB/C裸鼠皮下。接种后5天（已能扪及肿瘤时）开始腹腔注射纯化抗体进行治疗。注射剂量200g/(次只)，治疗第一周，每天1次，连续5天，以后每周2次。20天时处死小鼠，测瘤重，计算肿瘤生长抑制率。 2 结果 2.1 小鼠免疫血清的测定 从食管癌新鲜组织标本中分离单个细胞，免疫Balb/c小鼠5只，分别于免疫后3、5、9、1

11、1、13个月从小鼠尾静脉取血分离血清。免疫后9个月时固定细胞免疫荧光检测小鼠血清的抗体滴度为120 000160 000。其中4号小鼠血清滴度最高，为160 000，见图1a。此后两次采血检测免疫血清的抗体滴度不再显著升高，准备融合。 用MTT 法检测这只小鼠免疫第9个月的免疫血清对人肺癌细胞增殖的抑制作用，结果如图1b。随着血清浓度的增加，免疫血清对肺癌细胞增殖的抑制作用增加，并呈现明显的量效关系。150稀释的免疫鼠血清对人肺癌细胞增殖的抑制达43%，而150稀释的正常鼠血清对人肺癌细胞增殖没有明显的抑制作用，表明该免疫血清中含有能显著抑制人肺癌增殖的功能性抗体。 2.2 细胞融合及阳性克隆

12、的筛选 待免疫小鼠血清中的抗体滴度不再升高时，取滴度最高的4号小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，融合细胞接种40个含有HAT选择培养液的甲基纤维素培养基的平皿中。培养812天后，从培养皿中挑取孤立的较大的细胞集落，共计挑取2652个单集落细胞克隆，接种30个96孔培养板，最终从中获得了1573个单克隆。以tublin作为细胞膜是否被通透的对照，采用活细胞免疫荧光法检测筛选了1573个杂交瘤克隆上清与2种肺癌细胞系GLC82和NCIH520的反应。如果对照tublin的免疫荧光阳性则说明细胞膜已经被通透，抗tublin的抗体分子进入了细胞；如果tublin为阴性，说明细胞没有被通透，抗体无法进

13、入细胞内，见图2。因此，这时的阳性反应表明该抗体是与细胞膜上的蛋白结合，即此抗体的抗原是膜蛋白，此抗体也可能作为抗肺癌靶向治疗的抗体。最终我们获得了314个与2种肺癌细胞膜均呈阳性反应的克隆。采用免疫组织化学法检测了上面314个阳性克隆的杂交瘤上清与正常肺组织的反应性，结果获得了154个与正常肺组织不反应或低反应的单抗克隆。 2.3 抗肺癌单抗抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和黏附 采用肿瘤细胞增殖测定、DB Matrigel侵袭测定及Collagen I黏附实验对经过活细胞免疫荧光及免疫组化筛选获得的154株克隆单抗进行功能性的筛选，鉴定这些单克隆抗体对GLC82细胞增殖、侵袭、黏附的影响。有41株

14、单抗能明显抑制肺癌细胞GLC82的增殖，其中抑制率最高的单抗9C10达到55%3%；24株单抗能抑制GLC82对Matrigel的侵袭，其中抑制率最高的单抗4E2达到68%8%；15株单抗抑制肺癌细胞GLC82对Collagen I的黏附，其中抑制率最高的单抗14A12达到50%11%。其中154株单抗中有4株单抗（9D12、5A3、6C4、15E11）对肺癌细胞的增殖、侵袭和黏附均有一定的抑制。图3显示了部分单抗对肺癌细胞增殖、侵袭及黏附的影响。 2.4 功能性单抗的亚类鉴定 采用单抗亚类检测试剂盒检测了其中25株具有功能的单抗的亚类，结果发现其中有5株IgG1、4株IgG2a、1株IgG2

15、b、8株 IgM。还有2株为混合克隆。 2.5 抗肺癌单抗显著抑制肺癌移植瘤生长 选择对肺癌细胞增殖和侵袭最强的单抗各1株，进行了体内抑瘤试验。在单抗治疗起始后20天（接种肿瘤后25天）处死动物，获各组肿瘤称瘤重，计算各组的平均瘤重。正常鼠IgG治疗组平均瘤重为0.8430.320，9C10治疗组的平均瘤重为0.4260.306，4E2治疗组的平均瘤重为0.4660.266，9C10和4E2对肿瘤瘤重的抑制率分别为49.4%和47.9%，其P值均小于0.05，有显著统计学意义。表明这2株抗体在体内均能显著抑制人肺癌的生长，见图4。 3 讨论 近年来，靶向肿瘤细胞功能基因/蛋白靶标的治疗策略越来

16、越受到人们的重视，并且取得了较大的 A.9C10单克隆抗体抑制GLC82细胞的增殖;B.4E2单克隆抗体抑制GLC82细胞对Matrigel的侵袭;C.12F7单克隆抗体抑制GLC82细胞对I型胶原黏附(200) 各实验组和对照组的瘤重 进展。如赫赛汀（抗HER2人源化单抗）治疗乳癌4、美罗华（抗CD20人源化单抗）治疗淋巴瘤5、格列卫（酪氨酸激酶抑制剂）治疗慢性粒细胞白血病、胃肠道间质瘤6、阿瓦斯汀（抗VEGF人源化抗体）治疗大肠癌7。 通过建立大容量的单抗库筛选获得肿瘤相关的功能基因和靶点已经被证明是一条可行且高效的技术路线，并越来越受到关注。2004年，Eustace等报道了通过这一方法

17、获得了3个肿瘤转移相关的功能性基因8。另外，该技术还被报道成功地筛选鉴定了肺内皮膜蛋白相关功能性基因和食管癌内皮膜蛋白相关功能基因9,10。 为了建立抗肺癌的大容量功能性单抗库，本研究从肺癌（鳞癌和腺癌）新鲜组织标本中分离单个肿瘤细胞，免疫Bal b/c小鼠。用免疫血清直接进行肺癌细胞增殖的功能实验，发现免疫血清稀释11 000 时仍能显著抑制肺癌细胞GLC82的增殖；而正常鼠血清在150时也不能抑制肺癌细胞GLC82的增殖，表明免疫血清中含有能抑制肺癌细胞恶性生物学行为的功能性抗体。因此，我们制备的大容量单抗库将可能含有能够抑制肺癌的功能性单抗。 为了得到大容量单抗库，本文改良了传统的单克隆

18、抗体制备方法，建立和完善了高通量制备和筛选阳性单抗的技术方法，最终获得了库容为1573个克隆的单抗库。采用活细胞免疫荧光实验和免疫组化法检测这些阳性克隆与人正常肺组织切片的反应，获得了154株能较特异与肺癌细胞反应而不与正常肺组织反应的克隆。功能性的筛选发现了能显著抑制肺癌细胞增殖、侵袭、黏附的功能性抗体。这些研究结果表明本文建立和优化的高通量制备抗肿瘤的功能性单克隆抗体库的方法不仅可以获得大量抗肿瘤细胞膜蛋白的单抗，还能获得抑制肿瘤细胞各种恶性生物学行为的功能性抗体。 在临床上使用的靶向药物中，抗Her2 的抗体类药物赫赛汀能够通过抑制乳腺癌细胞的增殖而明显的抑制乳腺癌患者的肺转移等11。肿

19、瘤细胞的转移取决于其侵袭能力的强弱，因此抑制肿瘤细胞的侵袭将能够抑制其转移。抑制肿瘤细胞的侵袭能力也能够抑制肿瘤原发瘤的生长12，这可能是由于原发瘤的生长也需要瘤灶边缘的细胞不断向周围侵袭的缘故。我们在能显著抑制肺癌增殖和侵袭的功能性单抗中分别选择了抑制作用最强的单抗9C10和4E2进行了体内抑瘤实验。结果两株单抗均能显著抑制GLC82细胞移植瘤的生长，表明两株单抗均有作为抑制肺癌生长和转移单抗治疗剂的潜力。【参考文献】 1 Pirozynski M. 100 years of lung cancerJ. Respir Med，2006, 100(12):20732084.2 Molina J

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